技术领域
本发明涉及毕赤酵母表达外源蛋白领域，特别涉及在使用毕赤酵母诱导表达外源蛋白工艺中监测发酵终点的方法。
背景技术
毕赤酵母是多种蛋白的理想表达体系(CereghinoGP,CereghinoJL,IlgenC,CreggJM.ProductionofrecombinantproteinsinfermenterculturesoftheyeastPichiapastoris.CurrOpinBiotechnol.2002,13(4):329–332)，其在发酵罐中发酵培养时，一般分为三个阶段(Invitrogenlifetechnologies公司，Pichiafermentationprocessguidelines)：首先利用基础盐溶液、PTM1微量元素作为初始培养基进行分批发酵培养；然后待分批发酵培养至甘油完全耗尽时，进行甘油分批补料培养；最后待甘油分批补料培养结束后，进行甲醇分批补料培养，即蛋白生产阶段。其中，在蛋白生产阶段的后期，菌体死亡时释放出的蛋白水解酶会降解蛋白，导致发酵产量降低，因此，选择合适的方法判断发酵终点及时结束发酵对获得高蛋白产量至关重要。
目前，判断发酵终点一般采用高效液相色谱法或经验法。高效液相色谱法能够准确地检测发酵液中目的蛋白的含量来判断发酵终点(CN104297378A)，然而，此方法需要专门的仪器，购买及运行成本较高，并且设备准备时间和检测时间较长，待检测出结果后，往往错过了最合适的放罐时间，导致部分产品被降解，延长生产周期，这样不仅无法获得高产量，还增加了杂质含量以及后续的纯化工艺成本。经验法是生产中常用的发酵终点判断方法，在特定工艺条件、多批生产的基础上，发酵培养至一定时间后即结束发酵(CN101348820B)，而对于毕赤酵母发酵，通常当菌浓增加缓慢时结束发酵(刘海峰。重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究。华东理工大学博士学位论文。2013)，但这种经验法无法准确判断发酵终点，常常导致提前或者延后结束发酵，给生产造成损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种监测毕赤酵母发酵终点的方法，解决现有技术无法快速、准确判断毕赤酵母发酵终点以及降低纯化成本的问题。
本发明是通过测定发酵液的菌浓和电导率指标联合判断毕赤酵母的发酵终点，具体步骤为：
(1)发酵液的定时取样：诱导表达开始后定期连续取发酵液样品；一般在发酵过程中当诱导表达开始后每12小时取发酵液样品一次，待诱导表达36-48h后增大取样频率，每1-6h取样一次。
(2)发酵液样品的处理：根据所测定指标的不同对样品进行离心或稀释处理；
(3)测定指标：处理完的样品测定菌浓以及电导率，并绘制菌浓和电导率随诱导时间的变化曲线图；
(4)发酵终点的判断：监测发酵液菌浓和电导率随发酵时间的变化，当菌浓指标达到最高点、电导率降低至28～35mS/cm时为发酵终点。
上述方法中测定的菌浓指标为菌体湿重、菌体干重、OD600中的一种，当测定菌体湿重时需要取发酵液样品1～5ml置于预先称重的离心管中于3000～12000rpm离心5～10分钟并弃去上清进行样品的前处理准备；当测定菌浓中菌体干重时样品处理方法为：取发酵液样品1～5ml置于预先称重的离心管中于3000～12000rpm离心5～10分钟，弃去上清，并置于80℃真空干燥至恒重；测定菌浓中OD600的样品的处理方法为：将发酵液样品用水稀释100～1000倍，使最终读数在0.2～0.8之间；
测定电导率时样品的处理方法为：取发酵液样品1～5ml于离心管中，3000～12000rpm离心5～10分钟。
优选的步骤(3)中电导率的测定中取离心后的样品用纯水稀释5～10倍后检测电导率。
监测发酵液菌浓和电导率随诱导时间的变化，当菌浓增加缓慢接近最高点或达到最高点后开始下降，同时电导率降低至28～35mS/cm，即为发酵终点。
优选的，当菌浓增加缓慢接近最高点或达到最高点后开始下降，同时电导率降低至30～32mS/cm，即为发酵终点。
本申请中的毕赤酵母发酵为在发酵罐中利用毕赤酵母进行甲醇诱导表达外源蛋白的过程。毕赤酵母发酵过程中的蛋白生产阶段，菌体一边利用甲醇产生目的蛋白，一边缓慢生长导致菌浓增加，而在毕赤酵母发酵中，培养基中的盐除了维持菌体内外渗透压平衡，还要满足菌体生长、代谢的需要，所以盐浓度随着发酵的进行而降低，宏观表现为电导率的降低。
另外由于在发酵后期，菌体繁殖速度减低，死亡的菌体逐渐增多，导致菌浓逐渐达到最高点的同时，菌体死亡释放出的蛋白酶水解蛋白导致目的产物减少，当增加的蛋白量和减少的蛋白量达到平衡时，表现为产量达到最高，而在此阶段，菌体的死亡除释放出蛋白酶外，细胞内电解质，如盐、有机酸等，也释放进入发酵液，增加发酵液的导电性，部分抵消菌体生长代谢消耗盐导致的导电性下降，表现为电导率下降变得缓慢。当出现电导率下降缓慢现象时，意味着表达量接近高点，经过实验证明，当菌浓增加缓慢接近最高点或达到最高点后开始下降并且电导率降低至28～35mS/cm，优选为30～32mS/cm，即为发酵终点。
本发明的有益效果为：
(1)该方法中采用测定菌浓和电导率的方法判断反应终点，相比现有的HPLC方法，样品的前处理简单，易于操作，检测时间短，便于及时结束发酵，减少了发酵能耗和时间，提高工作效率，降低生产成本。
(2)该方法采用菌浓和电导率的双重指标来判断发酵终点，相比经验法，更能准确地判断反应终点，避免提前或延后结束发酵，提高了生产效率。
附图说明
图1为实施例1中毕赤酵母重组菌在BSM培养基中表达外源蛋白时电导率、菌体湿重以及发酵液上清目的蛋白含量随诱导时间变化的曲线图。-◆-为电导率变化曲线，-▇-为菌体湿重变化曲线，-▲-为蛋白含量变化曲线。
图2为实施例2中毕赤酵母重组菌在BSM培养基中表达外源蛋白时电导率、菌体干重以及发酵液上清目的蛋白含量随诱导时间变化的曲线图。-◆-为电导率变化曲线，-▇-为菌体干重变化曲线，-▲-为蛋白含量变化曲线。
图3为实施例3中毕赤酵母重组菌在BSM培养基中表达外源蛋白时电导率、OD600以及发酵液上清目的蛋白含量随诱导时间变化的曲线图。-◆-为电导率变化曲线，-▇-为OD600变化曲线，-▲-为蛋白含量变化曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步阐释本发明，实施例仅用于说明本发明而不限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：
按照Invitrogenlifetechnologies公司《Pichiafermentationprocessguidelines》中提供的培养基和方法进行毕赤酵母表达外源蛋白的发酵培养，诱导温度28℃，诱导pH5.0。在表达的过程中按照下列步骤进行：
(1)发酵液的定时取样：诱导表达开始后，每12h无菌取发酵液样品一次；诱导48h后每3h取发酵液样品一次；
(2)发酵液样品的处理：取2个5ml离心管，分别用电子天平称重并记录；分别取发酵液样品4ml置于离心管中，3000rpm离心10min；取上清液1ml，纯水稀释至5ml，待测电导率，其余上清液保存于4℃冰箱待用高效液相色谱法检测目的蛋白含量，去除上清液的离心管待测菌体湿重。
(3)测定菌体湿重及电导率：去除上清液的离心管称重，计算出菌体湿重；稀释好的发酵液上清测定电导率；做出菌体湿重、电导率随诱导时间的变化曲线(图1)。
(4)发酵终点的判断：监测发酵液菌浓和电导率随发酵时间的变化。诱导表达48h，按上述方法取样并测定电导率、菌体湿重分别为32.63mS/cm及0.527g/ml；诱导51h时，取样并测得电导率及菌体湿重分别为31.0mS/cm及0.528g/ml，和48h相比，菌体湿重几乎未增加，并且电导率接近30mS/cm，判断达到发酵终点。
为检验本方法的有效性，不结束发酵，继续进行培养，直至电导率低于30mS/cm且菌体湿重开始降低。将留取的上清液样品用高效液相色谱法检测，结果显示(图1)，诱导开始后的前48h，发酵液上清液中目的蛋白含量快速增加，诱导51h时蛋白含量达到最高值950mg/L，其后，蛋白含量显著降低。这说明了诱导51h时确为发酵终点，上述利用发酵液菌浓和电导率联合判断毕赤酵母发酵终点的方法有效。
实施例2：
按照Invitrogenlifetechnologies公司《Pichiafermentationprocessguidelines》中提供的培养基和方法进行毕赤酵母表达外源蛋白的发酵培养，诱导温度25℃，诱导pH5.0。在表达的过程中按照下列步骤进行：
(1)发酵液的定时取样：诱导表达开始后，每12h无菌取发酵液样品一次；诱导48h后每3h取发酵液样品一次；
(2)发酵液样品的处理：取5ml离心管2个，分别用电子天平称重并记录；分别取发酵液样品4ml置于离心管中，12000rpm离心5min。取上清液1ml，纯水稀释至5ml，待测电导率；其余上清液保存于4℃冰箱待用高效液相色谱法检测目的蛋白含量。去除上清液的离心管，置于80℃真空干燥，待测菌体干重。
(3)测定菌体干重及电导率：真空干燥至恒重的带有菌体的离心管，结合记录的离心管重量，计算出菌体干重；稀释好的发酵液上清测定电导率；做出菌体干重、电导率随诱导时间的变化曲线图(图2)。
(4)发酵终点的判断：监测发酵液菌浓和电导率随发酵时间的变化。诱导表达48h，取样并测定电导率、菌体干重分别为32.64mS/cm及119.1g/L。诱导51h时，取样并测得电导率及菌体干重分别为31.60mS/cm及125.2g/L。诱导54h时，取样并测得电导率及菌体干重分别为30.24mS/cm及128.4g/L。和51h相比，菌体干重增加缓慢，并且电导率接近30mS/cm，判断达到发酵终点。
为检验本方法的有效性，继续进行培养，直至电导率低于30mS/cm且菌体干重开始降低。将留取的上清液样品用高效液相色谱法检测，结果显示诱导54h时发酵上清液的蛋白含量达到最高值1022mg/L，其后蛋白含量明显降低，而此阶段对应的菌体干重仍然缓慢增加(图2)，这说明如果按照经验法仅采用菌浓作为发酵结束的判断指标，将错过最合适的结束时间，利用发酵液菌浓和电导率联合判断毕赤酵母发酵终点的方法更为有效。
实施例3：
按照Invitrogenlifetechnologies公司《Pichiafermentationprocessguidelines》中提供的培养基和方法进行毕赤酵母表达外源蛋白的发酵培养，诱导温度25℃，诱导pH5.0。在表达的过程中按照下列步骤进行：
(1)发酵液的定时取样：诱导表达开始后，每12h无菌取发酵液样品一次；诱导48h后每3h取发酵液样品一次；
(2)发酵液样品的处理：取1ml发酵液样品于15ml试管中，用水逐级稀释至1000倍，待测OD600；取5ml离心管2个，分别取发酵液样品4ml置于离心管中，10000rpm离心5min，取上清液1ml，纯水稀释至5ml，待测电导率，其余上清液保存于4℃冰箱待用高效液相色谱法检测目的蛋白含量。
(3)测定OD600及电导率：处理好的样品分别测定OD600及电导率，做出随诱导时间的变化曲线(图3)。
(4)发酵终点的判断：监测发酵液菌浓和电导率随发酵时间的变化。诱导表达48h，取样并测定电导率、OD600分别为32.76mS/cm及598。诱导51h，取样并测得电导率及OD600分别为31.7mS/cm及605。诱导54h时，电导率及OD600分别为30.52mS/cm及610g/ml。和51h相比，OD600增加缓慢，并且电导率接近30mS/cm，判断表达量达到高点，应结束发酵。
为检验本方法的有效性，继续培养，直至电导率低于30mS/cm且OD600开始降低。将留取的上清液样品用高效液相色谱法检测，结果显示诱导54h时发酵上清液的蛋白含量达到最高值902mg/L，其后蛋白含量明显降低，而此阶段对应的OD600仍然缓慢增加(图3)，这说明如果按照经验法仅采用菌浓作为发酵结束的判断指标，将错过最合适的结束时间，利用发酵液菌浓和电导率联合判断毕赤酵母发酵终点的方法更为有效。