技术领域
本发明提供在被孢霉(Mortierella)属微生物细胞内显示高表达活性的启动 子、含有该启动子的载体、导入了该启动子的非人转化体以及使用该启动子或转化体的蛋 白质、脂质或脂肪酸的制造方法。
背景技术
一直以来开发并实用化了通过微生物代谢来生产有用化合物的技术(广义的 发酵技术)。例如，高山被孢霉(Mortierellaalpina)等被孢霉属的菌类，是已知的生产以 花生四烯酸为主的高度不饱和脂肪酸(PUFA)且在工业上特别有用的菌类(专利文献1)。
在利用这种菌类方面，已做了育种工作，即把有用生物的遗传性改良为更理想的特性 (进行品种改良)。尤其在发酵技术中，从提高由微生物生产有用化合物的生产效率以及 降低该化合物的制造成本等的观点出发，育种已变得非常重要。
为了培育具有更优选特性的有用生物，已利用了介由转化的方法。这种情况下，为了 获得目标性状，将编码必需蛋白质的DNA片段导入到想要培育的有用生物(宿主)中， 以使其在适当的基因启动子的控制下进行表达，从而获得转化体集团。此后，从中筛选理 想的品种(菌株)。此时，适应于成为宿主的生物种且适应于想要改变的特性的恰当的基 因启动子是必需的。
关于属于被孢霉属的菌类的丝状菌的转化方法，已有多种技术被报导。另外，已获得 了多种与被孢霉属菌类的脂质生产能力相关且参与脂质合成系统的酶基因。然而，针对用 于将这些有用的酶基因导入被孢霉属内，并使之以高水平表达的必需的基因启动子，至今 几乎未报导。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本国特开昭63-044891公报
发明内容
在如上所述的状况下，寻求高效地生产有用脂质的菌株的育种，为此，适于 被孢霉属的菌类的基因启动子必不可少。
本发明者不断深入研究的结果，成功克隆了在高山被孢霉(M.alpina)中高 表达的基因的启动子，从而完成了本发明。即本发明提供以下多核苷酸、表达载体、转化 体、使用该多核苷酸以及转化体的蛋白质、脂质或脂肪酸的制造方法。
具体而言，本发明如下。
[1]一种多核苷酸，其特征在于，是选自以下(a)～(c)中的任意一项所述的多核 苷酸：
(a)多核苷酸，其含有选自序列号1～28中的任意一个的碱基序列；
(b)多核苷酸，其含有相对于选自序列号1～28中的任意一个的碱基序列有90％以 上的同一性的碱基序列，且在属于被孢霉属的微生物细胞内显示启动子活性；以及
(c)多核苷酸，其为与由选自序列号1～28中的任意一个的碱基序列的互补碱基序列 组成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸，且为在属于被孢霉属的微生物细胞内显示 启动子活性。
[2]根据[1]所述的多核苷酸，其特征在于，所述启动子活性是指在属于被孢霉属的微 生物细胞内表达GUS报告基因时，至少500nmol/(mg·分钟)的GUS蛋白质活性被确认。
[3]根据[1]所述的多核苷酸，其特征在于，含有选自序列号1～28中的任意一个的碱基 序列。
[4]根据[1]或[2]所述的多核苷酸，其特征在于，为DNA。
[5]一种载体，其特征在于，含有[1]～[4]中任一项所述的多核苷酸。
[6]一种非人转化体，其特征在于，导入了[1]～[4]中任意一项所述的多核苷酸。
[7]一种非人转化体，其特征在于，导入了[5]所述的载体。
[8]根据[7]或[8]所述的转化体，其特征在于，所述转化体为脂质生产菌。
[9]根据[8]所述的转化体，其特征在于，所述脂质生产菌为高山被孢霉(Mortierella alpina)。
将本发明的多核苷酸用作启动子时，可使目标基因在属于被孢霉属的微生物 细胞内高效表达。
附图说明
图1是表示用于评价本发明的启动子的载体的例子的图。将HisP序列替换为 本发明的启动子而使用。
图2是表示用各种培养基(灰色柱：GY培养基，白色柱：大豆粉培养基)培养由本 发明的启动子序列转化的转化体时的启动子活性的图。用10ml各培养基在28℃、300rpm 下培养5天。
图3是表示启动子GAL10-2p的活性的图。表示通过半乳糖添加而诱导的启动子活性。
图4是表示启动子PP7p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28℃、 300rpm下培养5天。
图5是表示启动子CIT1p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28℃、 300rpm下培养3天。
图6是表示启动子PP3p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28℃、 300rpm下培养10天。
图7是表示启动子PP6p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28℃、 300rpm下培养5天。
图8是表示启动子HSC82p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28 ℃、300rpm下培养5天。
图9是表示启动子SSA2p及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28℃、 300rpm下培养5天。
图10是表示启动子GAPp及其截短型启动子的活性的图。用10mlGY培养基在28 ℃、300rpm下培养5天。
图11是表示启动子GAL10-2p及其截短型启动子的活性的图。
图12A是表示源自大肠杆菌(E.coli)的GUS基因(CDS序列：序列号29，氨基酸 序列：序列号30)与将源自大肠杆菌的GUS基因的密码子的使用变为被孢霉属的微生物 用的GUSm基因(CDS序列：序列号31，氨基酸序列：序列号32)的比对图。
图12B是图12A的继续。
具体实施方式
以下详细说明本发明。以下的实施方式是用于说明本发明的例示，并不意味 着将本发明仅限于此实施方式。本发明只要不脱离其主旨，可以各种方式实施。
另外，本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报、其它专利文献已作为参照 编入本说明书中。此外，本说明书包含2013年3月27日申请的成为本申请优先权主张的 基础的日本国专利申请(特愿2013-066265号)的说明书及图面中所述的内容。
本说明书中在未特别记载的情况下，碱基序列记载为5’末端在左侧，3’末 端在右侧。
1.启动子
如后述实施例中的详细记载，本发明者首次成功地从作为脂质生产菌的M.alpina中克 隆了多种启动子序列。此外，本发明者也确认了由这些启动子表达的蛋白质显示其生物活 性。
本发明的启动子为PP7p、CIT1p、PP3p、PP2p、PP6ps、HSC82p、SSA2p、GAL10-2p 和/或它们的部分序列(截短型)。这些启动子区序列及其截短型序列示于下表。
以下，将上述表格中所示碱基序列即选自序列号1～28中的任意一个序列统称为“本 发明的启动子序列”。
[表1]
表1
在此，作为在属于被孢霉属的微生物细胞内显示高表达活性的启动子，本发 明提供以下多核苷酸。
选自以下(a)～(c)中任意一项所述的多核苷酸：
(a)多核苷酸，其含有本发明的启动子序列；
(b)多核苷酸，其含有相对于本发明的启动子序列有90％以上同一性的碱基序列， 且在属于被孢霉属的微生物细胞内显示启动子活性；以及
(c)多核苷酸，其为与由本发明的启动子序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨 条件下杂交的多核苷酸，且为在属于被孢霉属的微生物细胞内显示启动子活性的多核苷 酸。
以下，将上述(a)～(c)中记载的多核苷酸称为“本发明的多核苷酸”。
另外，本发明中，“含有”本发明的启动子序列是指“包含”本发明的启动子序列。 因此，本发明的启动子序列以外的附加的序列，例如增强子序列等也可附加在本发明的启 动子序列的上游(5’末端侧)或下游(3’末端侧)。这样的附加的序列可在与本发明的 启动子序列之间介由1～1000bp、1～900bp、1～800bp、1～700bp、1～600bp、1～500 bp、1～400bp、1～300bp、1～200bp、1～100bp、1～75bp、1～50bp、1～25bp、1～ 10bp的碱基序列进行附加，或者也可直接连接到本发明的启动子序列上(即介于本发明 的启动子序列与附加的序列之间的核苷酸残基数为0)。
本说明书中，“多核苷酸”是指DNA或RNA。
本说明书中，“在严谨条件下杂交的多核苷酸”是指，例如将由本发明的启动子序列 的互补碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，采用菌落杂交法、噬菌斑杂交 法或Southern杂交法等得到的多核苷酸。作为杂交的方法，例如，可利用“Sambrook& Russell，MolecularCloning：ALaboratoryManualVol.3，ColdSpringHarbor，Laboratory Press2001”及“Ausubel，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons 1987-1997”等中所记载的方法。
本说明书中，“高严谨条件”例如为(1)5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、 50％甲酰胺、50℃，(2)0.2×SSC、0.1％SDS、60℃，(3)0.2×SSC、0.1％SDS、62 ℃，(4)0.2×SSC、0.1％SDS、65℃，或(5)0.1×SSC、0.1％SDS、65℃的条件，但 不限于此。在这些条件中，越提高温度越能期待高效地得到具有高序列同一性的DNA。但 是，认为作为影响杂交的严谨度的因素，有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、 盐浓度等多种因素，只要是本领域技术人员，即可通过适当选择这些因素来实现同样的严 谨度。
另外，当使用市售的试剂盒进行杂交时，例如可以使用AlkphosDirect LabellingandDetectionSystem(GEHealthcare)。此时，按照试剂盒中附带的操作指南， 与标记的探针孵育过夜后，在55℃的条件下使用含有0.1％(w/v)SDS的最初的洗涤缓冲 液将膜洗涤后，即可检测出杂交的DNA。或基于本发明的启动子序列的互补碱基序列的全 部或一部分制备探针时，使用市售的试剂(例如，PCR标记混合物(罗氏诊断有限公司 (RocheDiagnostics公司))等)将该探针进行地高辛(DIG)标记的情况下，可使用DIG 核酸检测试剂盒(RocheDiagnostics公司)来检测杂交。
作为除上述以外可杂交的多核苷酸，在通过FASTA、BLAST等同源性检索 软件使用默认参数计算时，可列举与本发明的启动子序列有90％以上、91％以上、92％以 上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％ 以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％ 以上或99.9％以上同一性的多核苷酸。
另外，碱基序列的同一性，可以用FASTA(Science227(4693)：1435-1441， (1985))、Karlin-Altschul的算法BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool) (Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268，1990；ProcNatlAcadSciUSA90：5873，1993) 来确定。开发出了基于BLAST算法的被称为blastn、blastx、tblastn和tblastx的程序(Altschul SF，etal：JMolBiol215：403，1990)。使用blastn分析碱基序列时，参数例如为score＝100、 wordlength＝12。使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序的默认参数。
本发明中“启动子活性”，是指在本发明的启动子的下游插入编码蛋白质的 基因序列(以下称“目标基因”)时，可获得该基因的表达产物。
在此，“表达产物”是指作为该基因的转录产物的RNA(例如hnRNA、mRNA、siRNA、 miRNA等)及作为该基因的翻译产物的蛋白质中的任意一者或两者。
目标基因的插入，是通过在自本发明的启动子序列的3’末端开始500bp以 内、400bp以内、300bp以内、200bp以内、100bp以内、50bp以内、30bp以内、10bp以 内的区域定位目标基因的5’末端而进行的。
以确认本发明的启动子序列的活性为目的时，目标基因没有特别限定，但优 选编码已确定活性测定方法的蛋白质的基因。
作为这样的基因的例子，可列举新霉素抗性基因、潮霉素B磷酸转移酶基因 等选择性标记基因，以及LacZ、GFP(GreenFluorescenceProtein)和荧光素酶基因等的表 达报告基因等，但不限于此。
优选为启动子活性的确认通过使用β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因测定 GUS活性来进行。用M.alpina作为宿主时，GUS基因优选为密码子使用频率与M.alpina 一致的GUSm基因。
GUS活性可通过下述方法进行测定：在属于被孢霉属的微生物细胞内用本发明的启动 子序列表达GUS基因，使从前述细胞回收的GUS蛋白质与对硝基苯-β-D葡糖醛酸苷反 应，然后经时测定反应体系的波长405nm的吸光度，并将该测定值应用于以下公式。
GUS活性(nmol/(mg·min))＝
1000×[(各样品中的吸光度的经时变化图表的梯度值)/(标准曲线图表的梯度值)] /[(样品的蛋白质浓度)/5]
GUS基因通常使用源自大肠杆菌(E.coli)的GUS基因(CDS序列：序列 号29，氨基酸序列：序列号30)，但在属于被孢霉属的微生物细胞内用本发明的启动子 序列表达GUS基因时，也可使用将源自大肠杆菌的GUS基因的密码子的使用变为被孢霉 属的微生物用的GUSm基因(CDS序列：序列号31，氨基酸序列：序列号32)。
关于密码子使用的改变的例子，可参照图12A及图12B所示的GUSm与GUS比对。
本发明中的启动子活性，优选通过上述方法在属于被孢霉属的微生物细胞 内表达GUS报告基因时，至少获得500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、 1800、2000nmol/(mg·min)的GUS蛋白质活性。
关于将基因导入宿主细胞的方法，如后所述。
上述本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程的方法或公知的合成方法获 得。
2.载体及转化体
本发明还在其他实施方式中提供含有本发明的多核苷酸的表达载体(以下称“本发明 的载体”)。
本发明的载体通常如下构成，其含有
(i)本发明的启动子；及
(ii)将与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化有关且将在宿主细胞内起作用的信号作 为构成要素而含有的表达盒。
如此构建的载体被导入宿主细胞。作为本发明中所使用的适合的宿主细胞的例子，可 列举脂质生产菌、酵母等。
作为脂质生产菌，例如可使用在MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2， pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体而言，可列举属于被孢霉属(Mortierella)的微生 物，例如，属于长孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierellaexigua) IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierellahygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierellaalpina) IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、 CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的被孢霉亚 属(subgenusMortierella)的微生物或属于深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)CBS194.28、 IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、 CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea) CBS236.82等的Micromucor亚属(subgenusMicromucor)的微生物等。尤其优选高山被孢 霉(Mortierellaalpina)。
这样的载体例如可通过将pDura5(Appl.Microbiol.Biotechnol.，65， 419-425，(2004))、pBIG35(Appl.Environ.Microbiol.，(2009)，vol.75，p.5529-5535)、 pD4(Appl.Environ.Microbiol.,November2000，66(11)，p.4655-4661)、pDZeo(J.Biosci. Bioeng.，December2005，100(6)，p.617-622)、pDX载体(Curr.Genet.，2009，55(3)， p.349-356)、pBIG3ura5(Appl.Environ.Microbiol.，2009，75，p.5529-5535)等现有的表 达载体作为基础，并将这些载体的启动子区替换为本发明的启动子序列来制备，但成为基 础的表达载体不限于此。
宿主细胞转化时，为了确认载体是否已导入，也可利用选择标记。作为选 择标记可利用营养缺陷型标记(ura5、niaD、trp1)、抗药性标记(潮霉素、博来霉素(Zeocin))、 遗传霉素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUP1)(Marinetal.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(分别参 考猪腰淳嗣等，生化学，64，660，1992；Hussainetal.，gene，101，149，1991)等。
作为营养缺陷型标记的例子，可列举以下(1)～(15)，但不限于此。
(1)蛋氨酸缺陷型标记：met1、met2、met3、met4、met5、met6、met7、met8、met10、 met13、met14、met20；
(2)酪氨酸缺陷型标记：tyr1、异亮氨酸；
(3)缬氨酸缺陷型标记：ilv1、ilv2、ilv3、ilv5；
(4)苯丙氨酸缺陷型标记：pha2；
(5)谷氨酸缺陷型标记：GLU3；
(6)苏氨酸缺陷型标记：thr1、thr4；
(7)天冬酰胺酸缺陷型标记：asp1、asp5；
(8)丝氨酸缺陷型标记：ser1、ser2；
(9)精氨酸缺陷型标记：arg1、arg3、arg4、arg5、arg8、arg9、arg80、arg81、arg82、 arg84；
(10)尿嘧啶缺陷型标记：ura1、ura2、ura3、ura4、ura5、ura6；
(11)腺嘌呤缺陷型标记：ade1、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、ade12、 ADE15；
(12)赖氨酸缺陷型标记：lys1、lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、lys11、lys13、lys14；
(13)色氨酸缺陷型标记：trp1、trp2、trp3、trp4、trp5；
(14)亮氨酸缺陷型标记：leu1、leu2、leu3、leu4、leu5；
(15)组氨酸缺陷型标记：his1、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8
作为抗药性标记的例子，可列举潮霉素(HygromycinB)抗性基因、博莱霉 素t(pleomycin)抗性基因(Transformationoffilamentousfungibasedonhygromycinband phleomycinresistancemarkersMethodsinEnzymology，Volume216，1992，Pages447-457 PeterJ.Punt，CeesA.M.J.J.vandenHondel)、双丙氨磷(Bialophos)抗性基因(Avalos， J.，Geever，R.F.，andCase，M.E.1989.Bialaphosresistanceasadominantselectablemarker inNeurosporacrassa.Curr.Genet.16：369-372.)、磺酰脲(Sulfonylurea)抗性基因(Zhang， S.，Fan，Y.，Xia，Y.X.，andKeyhani，N.O.(2010)Sulfonylurearesistanceasanewselectable markerfortheentomopathogenicfungusBeauveriabassiana.ApplMicrobiolBiotechnol87： 1151-1156.)、苯菌灵(Benomyl)抗性基因(Koenraadt，H.，S.C.Sommerville，andA.L. Jones.1992.Characterizationofmutationsinthebeta-tubulingeneofbenomyl-resistantfield strainsofVenturiainaequalisandotherpathogenicfungi.Mol.PlantPathol.82：1348-1354.)、 乙酰胺发酵基因(Acetamidase，AmdS)(Kelly，J.M.andHynes，M.J.(1985).Transformation ofAspergillusnigerbythEamdsgeneofAspergiilusnidulans.EMBOJ.4，475-479.)等，但 不限于此。
作为宿主细胞的转化方法，可以利用常用的公知方法。例如为脂质生产菌时， 可以利用电穿孔法(MackenxieD.A.etal.Appl.Environ.Microbiol.，66，4655-4661，2000)、 粒子轰击法(ParticleDelivery)(日本国特开2005-287403《脂质生产菌的育种方法》(日 语原名「脂質生産菌の育種方法」)中所述的方法)或农杆菌法，但不限于此。
其他，有关通常的克隆技术，可以参照“Sambrook&Russell，Molecular Cloning：ALaboratoryManualVol.3，ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“Methods inYeastGenetics、Alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpring Harbor，NY)”等。
3.蛋白质、脂质或脂肪酸的制造方法
本发明还在其他实施方式中提供使用上述转化体的蛋白质、脂质或脂肪酸的制造方 法。
在导入了本发明的启动子的非人转化体(以下称“本发明的转化体”)中，特别是将 属于被孢霉属的微生物作为宿主细胞而制备的转化体中，目标基因进行高表达。因此，应 用本发明的转化体时，可高效地生成目标蛋白质。
例如，通过将目标基因竞争性地导入本发明的载体中，并培养用该载体转 化的转化体，可在转化体细胞内由目标基因表达目标蛋白质。
表达的目标蛋白质，例如可从转化体中制备细胞溶解物，再根据公知方法从该溶解物 中回收。有关目标蛋白质回收的详细内容，可参照“Sambrook&Russell，MolecularCloning： ALaboratoryManualVol.3，ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“MethodsinYeast Genetics、Alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor， NY)”等。
目标基因没有特别限定，但优选编码脂质合成酶的基因(以下称“脂质合 成基因”)，例如可列举编码酰基辅酶A合成酶、甘油-3-磷酸酰基转移酶、二酰甘油酰基 转移酶、脂肪酸链延长酶、Δ9脂肪酸去饱和化酶基因、Δ12脂肪酸去饱和化酶基因、Δ 6脂肪酸去饱和化酶基因、Δ5脂肪酸去饱和化酶基因、Δ4脂肪酸去饱和化酶基因、ω3 脂肪酸去饱和化酶基因、溶血磷脂酰基转移酶基因、磷脂酸脱磷酸化酶基因、脂肪酸合成 酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、ATP-柠檬酸裂解酶基因的基因。
具有脂质合成能力的细胞、例如以脂质生产菌等作为宿主来表达脂质合成 基因时，因为由该基因表达的脂质合成酶合成脂质和/或脂肪酸，所以可对其进行回收。因 此，通过培养本发明的转化体，可高效地制造脂质和/或脂肪酸。
脂质或脂肪酸，可以从根据本发明进行了转化的细胞中按以下操作来提取。 对于生物(例如脂质生产菌或酵母)的转化株，培养结束后，可以按照离心分离法、过滤 等常规方法得到培养细胞。将细胞充分水洗，优选进行干燥。干燥可以通过冷冻干燥、风 干等来进行。将干燥细胞根据需要采用DynoMill或超声波等破碎后，优选在氮气流下使 用有机溶剂进行提取处理。作为有机溶剂，可以使用醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯 甲烷、石油醚等，或者通过甲醇和石油醚的交替提取或使用了氯仿-甲醇-水的单相溶剂的 提取，也能得到良好的结果。通过在减压下从提取物中馏去有机溶剂，可以得到含有脂肪 酸的脂质。提取的脂肪酸也可以采用盐酸甲醇法等进行甲酯化。
进而，从上述含有脂肪酸的脂质中分离脂肪酸，可以在混合脂肪酸或混合 脂肪酸酯的状态下，通过常用方法(例如尿素附加法、冷却分离法、柱色谱法等)浓缩分 离来进行。
实施例
以下用实施例来更具体地说明本发明，但本发明的范围并不限于这些实施 例。
高山被孢霉的基因组分析
将M.alpina1S-4株接种到100ml的GY2:1培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏pH6.0)中， 在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。
使用Roche454GSFLXStandard确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段库的 碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到 的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群(SuperContig)。
表达分析
将M.alpina1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中， 在28℃下预培养3天。在10L培养槽(AbleCo.，东京)中加入5L培养基(1.8％葡萄糖、 1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％增稠剂、0.3％KH2PO4、0.1％Na2SO4、0.05％CaCl2·2H2O、 0.05％MgCl2·6H2O、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通 气搅拌培养8天。培养第1、2及3天时，分别添加相当于2％、2％及1.5％的葡萄糖。培 养第1、2、3、6及8天时，回收各阶段的菌体，用盐酸胍/CsCl法制备总RNA。通过SOLiDTMTotalRNA-SeqforWholeTranscriptomeLibraries(美国应用生物系统公司)来合成cDNA， 并用SOLiD进行测序。
启动子区的克隆
如下所述进行由表达分析的结果认为在M.alpina1S-4株中表达量多的基因的启动子 区、或半乳糖代谢基因的同源启动子区的克隆。
首先，如下所述进行用于由PCR来扩增各启动子区的引物的设计。另外，在以下所示 的引物碱基序列中，下划线部分示出了限制性酶识别位点。引物设计为在启动子区两端分 别附加XbaI、SpeI识别序列。但是，只有GAL10-2p因序列中存在SpeI识别序列而设计 为在两端都附加XbaI识别序列。引物名称中包含的“F”及“R”分别表示该引物为正向 引物及反向引物。
启动子PP7p
PP7pFXbaIAATATCTAGATGACCGTGCGCTTTTTGAGAC(序列号33)
PP7pRSpeIAGCAACTAGTCGTATATTTGTTGAAAGGTG(序列号34)
启动子CIT1p
CIT1pFXbaIATTTTCTAGACACCTCAAAAACGTGCCTTG(序列号35)
CIT1pRSpeIAATAACTAGTGGCGGATATGTGTATGGAG(序列号36)
启动子PP3p
PP3pFXbaIAACGTCTAGACGTGTTATCTTGCGCTGC(序列号37)
PP3pRSpeITCATACTAGTGATGATTTAGAGGTGTTGG(序列号38)
启动子PP2p
PP2pFXbaIAAGCTCTAGAGACTGTAAAGACGGAGGGG(序列号39)
PP2pRSpeIAGTAACTAGTTGTGGATAGTGGGTAGTGG(序列号40)
启动子PP6ps
PP6psFXbaIAAAGTCTAGACTGGCAATAGTTAGTGCACG(序列号41)
PP6psRSpeIATCAACTAGTGATGGAGGTTTGTTTGAGAAG(序列号42)
启动子HSC82p
HSC82pFXbaIATCATCTAGAGAGCTCAAGATGAAGGTGCTC(序列号43)
HSC82pRSpeIAATAACTAGTGGTGTGTGTGGTTTGCGGG(序列号44)
启动子SSA2p
SSA2pFXbaITTAGTCTAGAAAAGTGCTGCTTCGGAACC(序列号45)
SSA2pRSpeIAGATACTAGTGATGTAGATGTGAGTGTGAG(序列号46)
启动子GAL10-2p
GAL10-2pFXbaIAATATCTAGAGGTTCCGAGAGGTGGATTTG(序列号47)
GAL10-2pRXbaIATAATCTAGATGGCTCCTGAAAGGACGAG(序列号48)
将Mortierellaalpina1S-4株的基因组作为模板用PCR克隆各启动子区。聚合酶使用 PrimeSTARGXL(TaKaRa)。
启动子评价用载体的构建
将以下基因用作报告基因：将源自大肠杆菌的GUS基因(序列号29)的密码子的使 用变为被孢霉属的微生物用的GUSm基因(序列号31)(图12A及图12B)。
将GUSm连接于含有恒常表达启动子即组蛋白启动子(HisP)的质粒pBIG35(Appl. Environ.Microbiol.，(2009)，vol.75，p.5529-5535)中，从而构建表达盒。进而将该表达 盒与尿嘧啶缺陷型标记基因(ura5)串联连接，从而构建转化用双元载体pBIG35ZhGUSm (图1)。另外，载体中使用的GUSm基因是使密码子使用频率与M.alpina一致的人工合 成的β-D-葡萄糖苷酸酶基因。Ura5为M.alpina的乳清酸磷酸核糖转移酶基因。HisP为 M.alpina的组蛋白H4.1基因的启动子。SdhBt为M.alpina的琥珀酸脱氢酶基因的终止子。 ColE1ori为复制起点，NPTII为卡那霉素抗性基因，TrfA为质粒扩增所需的基因，Leftborder 和Rightborder为用于基因转移的重复序列。
用限制性酶XbaI和SpeI或XbaI切取如上所述进行克隆的启动子区，并取代HisP将 其插入到XbaI、SpeI酶切的载体pBIG35ZhGUSm上。
高山被孢霉的转化
根据专利文献(WO2005/019437)记载的方法，将由M.alpina1S-4株诱导的尿嘧啶缺 陷型株Δura-3用含0.05mg/mL尿嘧啶的Czapek-Dox琼脂培养基(3％蔗糖、0.2％NaNO3、 0.1％KH2PO4、0.05％KC1、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％FeSO4·7H2O、2％琼脂、pH6.0) 培养，并收集得到的培养物，通过用Miracloth(Calbiochem)过滤来制备M.alpinaΔura-3 的孢子悬浮液。在农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensC58C1)内用电穿孔法转化已制备的 各启动子评价用载体，然后用LB-Mg琼脂培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母膏、85mMNaCl、 0.5mMMgSO4·7H2O、0.5mMNaOH、1.5％琼脂、pH7.0)，在28℃下培养48小时。用 PCR法确认含有该载体的农杆菌。将含有该载体的农杆菌用100mLMM培养基(10mM K2HPO4、10mMKH2PO4、2.5mMNaCl、2mMMgSO4·7H2O、0.7mMCaCl2、9μMFeSO4· 7H2O、4mM(NH4)2SO4、10mM葡萄糖、pH7.0)在28℃、120rpm下振荡培养2天， 并用5800×g离心分离，然后添加新鮮的IM培养基(在MM培养基中添加0.5％甘油、200μM 乙酰丁香酮、40mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，制备为pH5.3)从而制备悬浮液。 将该悬浮液在28℃、300rpm下振荡培养8～12小时，直至变为OD660＝0.4-3.7。将100μL 该菌悬液与等量的前述M.alpinaΔura-3悬浮液(108mL-1)混合，并涂布于放有硝酸纤维 素膜(直径70mm；hardenedlow-ashgrade50、Whatman)的共培养培养基(与IM培养 基组成相同，但代替10mM葡萄糖而含有5mM葡萄糖及1.5％琼脂)上，在23℃下培养 2-5天。共培养后，将该膜转移到无尿嘧啶、含有0.03％NileblueA(Sigma)的SC琼脂 培养基(5.0gYeastNitrogenBasew/oAminoAcidsandAmmoniumSulfate(Difco)、1.7g (NH4)2SO4、20g葡萄糖、20mg腺嘌呤、30mg酪氨酸、1.0mg蛋氨酸、2.0mg精氨酸、 2.0mg组氨酸、4.0mg赖氨酸、4.0mg色氨酸、5.0mg苏氨酸、6.0mg异亮氨酸、6.0mg 亮氨酸、6.0mg苯丙氨酸、琼脂20g/L)上，在28℃下培养5天。将可辨认的源自真菌菌 落的菌丝，转移到无尿嘧啶SC培养基上。通过进行2次转移到新鲜无尿嘧啶SC培养基上 的操作，来筛选稳定保持性状的转化体。
高表达启动子的筛选
菌株的培养及回收
用GY琼脂培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏、1.5％琼脂)在28℃下培养2天。培 养结束后将菌体与琼脂一起刮取进行回收。
来自菌体的蛋白质的提取
在回收的菌体中添加500μL破碎缓冲液(100mMTris-HCl(PH8.0)、5mM2-巯基乙 醇)，用使用0.1mm直径玻璃珠的TOMY制BeadsShocker在5000rpm、30sec下破碎2 次。以8000×g离心10min，再将回收的上清以20400×g离心10min，并作为蛋白质溶液 回收上清。测定蛋白质浓度，并根据需要用破碎缓冲液稀释为任意浓度。以上操作均在冰 上进行。
GUS活性测定
将基质(对硝基苯-β-D-葡糖醛酸苷)以终浓度为1.25mM溶解于检测用缓冲液(21.7 mMNaH2PO4、33.9mMNa2HPO4、1.11mMEDTA(pH8.0))。将160μL该基质溶液与40μL 蛋白质样品在96孔微孔板上混合，在37℃下经时测定405nm处的吸光度。测定0.05、0.1、 0.2、0.5mM对硝基苯酚的吸光度，从而制成标准曲线，并根据以下计算式计算各样品的 GUS活性值。
GUS活性(nmol/(mg·min))＝
1000×[(各样品中的吸光度经时变化图表的梯度值)/(标准曲线图表的梯度 值)]/[(样品的蛋白质浓度)/5]
将1mg/mL的蛋白质1分钟内使对硝基苯-β-D-葡糖醛酸苷转化为对硝基苯 酚的量(nmol)设为1个单元。
GUS活性评价用菌株的筛选
将筛选的30株各启动子评价用稳定转化株，如上所述用GY琼脂培养基培养，并测定 GUS活性。在30株中筛选出显示中等程度的GUS活性的10株。
启动子活性的评价
将筛选出的菌株用10mlGY液体培养基或10ml大豆粉培养基在28℃、300rpm下振 荡培养5天。培养结束后，通过过滤回收菌体，并测定GUS活性。将其平均值作为该启 动子的活性进行评价。其结果示于图2。
在GY培养基和/或大豆粉培养基中，评价的启动子与已知的源自被孢霉属的启动子即 HisP或GAPp相比，启动子活性更高。
培养时间与各启动子活性的研究
为了研究由培养时间引起的启动子活性的变化，将针对各启动子筛选的菌株用10ml GY液体培养基，在28℃下振荡培养2天、5天、7天、14天。培养结束后，通过过滤回 收菌体，并测定GUS活性。结果示于表2。
[表2]
表2培养天数与各启动子的活性
诱导型启动子的评价
启动子GAL10-2p的评价如下所述进行。
首先，将30株稳定转化株用SC+gal琼脂培养基(代替2％葡萄糖而含有2％半乳糖 的SC琼脂培养基)，在28℃下培养3天，根据以上所述测定GUS活性，筛选出10株显示 中等程度GUS活性的菌株。再接种于GY液体培养基，在第4天或第7天以变为2％的形 式添加半乳糖。培养条件设为28℃、300rpm。自培养开始第2天至第14天的GUS活性 示于图3。启动子GAL10-2p通过半乳糖的添加而被诱导表达。
启动子活性的必需区域的研究
为了研究各启动子的启动子活性的必需区域，制备将各启动子的上游区域进行酶切了 的DNA片段，并评价启动子活性。
为了得到DNA片段，针对各启动子制备以下引物。另外，下划线部分为限制性酶识 别位点。
PP7p
启动子PP7p-D1000扩增用引物
PP7pD1000FXbaIAGCATCTAGAAAAACTATTCAATAATGGGCG(序列号49)
启动子PP7p-D750扩增用引物
PP7pD750FXbaIATTTCTAGAATGGCGAGACGCAGGGGGTAG(序列号50)
启动子PP7p-D500扩增用引物
PP7pD500FXbaIAATATCTAGAGAGTGGGCACTGAACTAAAAAG(序列号51)
启动子PP7p-D250扩增用引物
PP7pD250FXbaIAATATCTAGAGACACTGCATGACGCGAAATC(序列号52)
CIT1p
启动子CIT1p-D1300扩增用引物
CIT1pD1300FXbaIAAGTCTAGATGTCAATCATCTTTGCTGCTG(序列号53) 启动子CIT1p-D1000扩增用引物
CIT1pD1000FXbaITGCGTCTAGAATTATAATTATAATGAGGAAGTG(序列号54) 启动子CIT1p-D700扩增用引物
CIT1pD700FXbaITTATCTAGAGGCGAGTGGCGGACTGC(序列号55)
启动子CIT1p-D400扩增用引物
CIT1pD400FXbaITTGTCTAGACAATTGGCAAGGCTGGGTTG(序列号56)
PP3p
启动子PP3p-D1600扩增用引物
PP3pD1600RXbaIAATATCTAGAGATCCTGGTCGAAAAAGACAG(序列号57)
启动子PP3p-D1200扩增用引物
PP3pD1200RXbaIAATGTCTAGATGAGTTTCTGTTTTTTCCTTTTTGC(序列号58)
启动子PP3p-D800扩增用引物
PP3pD800RXbaIAATATCTAGATGAACAATTCATGCAGCTTCACG(序列号59)
启动子PP3p-D400扩增用引物
PP3pD400RXbaIAATATCTAGACGTCTAAGCGTTTACGTGCC(序列号60)
启动子PP3p-D200扩增用引物
PP3pD200RXbaIAATATCTAGACTCGTTTTGATGGAGTTCTC(序列号61)
PP2p
启动子PP2p-D1200扩增用引物
PP2pD1200FXbaIATTTCTAGATGCATTTACAGGTGAATATTAC(序列号62)
启动子PP2p-D800扩增用引物
PP2pD800FXbaITTATCTAGACATAAAAGTGTCTGGAGCG(序列号63)
启动子PP2p-D400扩增用引物
PP2pD400FXbaITTATCTAGAACTAAGTGGTGTCTACTTTGG(序列号64)
启动子PP2p-D200扩增用引物
PP2pD200FXbaIAATTCTAGAGGATACTCCATCCCCACCC(序列号65)
启动子PP6ps扩增用引物
PP6ps-D1000
PP6psD1000FXbaIAATTCTAGACAGTTACCGTGCGCCCACTG(序列号66)
启动子PP6ps-D750扩增用引物
PP6psD750FXbaIAATTCTAGACTTTCACAAATAGGCATCCTATC(序列号67)
启动子PP6ps-D500扩增用引物
PP6psD500FXbaIAATTCTAGAGGCTTTTTCGTTTATTGGATTG(序列号68)
启动子PP6ps-D100扩增用引物
PP6psD100FXbaIACGTCTAGATATCCAATTCTCACCACTTC(序列号69)
HSC82p
启动子HSC82p-D800扩增用引物
HSC82pD800FXbaIAATTCTAGATTTTACTACCGCATTCCCTTTTC(序列号70)
启动子HSC82p-D600扩增用引物
HSC82pD600FXbaIACGTCTAGACCTTTTCAGTAAACAATTTC(序列号71)
启动子HSC82p-D400扩增用引物
HSC82pD400FXbaIATTTCTAGACACAAAGAAGAAGGGTGTGTC(序列号72)
启动子HSC82p-D200扩增用引物
HSC82pD200FXbaIACGTCTAGAACTGTTTTCTTGAAACTTC(序列号73)
SSA2p
启动子SSA2p-D850扩增用引物
SSA2pD850FSpeIAGTAACTAGTTGACGGCGTGTATATGTCAG(序列号74)
启动子SSA2p-D600扩增用引物
SSA2pD600FSpeIAGGTACTAGTCCATTGTATCGATTTCTGAT(序列号75)
启动子SSA2p-D400扩增用引物
SSA2pD400FSpeIAGTAACTAGTGCTATGCGAACGGTTCATTTTG(序列号76)
启动子SSA2p-D200扩增用引物
SSA2pD200FSpeIAGGTACTAGTTTTTTTCTCTCTGGTGTGAACG(序列号77)
GAL10-2p
启动子GAL10-2p-D2000扩增用引物
GAL10-2pD2000FXbaIAATTCTAGACGCAGAGTGATGGTCATTACC(序列号 78)
启动子GAL10-2p-D1600扩增用引物
GAL10-2pD1600FXbaIAATTCTAGACTCTATGGCAAGATTACGAG(序列号79)
启动子GAL10-2p-D1200扩增用引物
GAL10-2pD1200FXbaIAATTCTAGATGCTCGTGAAGAGGGGCAC(序列号80)
启动子GAL10-2p-D800扩增用引物
GAL10-2pD800FXbaIACGTCTAGACATTTTTTGCCGCCAATTCTG(序列号81)
启动子GAL10-2p-D400扩增用引物
GAL10-2pD400FXbaIATTTCTAGACCCCCGCCTATTTTTTTTTTC(序列号82)
为了制备各启动子的截短型启动子，以之前制备的各启动子的评价用载体作 为模板，使用上述引物和对应于实施例中使用的各启动子的3′侧的反向引物(PP7pRSpeI、 CIT1pRSpeI、PP3pRSpeI、PP2pRSpeI、PP6psRSpeI、HSC82pRSpeI、SSA2pRSpeI、 GAL10-2pRXbaI)进行PCR。将所得的DNA片段用限制性酶XbaI和SpeI或XbaI切取， 并插入到启动子评价用载体中。
与“高山被孢霉的转化”项中所记载的方法同样地转化M.alpina，并筛选稳定转化株。 与实施例同样进行GUS活性测定。另外，培养天数根据各启动子的特性设为3天(CIT1p)、 5天(PP7p、PP6p、HSC82p、SSA2p、GAPp)或10天(PP3p)。结果示于图4～10。
半乳糖诱导性的启动子，用SC+gal琼脂培养基(代替2％葡萄糖而含有2％ 半乳糖的SC琼脂培养基)，在28℃下培养3天，或用SC+raf培养基(代替2％葡萄糖而 含有2％棉籽糖的SC液体培养基)，在28℃、300rpm下预培养4天，之后以终浓度为2％ 的形式添加半乳糖，再培养1天，进而测定菌体的GUS活性。结果示于图11。
如图4～11所示，确认了示于上述表1中的完全长启动子及截短型启动子都 表现了500nmol/(mg·分钟)以上的GUS蛋白质活性。
产业上的可利用性
根据本发明，可使目标基因在脂质生产菌内高表达，由此，可高效合成、回收目 标蛋白质、脂质及脂肪酸。
序列表自由内容
序列号31～82：合成DNA