技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有持续抗肿瘤活性的CTL细胞制剂、其制备方法及应用。
背景技术
肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的一种新的治疗模式，与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗能够激活或诱导肿瘤患者建立对肿瘤抗原的特异性细胞免疫应答，清除原发的肿瘤细胞，通过建立免疫记忆，防止肿瘤的复发和转移。
在肿瘤免疫治疗过程中，CD8+细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTLymphocyte,CTL）是抗肿瘤免疫治疗的主要效应细胞，CD8+CTL需要通过MHC-I类分子介导的细胞免疫应答过程而被激活。
抗肿瘤免疫反应是先由抗原提呈细胞（APC）摄取肿瘤抗原后，经APC细胞处理后以MHC/表位复合物的形式提呈至APC的表面，该复合物能被T细胞表面的T细胞受体（TCR）识别，形成激活T细胞的第一信号；同时T细胞和APC细胞表面表达的多对共刺激分子相互作用产生了T细胞活化的第二信号。其中免疫调节蛋白吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）、细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡配体1（PD-L1）在抗肿瘤免疫反应的免疫抑制和耐受性诱导中发挥重要作用。目前在肿瘤治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因此，通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的肿瘤免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。其中PD-1和它的配体PD-L1是T细胞活化过程中一对重要的负性共刺激分子，在诱导T细胞凋亡和免疫耐受维持方面起着非常重要的作用，介导了肿瘤免疫耐受和逃逸。
PD-1/PD-L1作为B7/CD28家族成员，已经被证实通过抑制T细胞的活化和增殖负调控免疫应答，并在调节免疫耐受和肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因而通过PD-L1信号转导的拮抗，包括阻断PD-L1与PD-1、B7任一或两者的相互作用，从而阻止PD-L1发送负性共刺激信号到T细胞及其他抗原递呈细胞，可增强对急慢性感染应答的免疫效应和肿瘤免疫，因而可用于治疗各类恶性肿瘤、传染病及急慢性炎症的方法。
目前PD-L1信号转导的抑制已经被提出作为增强T细胞介导的抗肿瘤免疫和急慢性感染的方法，然而目前最佳治疗制剂尚未商业化，难以满足存在目前的临床需求。
发明内容
本发明涉及预防和治疗临床包括恶性肿瘤、自身免疫性疾病和传染病在内的各类与T细胞免疫功能失调相关的病症。具体而言，本发明提供了一种具有持续抗肿瘤活性的CTL细胞制剂、其制备方法，以及其与靶向PD-L1多肽片段联合用于治疗各类与T细胞免疫功能失调相关的病症的应用。本发明具有持续抗肿瘤活性的CTL细胞制剂与靶向PD-L1多肽片段联合应用，增强CIK细胞持续抗肿瘤活性，可用于增强T细胞的功能，上调细胞介导的免疫应答。
本发明提供了一种具有持续抗肿瘤活性的CTL细胞制剂的制备方法，通过该方法制备的CTL细胞或细胞制剂，以及该CTL细胞或细胞制剂联合靶向PD-L1多肽片段在制备持续抗肿瘤活性药物或生物制剂或试剂盒的应用。
本发明所引述的文献如下，下述文献通过引用结合到本专利申请中。专利文献1：公开号：CN104086627A。
通过本领域公知的方法，例如多肽固相合成法，或者通过多肽合成仪，或者参照CN104086627A公开的方法，可以制备PD-L1多肽片段。
本发明肿瘤特异性CTL细胞是通过下面的方法制备的：
（1）用RPMI-1640培养液培养分离的外周血单个核细胞（PBMC），收集非贴壁细胞，并加入γ-干扰素（IFN-γ）培养，然后移入经CD3McAb包被过的培养瓶中，加入rhIL-2继续培养。
（2）在PBMC培养后的贴壁细胞中，加入含rhGM-CSF和rhIL-4的RPMI-1640培养液培养。
（3）将上述培养的树突状细胞DC细胞负载鼠源结肠癌（MCA-38）细胞抗原。加入TNF-α。收获树突状细胞DC后与杀伤性T细胞CIK细胞混合，在RPMI-1640培养基中加入rhGM-CSF和IL-4、IL-2继续培养，收集细胞即得本发明肿瘤特异性CTL效应细胞。
在优选的实施方案中，γ-干扰素加入量是500U/ml-2000U/ml，rhIL-2加入量是500U/ml-2000U/ml。在优选的实施方案中，用浓度为500U/ml-2000U/ml的rhGM-CSF，浓度为50U/ml-2000U/ml的IL-2和浓度为500U/ml-2000U/ml的IL-4刺激加入肿瘤相关全抗原的贴壁培养的DC细胞。
在本发明优选的实施方案中，本发明肿瘤特异性CTL细胞是如下制备的：
（1）将分离出的Balb/c小鼠外周血单个核细胞（PBMC），应用RPMI-1640培养液调细胞浓度为（4-6）X106/ml，置于37℃5%CO2培养箱培养。收集非贴壁细胞，RPMI-1640培养液调细胞浓度为（1-2）X106/ml，并加入500U/ml-2000U/ml的γ-干扰素（IFN-γ）于37℃5%CO2培养箱培养，然后移入经CD3McAb包被过的培养瓶中，加入rhIL-2终浓度为500U/ml-2000U/ml，每1－5天半量换液，同时补足rhIL-2。
（2）PBMC培养后的贴壁细胞中，加入含500U/ml-2000U/mlrhGM-CSF和500U/ml-2000U/mlrhIL-4的RPMI-1640培养液，37℃5%CO2培养箱培养。每1-5天半量换液，同时补足等量上述的rhGM-CSF和rhIL-4。
（3）将上述培养的DC细胞负载鼠源结肠癌（MCA-38）细胞抗原，终浓度为10-100ug/ml。DC培养2-5天后加入TNF-α，终浓度为500U/ml-2000U/ml。收获树突状细胞DC后按1:5-1:20的比例与杀伤性T细胞CIK细胞混合后在RPMI-1640培养基中加入500U/ml-2000U/mlrhGM-CSF和500U/ml-2000U/mlIL-4、500U/ml-2000U/mlIL-2继续培养，每1-5天半量换液，维持细胞浓度为（1-2）X106/ml；培养后收集细胞即得肿瘤特异性CTL效应细胞。
由本发明方法制备得到的肿瘤特异性CTL效应细胞以及含有所述肿瘤特异性CTL效应细胞的整个共培养体系细胞制剂也属于本发明的保护范围。
由本发明方法制备得到的肿瘤特异性CTL效应细胞以及含有所述肿瘤特异性CTL效应细胞的整个共培养体系细胞制剂在制备持续抗肿瘤活性药物或生物制剂产品中的应用也属于本发明的保护范围。
附图说明：
图1是本发明肿瘤特异性CTL效应细胞与PD-L1多肽片段（WSHGGHQHFIRF）联合治疗组小鼠与阴性对照组、多肽治疗组及单纯细胞治疗组对肿瘤生长影响相比较结果。
图2是本发明肿瘤特异性CTL效应细胞与PD-L1多肽片段（WSHGGHQHFIRF）联合细胞治疗组小鼠与阴性对照组、多肽治疗组及单纯细胞治疗组小鼠生存期相比较结果。
具体实施方式：
实施例1、靶向PD-L1多肽片段的制备
通过本领域公知的方法，例如多肽固相合成法，或者通过多肽合成仪，或者参照CN104086627A公开的方法，可以制备PD-L1多肽片段。本发明采用Fomc固相多肽合成法合成靶向PD-L1多肽片段，具体合成步骤如下：
（1）溶胀树脂、加第一个氨基酸；
（2）加第二个氨基酸及后续肽链延伸
（3）多肽切割
（4）RP-HPLC分析和制备纯化多肽
（5）质谱鉴定
委托上海强耀生物科技有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，具体为将待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基与树脂以共价键形式连接，再以该氨基酸的N端作为该条多肽合成的起点，通过与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应而次年改成肽键。将N端的Fmoc-氨基酸的保护基进行脱保护后，将第二个氨基酸的N端与后面氨基酸的羧基进行反应，如此不断重复直至多肽合成完毕。在这一过程中，通过树脂与目的多肽的第一个带保护基的氨基酸进行缩合后，脱掉保护基后加入第二个氨基酸进行缩合，通过重复以上步骤，直到加入最后一个氨基酸，待脱掉其保护基后，利用切割试剂把多肽从树脂上切下后，经过乙醚沉淀、洗涤后收获此肽。将合成的多肽经过质谱分析、纯化，其纯度大于95%，即得到本发明的PD-L1合成肽。ESI-MS质谱分析并确定合成肽的分子量与理论分子量相符合后，-20℃冻存备用。
靶向PD-L1多肽片段合成肽氨基酸序列如下：
该亲和肽（WF-12）特异性结合于PD-L1IgV区，其氨基酸序列为WSHGGHQHFIRF
Trp-Ser-His-Gly-Gly-His-Gln-His-Phe-Ile-Arg-Phe。
实施例2、肿瘤特异性CTL细胞的制备：
（1）将分离出的Balb/c小鼠外周血单个核细胞（PBMC），应用RPMI-1640培养液（购自美国Gibco公司，货号：31800-105）调细胞浓度为5X106/ml，置于37℃5%CO2培养箱培养2h。收集非贴壁细胞，RPMI-1640培养液调细胞浓度为1X106/ml，并加入1000U/ml的γ-干扰素（IFN-γ）于37℃5%CO2培养箱培养，24h后移入经10μg/ml的CD3McAb包被过的培养瓶中，加入rhIL-2终浓度为1000U/ml，每3天半量换液1次，同时补足rhIL-2。
（2）PBMC培养2h后的贴壁细胞中，加入含1000U/mlrhGM-CSF和1000U/mlrhIL-4的RPMI-1640培养液，37℃5%CO2培养箱培养。每3天半量换液，同时补足等量上述的rhGM-CSF和rhIL-4。
（3）将上述培养的DC细胞于第6天负载鼠源结肠癌（MCA-38）细胞抗原，终浓度为50ug/ml。DC培养的第7天加入TNF-α，终浓度为1000U/ml。第9天收获DC后按DC:CIK=1:5的比例与CIK细胞混合后在RPMI-1640培养基中加入1000U/mlrhGM-CSF和1000U/mlIL-4、1000U/mlIL-2继续培养1周，每3天半量换液，维持细胞浓度为1X106/ml；培养1周后收集细胞即得肿瘤特异性CTL效应细胞。
以实施例1制备的PD-L1免疫原性活性多肽片段（polypeptide）联合实施例2制备的肿瘤特异性CTL细胞，进行进一步的荷瘤小鼠体内实验。
实施例3、PD-L1免疫原性活性多肽片段联合肿瘤特异性CTL细胞对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
a)取实施例2培养的肿瘤特异性CTL细胞，用PBS调整细胞浓度为1X106细胞/100ul，共计200ul，用于免疫小鼠。
b)将实施例1制备的PD-L1多肽片段溶于生理盐水中，制成多肽药物，浓度为20mg/ml，-80℃分装保存备用。
c)取鼠源结肠癌（MCA-38）细胞用生理盐水调整细胞浓度至1X107细胞/ml，常规消毒后取100ul细胞悬液（1X106细胞）接种于每只Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下，持续观察肿瘤生长情况。
d)于接种MCA-38细胞9天后，将小鼠按瘤体积分组，每组6只，分别为阴性对照组（NS），PD-L1多肽片段治疗组（polypeptide），本发明肿瘤特异性CTL效应细胞单纯细胞治疗组（CTL）和本发明肿瘤特异性CTL效应细胞与PD-L1多肽片段联合治疗组（polypeptide+CTL）。各组均采用瘤旁皮下注射给药，每只小鼠共治疗三次，间隔一周，其中，多肽治疗组剂量按1mg/kg进行皮下注射；单纯细胞治疗组为皮下注射1X106肿瘤特异性CTL细胞；联合治疗组采取皮下注射1X106肿瘤特异性CTL细胞联和亲和多肽PD-L1多肽片段（剂量1mg/kg）。
实验期间小鼠自由进食和饮水。每日测量小鼠体重及肿瘤的长（a）短(b)径，按照肿瘤体积计算公式计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。
瘤体积=/6ab2
实验结果如图1所示：
从图1可以看出联合治疗组小鼠与阴性对照组、多肽治疗组及单纯细胞治疗组相比较小鼠肿瘤体积明显缩小。
实施例4、生存期实验
选择20只试验用Balb/c小鼠，将鼠源MCA-38细胞用生理盐水调整细胞浓度至1X107细胞/ml，常规消毒后取0.1ml细胞悬液（1X106细胞）接种于每只Balb/c小鼠右前肢腋窝皮下，持续观察肿瘤生长情况。
接种鼠源结肠癌细胞MCA-38后，将小鼠进行分组，每组6只，分别为阴性对照组（NS），PD-L1多肽片段治疗组（polypeptide），本发明肿瘤特异性CTL效应细胞单纯细胞治疗组（CTL）和本发明肿瘤特异性CTL效应细胞与PD-L1多肽片段联合治疗组（polypeptide+CTL）。各组均采用瘤旁皮下注射给药，每只小鼠共治疗三次，间隔一周，剂量同前，观察小鼠生存状况，记录小鼠存活期进行生存率统计。
实验结果如图2所示：
从图2可以看出多肽联合细胞治疗组小鼠与阴性对照组、多肽治疗组及单纯细胞治疗组小鼠相比较生存期显著延长。