技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种十六肽化合物及其制备方法和应用。
背景技术
血栓性疾病是一类严重影响健康的疾病，常表现为心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞。目前临床上治疗血栓性疾病的药物主要分为抗血小板类药物、抗凝血药物和溶血栓药物。抗血小板类药物具有抑制血小板的粘附、聚集和释放功能，从而防止血栓形成。抗血小板药物可以有效地防止心血管疾病的发生，并可延长患者的生存期，抗血小板药物在临床应用日益广泛。
目前，称霸于抗血小板药市场上的是美国百时美施贵宝和法国赛诺菲安万特联合研制开发的氯吡格雷，但氯吡格雷价格昂贵，并存在一些不良反应，如出血(严重出血事件的发生率为1.4%)、胃肠道不适、皮疹、头痛、眩晕、头昏和感觉异常，少数患者有过敏反应，表现为荨麻疹、瘙痒。国外报道了11例服用氯吡格雷患者发生严重血栓性血小板减少性紫癜，均在用药后14天内发生，其中10例患者需要进行血浆置换，1例患者死亡。
因此，开发出效果显著安全性更佳的抗血小板聚集药物以部分替代这些进口药物，有利于我国抗血栓药物的发展，具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中抗血小板药物价格昂贵，安全性能不佳的缺点或不足，提供一种十六肽化合物。本发明提供的十六肽化合物能够延长出血时间，显著地抑制血小板聚集，防止血栓形成，且毒性低，在制备抗血小板聚集或抗血栓的药物、药物组分或药物前体上具有广阔的应用前景。
本发明的另一目的在于提供上述十六肽化合物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述十六肽化合物在制备抗血小板聚集或抗血栓的药物、药物组分或药物前体中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种十六肽化合物，所述十六肽化合物的多肽序列为：RTGACFCVIYNGILYP，或序列第1位氨基酸R替换为K、序列第2位氨基酸T替换为S、序列第8位氨基酸V替换为I或L、序列第9位氨基酸I替换为V或L、序列第11位氨基酸N替换为Q、序列第13位氨基酸I替换为V或L或序列第14位氨基酸L替换为V或I中的一种或几种。
发明人在偶然的机会下发现了具有如下多肽序列：RTGACFCVIYNGILYP的天然活性物质十六肽化合物具有延长出血时间，显著地抑制血小板聚集，防止血栓形成的功能，且毒性低，在制备抗血小板聚集或抗血栓的药物、药物组分或药物前体，上具有广阔的应用前景。
同时，根据相似氨基酸功能的简单替换，将该序列的部分氨基酸替换为具有相似功能基团的氨基酸也具有较好的延长出血时间，抑制血小板聚集，防止血栓形成的效果，如将序列第1位碱性的氨基酸R替换为同为碱性氨基酸的K，将序列第2位含羟基的氨基酸T替换为同样含有羟基的氨基酸S，将序列第8位的支链氨基酸V替换为同为支链氨基酸的I或L，将序列第9位氨基酸I替换为V或L（均含有支链氨基酸），将序列第11位含有酰胺基团的氨基酸N替换为同样含有酰胺基团的Q、将序列第13位氨基酸I替换为V或L（均含有支链氨基酸），将序列第14位氨基酸L替换为V或I（均含有支链氨基酸）及其各种替换的组合。
本发明提供的十六肽化合物可根据常规的方法制备得到，在此，本发明也提供一种制备上述十六肽化合物的方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1：将2-Chlorotrityl Chloride Resin 溶胀；
S2：将所述多肽序列的第1位氨基酸R或K与所述2-Chlorotrityl Chloride Resin连接后封闭，然后脱保护；
S3：在活化剂的作用下通过缩合反应连接所述多肽序列的第2位氨基酸T或S；
S4：重复S2~S3的步骤，依次连接所述多肽序列中的氨基酸至序列结束；
S5：从2-Chlorotrityl Chloride Resin 上将所述十六肽化合物切割下来即得。
本发明提供的制备方法可制备得到该十六肽化合物，产率高，工艺简单。
优选地，S1中2-Chlorotrityl Chloride Resin于DCM溶剂中振荡溶胀，所述溶胀的时间为30min。
优选地，S2中封闭过程为：向溶胀后2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入所述多肽序列的第1位氨基酸R或K、Fmoc-Pro-OH氨基酸和N,N-二异丙基乙胺DIEA，振荡，然后用甲醇封闭。
更为优选地，所述Fmoc-Pro-OH氨基酸与第1位氨基酸R或K的摩尔用量比不小于3:1；所述DIEA与第1位氨基酸R或K的摩尔用量比不小于10:1。
优选地，S3中所述活化剂为N,N-二异丙基乙胺DIEA，所述DIEA与第1位氨基酸R或K的摩尔用量比不小于10:1。
优选地，S4中切割的过程为：利用切割液进行切割，所述切割液的组成为：TFA 95%、水1%、EDT 2%、TIS 2%；所述切割时间为120min。
优选地，所述制备方法还包括在每次连接上所述多肽序列的氨基酸后进行检测的步骤。
更为优选地，所述检测的过程为：向2-Chlorotrityl Chloride Resin中加入检测试剂，于105℃~110℃下加热5min。
本领域常规的检测剂均可用于本发明。当2-Chlorotrityl Chloride Resin变深蓝色时为阳性反应。
上述十六肽化合物在制备抗血小板聚集或抗血栓的药物、药物组分或药物前体中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明提供的十六肽化合物既可单一使用，也可作为抗血栓药物其中一个化合物使用。
其一般在室温条件下使用，剂量可为100~400μg/kg/每天，按蛋白多肽化合物类食品或药物的条件使用，同时参照目前市面的抗血栓药物的适用范围。
优选地，所述药物为粉剂、注射针剂或口服液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的十六肽化合物具有延长出血时间，显著地抑制血小板聚集，防止血栓形成的功能，且毒性低，在制备抗血小板聚集或抗血栓的药物、药物组分或药物前体上具有广阔的应用前景。本发明提供的制备方法产率高，工艺简单。
附图说明
图1为实施例1提供的十六肽化合物的急性毒性实验结果，其中A（左）为对照组未进行灌胃14天后的小鼠状态，A（右）为连续14天每天灌胃5g/kg的十六肽化合物后的小鼠状态；B为鼠处理前后体重变化图，其中NS代表无显著统计学意义；
图2为小鼠血液中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种十六肽化合物，其多肽序列为RTGACFCVIYNGILYP。
该十六肽化合物可通过如下制备方法制备得到：
合成顺序：从C端到N端。
(1)树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin放入反应管中，加DCM(15ml/g)，振荡30min。
(2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入氨基酸R和3倍摩尔过量（与氨基酸R的摩尔量相比）的Fmoc-Pro-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA（与氨基酸R的摩尔量相比），振荡60min。用甲醇封闭。
(3)脱保护：去掉DMF，加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。
(4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。
(5)缩合：保护氨基酸Fmoc-Pro-OH氨基酸三倍过量（与氨基酸R的摩尔量相比），HBTU三倍过量（与氨基酸R的摩尔量相比），均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA十倍过量（与氨基酸R的摩尔量相比），反应30min。
(6)检测：取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应。DMF(10ml/g)一次，DCM(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
(7)重复(3)至(6)步操作，依次连接序列中的氨基酸，直至序列结束。
(8)抽干后，DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次， DCM(10ml/g)两次，抽干10min。
(9)从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g) TFA 95%；水1%；EDT 2%；TIS 2%，切割时间：120min。将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。用高效液相色谱将粗品提纯。收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。
经鉴定，该十六肽化合物的多肽序列为RTGACFCVIYNGILYP。
实施例2
本实施例提供一种十六肽化合物，其多肽序列1为KSGACFCILYQGVVYP。
该十六肽化合物的制备步骤加入的氨基酸不一致（根据多肽序列中的氨基酸种类来确定加入的氨基酸）外，其余原料及步骤均与实施例1提供的制备方法一致。
性能测试
本发明以实施例1提供的十六肽化合物为例对其性能进行测定。
（1）十六肽化合物对全血血小板聚集的影响
猪血用塑料管收集和用ACD(86mmol/L 柠檬酸钠，111mmol/L 葡萄糖，53mmol/L 柠檬酸)0.15体积比抗凝，取全血0.5ml与药物孵育5min，然后用凝血酶(500 U/L)或20μmol/L 腺苷二磷酸（ADP）处理，用全血血小板聚集仪记录聚集情况，记录数据。实验数据进行t检验，结果如表1和表2所示。由表可知，该十六肽化合物（在合适的浓度范围内）具有显著抑制凝血酶和ADP激活的血小板聚集，并且效价高于血栓通（目前用于临床的抗血小板药物）。
表1十六肽化合物对凝血酶诱导的猪全血血小板聚集的影响(n=5)
十六肽化合物（μg/ml） 血小板最大聚集率（Ω） 抑制率（%） 0 19.88±2.02 / 0.1 7.90±1.06 60.3** 0.2 4.96±0.63 75.0** 0.4 3.87±0.82 80.5** 100μg/ml血栓通 5.66±0.38 71.5**
*P<0.05, **P<0.01。
表2 十六肽对ADP诱导的猪全血血小板聚集的影响(n=5)
十六肽化合物（μg/ml） 血小板最大聚集率（Ω） 抑制率（%） 0 13.02±2.37 0.1 5.52±3.20 57.6** 0.2 3.64±0.68 72.0** 0.4 3.06±0.92 76.5** 100μg/ml血栓通 3.87±0.73 70.3**
*P<0.05, **P<0.01。
（2）十六肽化合物对大鼠颈动脉血栓形成的影响
用10％水合氯醛4.5ml/kg腹腔注射将大鼠麻醉，分离一侧颈动脉和静脉，经静脉注射药物后，用YLS-14B小动物血栓生成仪刺激颈动脉 (电流 1mA，刺激时间为5分钟)，观察颈动脉血栓阻塞情况，对实验数据采用SPSS10.0统计分析软件，采用q检验法，P＜0.01认为有统计学意义，其中，肝素是目前临床常用于抗血栓药物；血栓通是目前上市的田七皂甙注射液，该注射液是目前用于临床的抗血小板药物。数据结果如下表3。由表可知，该十六肽化合物（在合适的浓度范围内）可有效防止血栓形成。
表3 十六肽化合物对大鼠血栓形成的影响(n=6)
组别 剂量（mg/kg） 5分钟平均堵塞率（％） 对照组 / 80.0±6.0 十六肽化合物组 0.1 28.0±5.6** 十六肽化合物组 0.2 10.2±4.8** 十六肽化合物组 0.4 2.5±1.3** 血栓通组 30 11.8±2.3** 肝素组 1600U 2.3±0.8**
与对照组比较：**P<0.01。
（3）十六肽化合物对小鼠出血时间和凝血时间的影响
出血时间的测定（剪尾法）。
50只昆明种小白鼠，体重18～22g，雌雄各半，随机分为5组，给予高（0.4mg/kg）、中 (0.2mg/kg)、低(0.1mg/kg)的十六肽化合物、血栓通（30mg/kg）和生理盐水。小白鼠腹腔注射给药后30 min，用利剪于小鼠尾尖0.5cm处切断，从开始出血时用秒表计时，每隔30s以滤纸粘断端出血处，至滤纸上完全不见红色血迹时为止，记为该小鼠出血时间，出血时间最长观察60min，超过60min仍出血的按60min计算。记录好时间，各组进行显著性差异比较。
凝血时间的测定（玻片法）。
同时在给药后1 h，摘眼球采血，用玻片法测定凝血时间：小鼠取眼后，在玻片两端各滴2滴直径约5mm的血滴，立即用秒表计时。每隔30s用大头针将血滴由外向内轻轻挑动一次，直至观察到两滴血液都挑出血丝为止。从采血开始至挑起血丝止，即为凝血时间，凝血时间最长观察30min，超过30min不凝血的按30min计算。记录好时间，各组进行显著性差异比较。
表4 十六肽化合物组对小鼠出血时间(BT)和凝血时间(CT)的影响(n=10)
组别 剂量（mg/kg） BT（min） CT（min） 对照组 / 13.39±0.58 1.41±0.36 十六肽化合物组 0.1 23.46±5.01** 1.41±0.63 十六肽化合物组 0.2 25.96±4.38** 1.68±0.33 十六肽化合物组 0.4 26.90.4±4.40** 2.36±0.67* 血栓通组 30 18.34±2.17* 2.10±0.99*
与对照组比较：*P<0.05, **P<0.01。
由表可知，十六肽化合物主要影响出血时间，这提示该化合物特异地抑制血小板聚集预防血栓形成。
（4）十六肽化合物急性毒性实验
实验组连续14天对小鼠（5只）灌胃5g/Kg的十六肽化合物，对照组中的小鼠（五只）不进行投喂；实验组和对照组按相同的饲养标准进行饲养，然后对比实验组和对照组小鼠的体重变化情况和精神状态，如图1所示。
急性毒实验结果显示，14天内连续灌胃5g/kg的十六肽化合物不会造成小鼠死亡，精神状态无差别，实验组和对照组小鼠体重变化不显著，急性毒性低。
采集上述实验小鼠的血液，分别检测血液中丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的活性，对照组和药物组无明显差别，均在正常值范围，提示该十六肽化合物对动物脏器无明显毒性，如图2所示。
序列表
<110> 广东医科大学
<120> 一种十六肽化合物及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Arg Thr Gly Ala Cys Phe Cys Val Ile Tyr Asn Gly Ile Leu Tyr Pro
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
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Lys Ser Gly Ala Cys Phe Cys Ile Leu Tyr Gln Gly Val Val Tyr Pro
1 5 10 15