技术领域
本发明属于分子生物学和核酸检测领域，特别涉及一种检测山羊外周血淋巴细胞中山 羊关节炎-脑炎病毒前病毒DNA的实时荧光PCR试剂盒及检测方法。
背景技术
山羊关节炎一脑炎(CAE)是由反转录病毒科慢病毒属山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)引起 的山羊的慢性传染病，临床症状以山羊羔的脑脊髓炎和成年山羊的多发性关节炎、硬结性 乳房炎以及间质性肺炎为特征。本病在全球广泛分布，加拿大、美国、澳大利亚、瑞士以 及法国等国家的血清学阳性检出率最高可达65％～77％。我国于上一世纪80年代在进口 种山羊时曾带入本病，因此，对国外进口种山羊实行严格的进境检疫，是防止本病传入我 国的根本措施之一。CAEV为有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类上属于反转录病毒科慢 病毒属成员，CAEV基因组结构组成复杂，病毒以前病毒的形式整合到宿主染色体DNA上， 前病毒基因组全长9189nt，由两端的长末端重复序列、结构基因gag、pol、env和调节 基因vif、tat和rev组成。CAEV主要含有4种结构蛋白，分别是核心蛋白P28、P19、P16 及囊膜糖蛋白gP135。自然感染情况下，CAEV病毒先通过消化道侵入动物体内，然后进 入血液，感染血中单核细胞，此时病毒将基因组整合到宿主染色体内，潜伏于单核细胞内 并不复制。感染的单核细胞侵入脑、关节、肺和乳腺等靶器官组织，在单核细胞转化为巨 噬细胞的过程中，病毒开始复制释放子代的CAEV，使得巨噬细胞不能有效识别清除CAEV 反而成为CAEV的免疫保护屏障，因此CAEV可以终生潜伏在患病羊体内。随着子代病毒的 不断复制和释放，CAEV在患病羊体内形成持续性感染，并成为重要的传染源。对CAE病 原鉴定，可用患关节炎山羊滑膜进行移植分离，或从山羊的外周血、奶和抽出的关节液的 白细胞制备物中分离，然后应用间接荧光抗体试验或间接免疫过氧化物酶试验检测病毒。 病毒分离培养方法不仅周期长，操作烦琐，而且也不易成功。
目前CAEV的广泛传播主要方式引种和活羊贸易，而无论是是出入境还是活羊贸易市 场都缺乏严格的检疫措施，因此建立灵敏、高效的检测方法以加强检疫，有利于及时控制 CAEV感染。采用PCR、Southern印迹以及原位杂交技术，可检测CAEV前病毒DNA中的特 异性核酸序列，尤其适用于对血清学不能确诊的病例进行感染状态的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性的、检测山羊外周血淋巴细胞中山羊关节炎-脑炎病 毒前病毒DNA的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。
本发明试剂盒包含有：实时荧光PCR预混液、上游引物、下游引物、探针、阳性对照、 阴性对照。
1）引物及探针：通过选取山羊关节炎-脑炎病毒基因组的CA基因作为PCR扩增的靶序列， 设定合成特异性的引物和TaqMAN-MGB探针；其序列为：
CAF1：5-CAGTGGATCAGATTATGG-3
CAR1：5-TGCTCTTAAGGCTATTATTAC-3
CAP1：5-FAM-AATCAAGCAGCAGCACAAGC-TAMRA-3
2）阳性对照：为含有目标扩增序列的阳性对照质粒pGEM T-CA质粒；通过人工合成一段 含有扩增靶序列的基因片段，与pGEM T载体连接，转化DH5α大肠杆菌，挑选及鉴定阳 性重组菌，提取重组质粒，用去离子水溶解即得。
3）阴性对照：为提取的正常山羊外周血淋巴细胞基因组DNA；通过将山羊抗凝血以淋巴 细胞分层液分离外周血淋巴细胞，然后用市售的血液基因组提取山羊外周血淋巴细胞基因 组DNA，用去离子水溶解即得。
本发明试剂盒中的PCR反应液可以选择为：1X实时荧光PCR预混液、10pmol/μL上 游引物、10pmol/μL下游引物、10pmol/μL探针，反应总体积为25μL，也可按比例 调整为50μL；
PCR反应条件为50℃,2min；1个循环；95℃，2min；1个循环；95℃，15s；60℃， 30s；40个循环。
测定和判定：
选择荧光检测模式FAM荧光，将3～15循环的荧光信号值定为基线，基线标准差的10 倍定义为阈值，荧光信号值达到阈值时的PCR循环数定义为Ct值。当Ct值在10～35之 间时，被认为是可信的，判定结果为阳性。
本发明的优点和特点是：
通过设计及合成特异性引物和荧光探针序列，采用本领域常规的实时荧光PCR预混液 和自制的阳性对照样品组成试剂盒。本试剂盒可检测山羊外周血淋巴细胞中山羊关节炎- 脑炎病毒前病毒DNA，具有检测灵敏度高，特异性好、操作简便、快速的特点，避免了常 规PCR方法的假阳性。
具体实施方式
实施例
山羊外周血淋巴细胞中山羊关节炎-脑炎病毒前病毒DNA的检测
1.外周血单核细胞（PBMCs）的分离
（1）收集2mL山羊全血，向其中加入2mL的抗凝剂（EDTA）；
（2）在离心管中先加入4.0mL淋巴细胞分离液，将2mL稀释抗凝血缓缓叠加至分离液表 层，水平离心2000rpm30min，液体分层；
（3）用毛细玻璃管吸取中间的云雾层细胞，即为外周血单核细胞，将收集的外周血单核 细胞用10mL PBS洗涤一次，1500rpm离心收集细胞，重复一次，该外周血单核细胞即 可用于样品基因组DNA的提取。
2.提取待检样本DNA
采用市售的TIANGEN公司产品血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作， 具体如下：
（1）吸取200μL外周血单核细胞悬液，加入20μL蛋白酶K，室温放置5min。
（2）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁 的水珠。
（3）加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀15s，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管内），12，000r/min 离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
（5）向吸附柱CB3中加入200μL缓冲液GD，12，000r/min离心30s，倒掉废液，将吸 附柱CB3放回收集管中。
（6）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12，000r/min离心30s，倒掉废液，将吸 附柱CB3放回收集管中。
（7）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12，000r/min离心30s，倒掉废液，将吸 附柱CB3放回收集管中。
（8）将吸附柱CB3放回收集管中，12，000r/min离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以晾干吸附材料中的残余漂洗液。
（9）将吸附柱CB3转移一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱 缓冲液TE，室温放置5min，12，000r/min离心2min，将溶液收集到离心管中。
3.配制反应液
PCR反应液总体积为25μL，按如下组成配制（终浓度）：市售1X实时荧光PCR预混 液，0.4μM上游引物、0.4μM下游引物、0.4μM探针，2～5μL DNA模板，补充水 至25μL。同时做阳性对照和阴性对照PCR反应液。
4.检测用ABI7900荧光PCR仪进行检测，反应条件为：50℃,2min；1个循环；95℃， 2min；1个循环；95℃，15s；60℃，30s；40个循环。
5.结果判定
当阳性对照样品的荧光扩增曲线的Ct值小于30，而阴性对照样品没有出现荧光扩增曲线 时，试验成立。在试验成立的条件下。如待检样本的荧光扩增曲线的Ct值小于30时判为 阳性，大于35时判为阴性，介于30～35时，须重新试验，大于30时判为阴性。