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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410097433.3 (22)申请日 2014.03.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104928265 A (43)申请公布日 2015.09.23 (83)生物保藏信息 CCTCC NO:M2014078 2014.03.11 (73)专利权人 江苏阿尔法药业有限公司 地址 223800 江苏省宿迁市生态化工科技 产业园燕山路9号 (72)发明人 陈峻青石利平尹晓龙王清 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅。
2、婷婷徐冬涛 (51)Int.Cl. C12N 9/04(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 17/12(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/865(2006.01) C12R 1/84(2006.01) 审查员 李艳丽 (54)发明名称 一种酮还原酶突变体及其制备和应用 (57)摘要 本发明公开了一种酮还原酶突变体及其制 备和应用。 一种酮还原酶突变体基因， 核苷酸序 列如S。
3、EQIDNO.1所示。 该基因编码的酮还原酶 突变体， 氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。 本发明 通过化学、 分子生物学、 生物信息学及高通量筛 选方法， 开发的酮还原酶突变体具有较高特异性 (对映体过量值99.9%)及较好催化活性， 将其与 甲酸脱氢酶(FDH)及NADH共同使用， 用于不对称 还原2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯 基-3-氧代丙基苯甲酸甲酯以制备(S,E)-甲 基-2-3-3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基苯 基-3-羟基丙基苯甲酸叔丁酯。 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图1页 CN 104928265 B 2018.01.02 CN 。
4、104928265 B 1.一种酮还原酶突变体基因， 其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。 2.权利要求1所述的基因编码的酮还原酶突变体， 其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 3.含有权利要求1所述的酮还原酶突变体基因的重组表达载体。 4.一种生产权利要求2所述的酮还原酶突变体的基因工程菌， 其特征在于所述基因工 程菌中包含权利要求1所述的酮还原酶突变体基因。 5.根据权利要求4所述的基因工程菌， 其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞选自大 肠埃希氏菌 （Escherichia coli） BL21(DE3)、 酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母中的一种。 6.根据权利要求。
5、4所述的基因工程菌， 其特征在于所述基因工程菌的载体系统为pUC19 或者pSE380。 7.一种酮还原酶突变体多肽的制备方法， 其特征在于包括如下步骤： 培养权利要求46 中任一项所述的基因工程菌， 获得酮还原酶突变体多肽。 8.根据权利要求7所述的制备方法， 其特征在于在一定生产罐发酵条件下， 对权利要求 46中任一项所述的基因工程菌进行工业化发酵制备所述的酮还原酶突变体多肽。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中所述生产罐发酵条件是： DO 30%以上， 空气流量1: 1.5 vvm， 葡萄糖残余量1% 以下。 10.权利要求2所述的酮还原酶突变体作为催化剂在不对称还原2-3-3-(2-。
6、(7-氯-2- 喹啉基)乙烯基苯基-3-氧代丙基苯甲酸甲酯中的应用。 11.根据权利要求10所述的应用， 其特征在于， 所述的应用按下述方法进行： 在pH 7.0 的磷酸盐缓冲液中， 在NAD+、 甲酸脱氢酶、 甲酸存在下， 在权利要求2所述的酮还原酶突变体 作用下， 不对称还原2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-3-氧代丙基苯甲酸甲 酯， 制得光学手性醇。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104928265 B 2 一种酮还原酶突变体及其制备和应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一种酮还原酶突变体及其制备和应用。 背景技术 0002 孟鲁司特(Monte。
7、lukast)， 商品名顺尔宁(Singulair)， 化学名为R-(E)-1-1- 3-2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-3-2-(1-羟基-1甲基乙基)苯基丙基硫代甲基 环丙基乙酸钠， 是由默克公司研制开发的一种高选择性半胱氨酞白三烯(Cys-LT)受体拮抗 剂， 它能竞争性拮抗白三烯D4与Cys-LT1受体的结合， 是治疗阿司匹林过敏性哮喘和运动性 哮喘的最优选择。 孟鲁司特不仅可以改善哮喘患者的肺功能， 而且在抗炎、 免疫等诸多方面 也有重要的应用价值， 具有广阔的应用前景。 (S,E)-甲基-2-3-3-(2-(7-氯喹啉基-2-基) 乙烯基苯基-3-羟基丙基苯甲酸叔丁酯(分子式。
8、C28H24NO3Cl， 分子量457.96， CAS号 142569-69-5)， 是合成孟鲁司特钠(顺耳宁Singulair)的关键中间体。 发明内容 0003 本发明的目的之一在于提供一种催化活性高、 对映选择性好的酮还原酶突变体基 因， 及其编码的酮还原酶突变体， 含有该基因的重组表达载体、 基因工程菌及其制备方法， 以及该酮还原酶突变体在催化还原其他酮类底物中的应用。 特别的， 将该酮还原酶突变体 用于不对称还原酮类化合物的生产中。 0004 本发明提供一种酮还原酶突变体基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 或者由 SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列经过取代、 缺。
9、失或者添加一个或者几个核苷酸且具有酮 还原酶活性的由(1)衍生的基因。 0005 本发明提供一种高活性的酮还原酶突变体， 其是(1)由SEQ ID NO.2所示氨基酸序 列组成的蛋白质； (2)或是由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列经过取代、 缺失或者添加一 个或者几个氨基酸且具有酮还原酶活性的由(1)衍生的蛋白质。 0006 本发明的另一目的在于提供一种包含所述的的酮还原酶突变体基因的重组表达 载体。 其可通过本领域常规方法将本发明的酮还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种 载体上构建而成。 所述的载体可为本领域常规的各种载体， 优选pUC19。 0007 本发明的另一目的在于提供一。
10、种包含本发明的重组酮还原酶基因或其重组表达 载体的基因工程菌， 本发明优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。 将前述重组 表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中， 即可得到本发明优选的 基因工程菌。 0008 本发明的另一目的在于提供一种利用该基因工程菌制备酮还原酶突变体的方法， 包括构建该基因工程菌； 筛选得到该基因工程菌； 发酵培养该基因工程菌； 以及收集和制备 酮还原酶突变体。 0009 本发明的另一个目的在于将由基因工程菌生产出的酮还原酶突变体应用到不对 称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇。 说明书 1/4。
11、 页 3 CN 104928265 B 3 0010 根据本发明提供的该基因工程菌的应用， 其中， 底物的结构式为： 0011 0012 有益效果： 0013 本发明通过化学、 分子生物学、 生物信息学及高通量筛选方法， 开发了一个具有较 高特异性(对映体过量值99.9)及较好催化活性的重组酮还原酶， 并将其与甲酸脱氢酶 (FDH)及NADH共同使用， 用于不对称还原2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-3-氧 代丙基苯甲酸甲酯以制备(S,E)-甲基-2-3-3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基苯基-3- 羟基丙基苯甲酸叔丁酯。 甲酸/甲酸脱氢酶是成功的辅酶再生体系， 此反应。
12、产生的副产物 CO2对任何酶的活性均没有影响， 底物甲酸价格低廉， 且很多酶对甲酸有很高的耐受性。 本 发明的反应条件温和： 常温、 常压、 中性或接近中性pH， 设备要求不高， 投入资金相对较少， 且反应转化率高、 对映体选择性高。 附图说明 0014 图1本发明酮还原酶突变体催化不对称还原酮类化合物以制备光学活性手性醇的 反应原理图。 0015 生物材料保藏信息 0016 大肠杆菌BL21(DE3)KRED1306(Escherichia coli BL21(DE3)KRED1306)， 已于 2014年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为中国武汉武汉大学， 保藏号为 CC。
13、TCC NO： M2014078。 具体实施方式 0017 根据本发明一个实施例的重组酮还原酶基因， 其来源于乳酸菌(Lactobacillus sp.Hon2N)， 根据聚合酶链反应扩增(PCR)方法从乳酸菌细胞基因组中得到基因序列， 通过 对其进行突变， 从而获得该重组酮还原酶突变体目的基因， 其基因序列为SEQ ID NO.1。 0018 根据本发明一个实施例的酮还原酶突变体突变体的蛋白序列为SEQ ID NO.2。 0019 根据本发明一个实施例的重组载体， 包括本发明实施例的酮还原酶突变体突变体 基因， 载体为pUC19， 采用乳糖启动子， 诱导剂为IPTG。 0020 根据本发明一。
14、个实施例的生产酮还原酶多肽突变体的基因工程菌具有包括酮还 原酶多肽基因突变体的重组载体。 0021 具体地， 本发明的基因工程菌为保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏 编号为CCTCC NO： M2014078的基因工程菌。 0022 实施例1基因工程菌的建立 0023 通过NCBI查阅酮还原酶基因(NCBI登录号为KC790015)， 人工合成酮还原酶基因片 段， 以该基因片段为模版， 通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加Hind3和EcoRl内切酶片段) 其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。 并利用Hind3和EcoRl内切酶位点将基因插入pUC19质粒 中， 将连接后的。
15、载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因工程菌。 其中PCR扩增酮 说明书 2/4 页 4 CN 104928265 B 4 还原酶基因的引物为： 正向引物F1： ATGGCTCATATTGTAATTTT(SEQ ID NO.4)， 反向引物F2： TTAATTCGGTTTTTTCAGTC(SEQ ID NO.5)。 0024 实施例2酮还原酶突变体基因的获得 0025 本研究利用易错PCR随机突变的方法， 对酮还原酶进行了蛋白质工程改造。 易错 PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时， 通过调整反应条件， 如提高镁离子浓度、 加入 锰离子、 改变体系中四种的dNTPs浓度或。
16、运用低保真度DNA聚合酶等， 来改变扩增过程中的 突变频率， 从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变， 获得蛋白质分子的随机突变体。 0026 本研究采用较低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的 原理， 同时利用Mn2+替代天然辅助因子Mg2+增加易错概率。 0027 50 lPCR反应体系为： 10扩增缓冲液5 l， 4种dNTP混合物各100 mol/L， 引物各 40pmol， 模板DNA0.5 g， Taq DNA聚合酶0.5 ， Mn2+2mmol/L， 加双蒸水至50 l。 0028 PCR反应条件为： 94预变性5min， 94变性45s， 50变性30s。
17、， 72变性120s， 进 行30个循环； 于72下继续延伸l0min， 冷却至4。 0029 实验流程 0030 按照实施例1的方法PCR扩增酮还原酶基因并利用Hind3和EcoRl内切酶位点将基 因括入至pUC19质粒中， 作为基因突变模板； 0031 易错PCR扩增酮还原酶的基因， 扩增后基因片段链接至pUC19-T载体， 将连接后的 载体转入之大肠杆菌BL21(DE3)中建立酮还原酶基因突变文库； 利用大肠杆菌BL21(DE3)为 宿主， pUC19质粒为载体， 表达扩展酮还原酶， 高通量筛选高活性突变株； 突变后对高活性酮 还原酶基因进行鉴定。 筛选出的高活性酮还原酶突变体基因的核酸。
18、序列如SEQ ID NO.1所 示。 0032 酮还原酶基因引物为： 正向引物F1： ATGGCTCATATTGTAATTTT(SEQ ID NO.4)， 反向 引物F2： TTAATTCGGTTTTTTCAGTC(SEQ ID NO.5)。 0033 按实施例1所述方法构建表达该酮还原酶多肽突变体的基因工程菌， 并将其命名 为E.Coli BL21(DE3)KRED1306。 0034 实例3酮还原酶的摇瓶制备 0035 将实施例1所得的酮还原酶基因工程菌或实施例2所得的酮还原酶多肽突变体基 因工程菌E.Coli BL21(DE3)KRED1306接种至含卡拉霉素(50 g/mL)的LB培养。
19、基(蛋白胨 10g/L， 酵母膏5g/L， NaCl10g/L， pH7.2)中， 于30， 200rpm的摇床中振荡培养16小时以上。 转接2mL菌体培养液于50mL含卡拉霉素(或氨苄青霉素)的LB培养基中， 置于同样条件下振 荡培养， 定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。 当菌液的OD600值在0.6- 0.8时， 加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L， 将培养液置于20， 200rpm的摇床中诱导表 达18小时以上。 表达后通过离心(5000rpm， 10min， 4)收集菌体， 并用磷酸二氢钾氢氧化 钠缓冲液(pH7.0， 50mM)清洗两次， 分散于同样的。
20、预冷的缓冲液中， 于冰水浴中进行超声破 胞。 离心收集上清液， 、 浓缩、 冷冻干燥得到野生型酮还原酶或酮还原酶突变体的粉末。 0036 实施例4重组酮还原酶和甲酸脱氢酶活力的测定 0037 以2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-3-氧代丙基苯甲酸甲酯为底物， 紫外可见分光光度计340nm下检测重组酮还原酶活性。 测定方法为： 于1mL50mmol， pH8.0Tris-HCl缓冲液中， 加入0.2mmol NADH， 1mmol2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基 说明书 3/4 页 5 CN 104928265 B 5 苯基-3-氧代丙基苯甲酸甲酯， 30保温2m。
21、in后， 加入实施例3制备的200 L重组酮还原酶 酶液， 迅速混匀， 检测340nm处吸光度在1min内的变化。 酶活力定义： 30， 每分钟催化氧化 0.1mmol NADH的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 0038 酶活的计算公式为： 酶活(U)EWV/6.22 0039 (EW为1min内340nm处吸光度的变化； V为反应液的体积， ml； 6.22为摩尔消光系数) 0040 据此测定野生型酮还原酶的酶活为56.1U， 实施例3制备的酮还原酶突变体的酶活 为351.7U。 0041 实施例5酮还原酶突变体的发酵生产 0042 发酵培养基成分为： 酵母膏16.5g/L， NaCl5.。
22、5g/L， 葡萄糖18g/L， 磷酸氢二钾 14.2g/L， 磷酸二氢钾7.1g/L， 硫酸铵0.9g/L， 硫酸镁七水合物1.6g/L， 柠檬酸铁0.07mg/L， 硫酸锌七水合物50mg/L， 氯化铜四水合物14mg/L， 钼酸铵四水合物35mg/L， 发酵液pH7.0， 罐 温30， 搅拌转速600-1200rpm， 发酵过程中控制DO30以上， 空气流量1:1.5vvm， 葡萄糖残 余量1以下。 接入E.Coli BL21(DE3)KRED1306(CCTCC NO： M2014078)种子液的OD600为 0.8-1.8， 接入量为发酵液体积的5， 发酵液OD600达50时加入IPT。
23、G至终浓度1mmol/L以诱 导酮还原酶的表达， 此后继续发酵15小时。 发酵过程中通过加入含葡萄糖430g/L、 氯化铵 12.2g/L、 硫酸锌七水合物30mg/L、 氯化铜四水合物25mg/L、 钼酸铵四水合物35mg/L、 柠檬酸 铁65mg/L， pH7.0的溶液维持培养物的生长。 发酵结束后将培养物冷却至4保存。 0043 将保存的发酵液经离心、 细胞破碎、 冷冻干燥等常规处理， 制备得到酮还原酶多肽 肽突变体冻干粉并于-80保存。 测得酮还原酶多肽突变体酶活比野生型酮还原酶提高6.2 倍以上。 0044 实施例6重组酮还原酶催化2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-。
24、3-氧代 丙基苯甲酸甲酯不对称还原生成(S,E)-甲基-2-3-3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基苯 基-3-羟基丙基苯甲酸叔丁酯 0045 在5000L反应釜中， 加入750L的100mM PH8.0的三乙醇胺盐酸盐、 1.5L的1M的MgSO4 和20kg的NADNa， 向釜内投加按照实施例5方法制备的重组酮还原酶冻干粉(1107U) 11.5kg， 甲酸脱氢酶(1107U)9.6kg， 甲酸2kg， 在氮气保护下， 升温至35， 搅拌下反应15 分钟后， 分批加入250Kg2-3-3-(2-(7-氯-2-喹啉基)乙烯基苯基-3-氧代丙基苯甲酸 甲酯。 然后将1250L的异丙醇和25。
25、0L的甲苯加入到反应釜中， 搅拌反应42小时。 至底物含量 降至1以下时终止反应。 反应终止后经脱色、 离心、 萃取等操作， 得到产物。 (S,E)-甲基-2- 3-3-(2-(7-氯喹啉基-2-基)乙烯基苯基-3-羟基丙基苯甲酸叔丁酯1H NMR(300MHz, C6D6)8.35(app.d,J1.6Hz,1H),7.92-7.85(m,2H),7.68(s,1H),7.43-7.36(m,3H),7.29- 6.89(m,8H),4.67(t,J5.8Hz,1H),3.43(s,3H),3.30-3.10(m,2H),2.65(br s,1H),2.11 (m,2H)； 13CNMR(7。
26、5MHz,C6D6,27/28C)168.5,157.5,149.7,146.9,145.1,137.2,136.1, 136.0,132.7,131.9,131.5,130.2,129.3,129.3,129.1,128.9,127.3,127.1,126.7, 126.5,126.2,125.7,120.6,73.6,52.0,42.5,31.2。 经HPLC分析， 确定底物转化率97.6， 还原产物的ee99.3。 0046 产物ee值的具体分析条件为： 2.150mm Zorbax Eclipse XDB柱， 30， 0.5mL/ min,H2O中的90:10的乙腈/0.25乙酸； 使用下面的保留时间以287nm进行检测： 对映体醇 0.55min； 酮0.72min。 说明书 4/4 页 6 CN 104928265 B 6 0001 序列表 1/5 页 7 CN 104928265 B 7 0002 序列表 2/5 页 8 CN 104928265 B 8 0003 序列表 3/5 页 9 CN 104928265 B 9 0004 序列表 4/5 页 10 CN 104928265 B 10 0005 序列表 5/5 页 11 CN 104928265 B 11 图1 说明书附图 1/1 页 12 CN 104928265 B 12 。