技术领域
本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记能够表达副猪嗜血杆菌抗原 基因的新型副猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌苗的菌株构建、疫苗制备以及疫苗应用。
背景技术
猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我 国养猪业的主要疾病之一，现今在我因特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。目前广泛使用的 仔猪副伤寒商品苗是由中国兽药监察所房晓文于上世纪60年代研制，所用疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500 具有良好免疫原性，但具有一定的残余毒力，遗传背景不清晰，且存在毒力返强的风险。以现今严格规范 的安全审批标准，该疫苗想要通过卫生管理部门提出的安全质控要求非常困难。
近年来基因工程产业飞速发展，使得疫苗的研发无论在方法还是在观念上都发生了重大转变。鉴于减 毒沙门氏菌载体疫苗具有的联合免疫作用、有效激发宿主体液免疫、细胞免疫及粘膜免疫效应、可经口服 或鼻内接种以及载体菌具有免疫佐剂作用等诸多优点，当前应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用 减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制二联或多联活疫苗等已成为研究热点。至今人们已经开发出多 种沙门氏菌疫苗减毒策略，其中应用最广的是asd质粒-载体平衡致死系统。沙门氏菌asd基因编码天冬氨 酸β-半乳糖脱氢酶，它是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而后者是革 兰氏阴性菌细胞壁的重要组分。asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。 将外源基因插入含asd基因的表达质粒，转化asd-宿主菌后可形成互补，转化成功的含有表达质粒的重组 沙门氏菌才能存活，并可在体内或体外稳定表达外源抗原。采用asd质粒-载体平衡致死系统替代抗生素抗 性标记，应用起来也更加安全。
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是一种NAD依赖型、多形的隶属巴斯德菌科的革兰氏阴 性菌，能引起猪的格拉泽氏病(Glasser’s disease)，主要临床特征为纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节 炎，同时也会引起猪的败血症、肺炎和心肌炎(Hoefling，1991)。近些年Glasser’s病严重危害各年龄段的 猪群，发病率和死亡率部显著提高(Oliveira and Pijoan，2004)。规模化养殖猪群中副猪嗜血杆菌病感染率 达到50％-70％，病死率超过了10％，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前市场上副猪嗜血杆菌病防控主 要依赖的仍是灭活疫苗和抗菌药物，只是传统疫苗的开发利用已经越来越难通过卫生管理部门提出的安全 质控要求，抗生素引发的耐药问题也越来越威胁到人类自身健康和公共卫生安全。
2001年人类基因组全序列的公布标志着基因组学和后基因组学技术已面临一个分水岭。病原体的基因 组、转录组和蛋白质组学研究，为新型基因工程疫苗的开发提供机遇。华中农业大学农业微生物国家重点 实验室针对副猪嗜血杆菌SH0165菌株进行蛋白质组学分析之后鉴定出了一批免疫原性蛋白，其中
HPS06257蛋白被证明具有发展疫苗候选体的良好潜力。后经高通量克隆、表达与纯化，并进行适当的与 保护相关的测定，证实了HPS06257蛋白的良好免疫原性以及其作为亚单位疫苗应用的良好前景(周明光， 2009)。
鉴于沙门氏菌asd质粒-载体平衡致死系统具有外源基因表达稳定、不需纯化、无抗生素抗性标记等诸 多优点，同时基于副猪嗜血杆菌外膜蛋白HPS06257的良好免疫原性，利用猪霍乱沙门氏菌商品疫苗C500 菌株为宿主菌开发一种能够表达副猪嗜血杆菌保护性抗原基因hps06257的新型副猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌 苗具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术缺陷获得一株免疫原性和安全性均良好的可表达副猪嗜血杆 菌免疫抗原HPS06257的重组猪霍乱沙门氏菌菌株。
本发明的第二个目的是利用表达副猪嗜血杆菌HPS06257抗原的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备新型副 猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌苗。
本发明的第三个目的是利用表达副猪嗜血杆菌hps06257基因的猪霍乱沙门氏菌重组菌株制备的新型 副猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌苗的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
申请人童果果分子生物学方法获得了一株不含抗性标记的表达副猪嗜血杆菌hps06257基因的重组猪 霍乱沙门氏菌菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257，Salmonella choleraesuis asd- C500/pYA-06257，于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其 保藏编号为CCTCC NO：M2013054。
本发明主要技术方案如下所示：
1.构建表达副猪嗜血杆菌hps06257基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257。其主要试验 流程如下：
1)构建猪霍乱沙门氏菌C500菌株asd基因缺失株asd- C500；
2)设计引物对，通过PCR扩增方法得到副猪嗜血杆菌表面抗原HPS06257基因片段，其核苷酸序列 如SEQ ID NO：1所示；
3)将步骤2)中扩增的基因片段(hps06257)插入原核表达载体pYA3493的核酸内切酶位点EcoR I 和BamH I之间，得到表达质粒pYA-06257；
4)将步骤3)获得的表达质粒pYA-06257电转化至宿主菌株猪霍乱沙门氏菌asd- C500，筛选得到表 达副猪嗜血杆菌表面抗原hps06257基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257，Salmonella choleraesuis asd- C500/pYA-06257，其保藏号为CCTCC NO：M2013054。
2.重组的猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株的生物学鉴定及其作为疫苗应用的安全性评估。
3.重组的猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株作为新型副猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌苗的疫苗制备及 其应用前景。
更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。
本发明的主要优点是：
1.本发明制备的副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗是利用我国仔猪副伤寒商品疫苗菌 株C500作为亲本菌株，导入的的外源抗原HPS06257为源自副猪嗜血杆菌的重要免疫原性蛋白，该抗原 不仅具有良好的免疫保护性，且在副猪嗜血杆菌的主要血清型中均保守存在。因此，本发明制备的二联基 因工程疫苗能同时抵抗仔猪副伤寒和副猪嗜血杆菌病，具有广阔的市场应用前景。
2.本发明制备的基因工程疫苗可经自然免疫途径进行大规模接种(如饮水或饲喂)，操作方便，且能 够诱导机体产生良好的体液免疫、细胞免疫以及粘膜免疫效应。
3.本发明制备的基因工程菌株无抗性标记，完全符合国家疫苗生物安全性要求。
附图说明
序列表SEQ IDNO：1是本发明克隆的副猪嗜血杆菌hps06257基因的核苷酸序列，序列全长为792bp，其 中序列的1-792位是编码区(CDS)。
序列表SEQ ID NO：2足副猪嗜血杆菌表面抗原HPS06257的蛋白质的序列，编码263个氨基酸。
图1：是本发明重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的主要构建流程。
图2：是本发明表达载体pYA3493的质粒图谱。
图3：是本发明构建的重组质粒pYA-06257的双酶切鉴定图谱。泳道M为2000plus的DNA分子Marker， 泳道1、2为重组质粒酶切产物。
图4：是本发明载体质粒pBluescriptSK(+)的物理图谱。
图5：是本发明中自杀质粒pRE112的质粒图谱。
图6：是本发明构建的转移质粒pREasd12的物理图谱
图7：是本发明转移质粒pREasd12的酶切鉴定结果，泳道M为DNA分子Marker，泳道1显示的是pREasd12 双酶切产物pREasd1和asd2。
图8：是本发明猪霍乱沙门氏菌asd- C500突变株的PCR鉴定图。其中泳道M1为2000bp DNA分子Marker， 泳道M2为15000bp DNA分子Marker，泳道1-7为asd- C500缺失株，泳道8-12为亲本株C500对 照，泳道13为pREasd12质粒对照，泳道14为空白对照。
图9：是本发明中重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株的PCR鉴定图。泳道M为2000plus DNA 分子Marker，泳道1为asd- C500/pYA-06257菌株HbpB基因PCR产物，泳道2为asd- C500/pYA-06257 菌株InvA基因的PCR产物。
图10：是本发明重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的SDS-PAGE跑胶图谱。泳道M为蛋白分子 量Marker，泳道1为asd- C500/pYA-3493对照，泳道2为重组菌株asd- C500/pYA-06257，其中箭头 所示为外源蛋白条带。
图11：是本发明重组菌株asd- C500/pYA-06257的Western-blot分析图谱。泳道M为蛋白分子量Marker， 泳道1为asd- C500/pYA-3493对照，泳道2为重组菌asd- C500/pYA-06257，其中箭头所示为外源蛋白 条带。
图12：是重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257与对照菌株asd- C500/pYA-3493的生长曲线。
图13：是本发明重组菌asd- C500/pYA-06257遗传稳定性的PCR分析图谱。泳道M为2000plus的DNA分 子Marker，泳道1-10为重组菌asd- C500/pYA-06257原代、第10、20、30、40、50、60、70、80、 90及100代的PCR产物，泳道C为对照亲本菌株asd- C500的PCR产物。
图14：是本发明重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株免疫小鼠诱导的特异性抗体水平示意图。
具体实施方式
实施例1：副猪嗜血杆菌外膜抗原基因hps06257克隆及重组质粒pYA-06257构建
1.主要实验材料
本发明使用的大肠杆菌χ6097(araΔ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[xhf2：：Tn10]thiΦ80d/lacZΔM15)由美国华盛顿 大学Dr.Roy CurtissIII惠赠。CaCl2、甘油等试剂是上海国药集团化学试剂有限公司产品。Taq酶等PCR相 关试剂、EcoR I和BamH I等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及相应Buffer、DH5α感受态细胞等均 为宝生物工程(大连)有限公司产品。NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、DAB显色诊断试剂盒均为Sigma 公司产品，新生牛血清是杭州四季青生物制品有限公司产品。TSB、TSA为DifcoTM产品。细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天津天根生化科技(北京)有限公司。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生 物工程技术有限公司。
2.目的基因分析及引物设计
本发明涉及生物材料副猪嗜血杆菌SH0165菌株(该菌株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验 室蔡旭旺采集鉴定，详见：蔡旭旺，副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究，2006年6月， 华中农业大学博士论文，中国国家图书馆，中围国家数字图书馆 http://res4.nlc.eov.cn/home/search.trs？method＝showDetail&channelid＝3&id＝003448570。申请人承诺公开发放 此生物材料)。本发明所涉外源基因hps06257在GENBank中的序列登录号及其在副猪嗜血杆菌全基因组 中所处位置为hps06257＞gi|219870279；896442..897233[Haemophilus parasuis]，其中显示有下划线 的为hps06257基因在Genebank中的登录号，分号显示的是该基因在副猪嗜血杆菌SH0165菌株全基因组 中的位置，中括号内显示加粗斜体字的部分为本发明涉及的副猪嗜血杆菌菌株号。
利用SignalP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对抗原蛋白HPS06257进行氨基酸序列分 析，结果表明HPS06257共编码263个氨基酸(见序列表SEQ ID NO：2)，最可能的信号肽切割位置在 第30至31个氨基酸之间。鉴于载体质粒PYA3493(质粒图谱见图3)中多克隆位点上游包含信号肽，因 此我们对除去信号肽以外的序列进行引物设计。应用Primer5.0软件设计hps06257基因的扩增引物(见表 1)。另设计引物对pi1/pi2(见表1)，用以扩增沙门氏菌属特异性基因InvA(Gene ID：1254419)。上述引 物对均由上海生工生物技术有限公司合成。
表1：hps06257和InvA基因的扩增引物
表1说明：hps06257基因引物序列中大写的核苷酸序列为酶切位点。
3.副猪嗜血杆菌基因组模板的制备
将副猪嗜血杆菌SH0165菌株冻干粉接种于含10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSA固体培养基上， 挑取单菌落接种于含有10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。收 集菌体，按照细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京)有限公司产品)说明书提供的操作方法 提取副猪嗜血杆菌基因组DNA。
4.目的基因hps06257的PCR扩增及其产物回收
本发明中目的基因hps06257扩增的PCR反应体系为50μL，具体如表2所示：
表2PCR反应体系组成
PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min， 30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物经0.8％的琼脂糖胶电泳并进行鉴定回收。跑胶结果见图 5所示。然后采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，具 体操作按照试剂盒说明书的步骤进行。
5.χ6097感受态的制备(CaCl2法)
采用CaCl2法制备大肠杆菌χ6097感受态细胞，具体步骤如下：从-80℃冰箱取出大肠杆菌χ6097冻干 粉(大肠杆菌χ6097，Escherichia coliχ6097于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学的中国典型培养 物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012344)，解冻后划线接种于LB平板上，37℃ 恒温倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至5mL含50μg/mL DAP的LB培养液中，37℃、230r/min恒温 培养过夜；按体积比1∶100比例将培养物接种至适量LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃、230r/min 振荡培养3-4h；取出100-200μL培养物检测OD600，当OD600介于0.3-0.4之间时，将培养物冰浴30min， 后于4℃，5000-6000r/min条件下离心10min，收集菌体，弃上清；加入约菌液体积1/2-1/5的冰CaCl2溶液(100mmol/L，含10％(V/V)甘油，下同)，轻轻吹打充分重悬菌体沉淀，冰浴15min；重复上述 步骤2次；再次于4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；加入约1/50-1/25原培养液体积的CaCl2溶液，轻轻吹打重悬菌体；分装至无菌EP管，每管100μL，-80℃贮存备用。
6.表达质粒pYA-06257的构建
将步骤1中所获的hps06257基因片段与载体质粒pYA3493使用限制性内切酶EcoR I和BamHI进行 双酶切，采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收酶切产物，并将两 者于16℃水浴连接。次日将连接产物转化步骤2制备的χ6097感受态细胞，37℃条件下下在无抗性LB 固体培养基上培养。观察可在平皿上生长的单菌落，随机挑取若干，分别放入LB液体培养基中，37℃培 养12小时。少量提取质粒，酶切鉴定后筛选阳性重组质粒，命名为重组质粒pYA-06257。重组质粒 pYA-06257的双酶切鉴定图谱见图3。
实施例2猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失突变株asd-C500的构建
1.主要实验材料
猪霍乱沙门氏菌弱毒商品疫苗株C500购自中国兽医药品监察所。pBluescriptSK(+)载体质粒(该质粒 物理图谱见附图4)购自美国Stratagene公司。自杀质粒pRE112(其质粒图谱见附图5)、大肠杆菌χ7213 菌株由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠。
Taq酶等PCR相关试剂、Xba I和BamHI等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及Buffer、DH5a感 受态细胞等均为宝生物工程(大连)有限公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天津天根生化科技 (北京)有限公司。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA分子 Marker、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit均为北京全式金生物技术有限公司产品。氯霉素、DAP、NC膜等 购自美国Sigma公司。
2.引物设计
参照鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因(GenBank No：AE008863)上下游序列设计2对引物pa1/pa2和 pa3/pa4(见表2)，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1和asd2， 扩增片段大小分别为2112bp和2069bp(其中上游基因asd1在NCBI中的位置是 NC_012125.1：3638301..3640412，下游基因asd2在NCBI中的位置是NC_012125.1：3641589..3643657)， 上臂两端分别引入Xba I和BamHI酶切位点，下臂两端分别引入BamHI和Kpn I酶切位点。另设计pa5/pa6 引物对(见表3)用于进行猪霍乱沙门氏菌C500菌株和asdC500缺失株的鉴定。引物由上海生工生物工 程有限公司合成。
表3：相关PCR引物
表2说明：引物序列中带有下划线的核苷酸序列为酶切位点。
3.asd基因上游片段asd1与下游片段asd2的克隆
将猪霍乱沙门氏菌C500冻干粉在无抗性LB固体平板上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB 液体培养基中，37℃条件下200r/min培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京) 有限公司产品)说明书介绍的方法，提取猪霍乱沙门氏菌C500全基因组作为PCR模板。
目的基因asd1和asd2的PCR扩增反应均在25μL体系中进行，反应体系如下：模板DNA1μL，10 μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs1μL，2U/μL Taq酶0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，双蒸 水16μL。asd1和asd2基因的PCR扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃lmin， 57℃1min，72℃2.5min。30个循环后，72℃延伸10min。所扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳 分析，片段大小与预期大小相当，证实目的基因asd1和asd2的获得。
4.pREasd12转移质粒的构建
先以Xba I和BamHI双酶切asd1基因片段和pBluescriptSK(+)载体质粒，回收纯化后用T4DNA ligase 连接(连接产物命名为pSKasd1)，16℃水浴12h，转化DH5α感受态细胞，37℃在固体LB培养基培养 12h，挑菌到液体LB培养基，于37℃、225r/min振摇培养12h。使用质粒小提试剂盒少量提取并获得中 间质粒pSKasd1，再用BamH I和Kpn I双酶切基因asd2与质粒pSKasd1。回收后用T4DNA Ligase连接 (连接产物命名为pSKasd12质粒)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养12h，挑菌到液体LB 培养基，37℃、225r/min培养12h，小量提取质粒从而获得pSKasd12质粒。用Xba I和Kpn I双酶切转移 质粒pSKasd12与自杀性质粒pRE112(来源：美国圣路易斯密苏里州，华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII教授 惠赠)，回收asd1-asd2片段和质粒pRE112，用T4DNA Ligase连接，16℃水浴12h，电转化(参数： 电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间4ms)大肠杆菌χ7213(来源美国圣路易斯密苏里州，华 盛顿大学Dr.Roy CurtissIII教授惠赠；Edwards，R.A.，L H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze987P fimbria gene expression.Gene207：149-157)构建重组大肠杆菌 χ7213/pREasd12菌株，37℃培养12h挑菌到LB液体培养基，37℃下225r/min培养12h，小量制备质 粒从而获得pREasd12转移质粒(其物理图谱见图6)。PCR跑胶电泳，鉴定结果证实构建的转移质粒 pREasd12可以被酶切为pREasd1与asd2两个条带(见图7)，表明pREasd12构建成功。
5.asd基因缺失株的构建
以大肠杆菌χ7213/pREasd12为供体菌，猪霍乱沙门氏菌C500为受体菌进行接合转移。先将供体菌和 受体菌分别在LB培养基中培养过夜，用无菌PBS缓冲液(成分：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，加蒸馏水至总体积达1000mL，pH7.4)洗两遍，调整菌浓度OD595至0.8，各取100μL 菌体悬液混合。先将无菌硝酸纤维滤膜(NC膜)贴于含DAP的固体LB平板上，再将混合菌液滴于NC 膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。用无菌PBS洗下滤膜上菌液，重复两遍，涂布含30μg/mL 氯霉素的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，挑取阳性 克隆然后提取基因组，用引物pa5/pa6扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12 h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固 体平板，筛选Cm敏感菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，鉴定结果见图8。缺失asd基因 的C500突变株无法合成DAP，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。因而，所构建的asd基因缺失株 asd- C500是正确的。申请人将该asd基因缺失株命名猪霍乱沙门氏菌Δasd C500-，Salmonella choleraesuisΔasdC500-(也常写成asd- C500)，该菌株于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2012346。
实施例3：重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株构建
1.猪霍乱沙门氏菌asd- C500感受态细胞制备
从-80℃冰箱中取出猪霍乱沙门氏菌asd- C500冻干粉，以无菌铂丝直接蘸取并于含50μg/mL DAP的 LB平板表面划线接种，37℃倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至4mL含50μg/mL DAP的LB培养液中， 37℃180r/min培养过夜；按体积比1∶100将培养物转接至50mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37 ℃、230r/min振荡培养2-3h；取出100-200μL培养物检测OD600，当OD600介于0.8左右时，冰浴菌液使 之冷却到0℃；然后在4℃条件下5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；用2-5mL10％灭菌甘油洗涤 菌体沉淀，重复3次，再用10％灭菌甘油重悬菌体细胞，100μL/管分装，做好标记后置-80℃冰箱冻存备 用。
2.重组质粒的电转化
取2-3μL已除盐重组质粒pYA-06257加入到步骤3制备的感受态细胞asd- C500中，轻轻混匀并立即 转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRad GenePulser)样品槽中； 按照以下条件进行电转化：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间，4ms。电击后，马上取出电 转杯，迅速加入预热至37℃的LB培养基(含50μg/mL DAP)，并将菌液转移到无菌EP管中；37℃120r/min 震荡培养60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液 完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行鉴定。
另外，取2-3μL不含盐的pYA3493质粒加入到步骤3制备的感受态细胞asd- C500中，轻轻混匀并立 即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRad GenePulser)样品槽中； 按照上述条件进行电转。电击后，马上取出电转杯，迅速加入预热至37℃的LB培养基(含50μg/mLDAP)， 并将菌液转移到无菌EP管中；37℃120r/min震荡培养60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养 基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长 出后进行鉴定。申请人将目的重组菌株命名为猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA3493，Salmonella choleraesuis asd- C500/pYA3493(该菌株是用于实验对照的菌株)，该菌株已于2013年1月24日保藏 在中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013051)。目 的重组菌株猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA3493可以合成DAP，恢复了在不含外源DAP的培养基上生长的 能力。
3.重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257(用于制备本发明的减毒疫苗)的获得
挑取能在单纯LB平皿表面生长的菌落，分别以pH1/pH2、pi1/pi2作为引物对之进行PCR鉴定。琼 脂糖凝胶电泳结果显示所选菌株能够扩增出沙门氏菌特异条带(580bp)和外源基因条带(702bp)，重组 猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株构建成功(见图9)。将重组质粒pYA-06257成功电转至asd- C500 感受态细胞后所构建的重组菌株asd- C500/pYA-06257恢复了在不含DAP的LB培养基上生长的能力，这 说明重组质粒pYA-06257在asd- C500宿主菌株内能够表达asd基因并与宿主菌的asd缺失表型形成互补。
至此，申请人获得了一株不含抗性标记的可以表达副猪嗜血杆菌hps06257基因的重组猪霍乱沙门氏菌 株，将其命名为猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257，Salmonella choleraesuis asd- C500/pYA-06257，该 菌株已于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为 CCTCC NO：M2013054。
实施例4：重组猪霍乱沙门氏菌株asd- C500/pYA-06257的生物学特性
1.主要实验试剂
氯化钠、乙醇、乙酸等是上海国药集团化学试剂有限公司产品；Tris碱、十二烷基磺酸钠(SDS)、 内烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)等购自上海生工生物工程技术有限公司；甘氨酸、考马 斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250购自AMRESCO公司；牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、辣根过氧化 物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、DAB显色诊断试剂盒等均为Sigma公司产品。
2.重组菌株asd- C500/pYA-06257的表达特性
将重组菌asd- C500/pYA-06257接种于无抗性液体LB培养基中，37℃振摇培养15～16h后，离心收集 菌体。加入适量PBS重悬菌体沉淀，洗涤1次后加入等体积2×SDS上样Buffer，煮沸10min后冰浴裂解 菌体，以备进行SDS-PAGE。注意同时处理asd- C500/pYA3493菌体作为阴性对照。
本发明参照《分子克隆实验指南》第三版(萨姆布鲁克，黄培堂译，科学出版社，2002年版)的方法 进行SDS-PAGE凝胶的配制、电泳、染色以及脱色。具体步骤如下：
SDS-PAGE的配制及电泳：
按照表4准备好分离胶所需相关试剂，将各成分依次加入20mL烧杯中，迅速混匀，然后立刻添加到 制胶板中，胶液上层缓慢铺上少量ddH2O。约30min后，待下层分离胶完全凝好后彻底弃掉上层水，同时 准备5％浓缩胶的配制，具体胶液组成见表4，添加各成分后迅速混合，加入制胶板的分离胶上面，灌满 后插入加样梳。待浓缩胶完全凝固后取下梳子，将凝胶板固定于电泳装置上，并向胶槽中加入足量Tris- 甘氨酸电泳缓冲液。向加样孔中分别加入各样品；电泳时先设置电压为80V，电流保持在20mA-40mA范 围内，电泳约30min后，至所有样品进入分离胶层后调整电压至120V，直至溴酚蓝泳出胶底面时终止电 泳。
表4SDS-PAGE胶配置
SDS-PAGE的染色与脱色：
待电泳完成以后卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸，0.25 ％的考马斯亮蓝R250)染色过夜，然后再用脱色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)进行脱色， 观察结果。重组菌株猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的SDS-PAGE分析结果见图10所示。
Western-blot分析
重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的Western-blot分析首先是按照上述方法进行SDS-PAGE凝 胶电泳，其后操作步骤如下：
1)转膜：裁取6张Whatman3M滤纸和1张NC膜，滤纸和NC膜的尺寸大小要完全等于或略小于 凝胶；将NC膜在ddH2O中浸泡5min，滤纸浸泡于转移缓冲液中。然后按如下步骤操作：平放石墨电极 的阳极底座，依次放3层滤纸、NC膜、SDS-PAGE凝胶和3层滤纸，彻底排除各层间气泡；将转移电泳 槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm2-1.0mA/cm2的 参数设置电流，电泳转移1h。
2)封闭：转膜完全后取出NC膜，置于含2％BSA的封闭液中，室温封闭2h；
3)洗涤：弃封闭液，用TBST(pH7.5，含1M Tris-HCl10ml，NaCl8.8g，0.05％吐温-20)洗NC 膜3遍，每次5min；
4)一抗孵育：将NC膜放入1∶100倍稀释的小鼠抗HPS SH0165感染血清(该血清来源于感染了致死 剂量的副猪嗜血杆菌HPS SH0165菌株后存活的小鼠)中，37℃孵育2h；
5)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜3-5次，每次5min；
6)二抗孵育：将NC膜转入用封闭液1∶5000倍稀释的羊抗鼠IgG抗体(HRP标记)中，37℃孵育2h；
7)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜5次，每次5min；
8)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，避光显色，待目的带颜色深度达到要求后，迅速用 TBST洗涤液冲洗以终止反应。观察结果。
重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的Western-blot分析结果见图11，结果显示重组猪霍乱沙门 氏菌asd- C500/pYA-06257能够表达外源蛋白HPS06257，且所表达的外源蛋白具有良好免疫原性。
3.重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的生长特性
将重组猪霍乱沙门氏菌株asd- C500/pYA-06257(简称：重组菌asd- C500/pYA-06257)与对照菌株重 组猪霍乱沙门氏菌株asd- C500/pYA-3493(简称：重组菌asd- C500/pYA-3493)划线接种于无抗性LB平板 上，挑取单克隆分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液OD595值，取50μL接种 于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定菌液OD595值。结果如图12所示，表明重组菌株 asd- C500/pYA-06257与对照菌株asd- C500/pYA3493生长趋势非常接近，趋于一致。
4.重组猪霍乱沙门氏菌株asd- C500/pYA-06257的遗传稳定性
将重组菌asd- C500/pYA-06257在LB液体培养基中连续传代，分别取原代、第10、20、30、40、50、 60、70、80、90、100代菌液作为模板进行PCR鉴定。结果表明：各株重组菌的不同代次均能扩增出外源 基因06257条带(702bp，见图13)。对传代100次后挑取的重组菌测序结果与初代外源片段序列依旧一致， 表明重组质粒pYA-06257能在猪霍乱沙门氏菌asd- C500中稳定遗传，重组猪霍乱沙门氏菌 asd- C500/pYA-06257能够携带外源康源基因hps06257。
5.重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257的致病力评估
重组菌株asd- C500/pYA-06257的致病力及安全性评估是通过感染SPF级昆明小鼠感染试验证明的。 将梯度剂量的重组菌asd- C500/pYA-06257腹腔注射4周龄SPF级雌性昆明系小鼠，同时设置asd- C500/pYA3493菌株对照，连续观察21天并记录小鼠的存活情况。按照Reed-Muench法计算小鼠的半数致 死剂量(LD50)，评价重组菌株与对照菌株相比的毒力变化。小鼠腹腔感染重组菌asd- C500/pYA-06257与 对照菌株asd- C500/pYA3493的安全性评估实验结果见表5，表明重组菌asd- C500/pYA-06257与阴性对照 菌株asd- C500/pYA3493相比LD50相差不大，二者致病力相当，证明重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257对于小鼠的安全性较好。
表5本发明的重组猪霍乱沙门氏菌菌株对小鼠半数致死剂量LD50的测定
实施例5：重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257疫苗的制备
将重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株在无抗性LB固体培养基上培养，挑取单菌落接种至 LB液体培养基，37℃培养8-10h。收集菌体并调整活菌数目达1×1010CFU/mL，将菌液与15％灭菌脱脂乳 (灭菌脱脂乳配制方法是将每100mL去离子水中加脱脂奶粉15g，充分混匀后，105℃灭菌30min，待混 合液温度冷却至室温后置4℃保存备用)以1∶1体积比进行充分混合，按每瓶2.0mL的规格分装于灭菌冻 干瓶中，置冷冻干燥机中冻干。冻干36-40h后压盖，置-20℃保存备用，以作为能够同时抵抗副猪嗜血杆 菌病和仔猪副伤寒的副猪嗜血杆菌的减毒活疫苗。
实施例6：重组菌株疫苗asd- C500/pYA-06257对小鼠的免疫效力试验
1试验分组及免疫
随机选取4周龄SPF级雌性昆明小鼠48只，平均分为4组，每组12只。依次设置为asd- C500/pYA-06257 口服免疫组，asd- C500/pYA-06257腹腔注射组、asd- C500/pYA-3493口服免疫组、asd- C500/pYA-3493腹腔 注射组。口服组小鼠免疫前禁食24h，禁水4h，并先以100μL10％NaHCO3中和胃酸，30min后用12 号灌胃针口服疫苗100μL，灌胃1h后恢复饮水和饲料。腹腔注射后每只小鼠免疫剂量为0.2mL/只。初次 免疫两周后进行加强免疫1次，具体操作同一免。
2血清特异性抗体的检测
各组小鼠在首免后第28天采血收集免疫血清，每组6只，用于检测各组小鼠的HPS06257特异性抗体 水平(具体操作方法参考文献5)。免疫小鼠血清中特异性HPS06257抗体的ELISA检测结果见图14，结 果表明相比asd- C500/pYA-3493对照组，重组菌asd- C500/pYA-06257免疫组小鼠产生了较高水平的针对 目的蛋白HPS06257的特异性抗体，而且相对于口服组而言腹腔注射组小鼠产生特异性抗体的能力更强。
3免疫小鼠攻毒保护性试验
加强免疫后第14天对小鼠进行攻毒试验。将每组免疫小鼠分两批进行，每批6只。其中一批采用副 猪嗜血杆菌SH0165菌株进行攻毒，攻毒途径是腹腔注射，攻毒剂量为40亿CFU/0.2ml/只；另一批采用猪 霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(菌株来源：中国兽医药品监察所)进行攻毒试验，攻毒方式是灌胃，攻毒剂 量为500万CFU/0.1m L/只。灌胃前禁食24h，禁水4h，先以100μL10％NaHCO3中和胃酸，30min后 用12号灌胃针口服疫苗100μL，攻毒2h后恢复饮水和饲料。攻毒后连续观察14天，记录各组小鼠的临 床特征及死亡情况。
具体攻毒保护结果见表6与表7。针对免疫小鼠的HPS SH0165攻毒结果来看，无论是采用口服免疫 还是皮下注射方式，重组菌株asd- C500/pYA-06257均能提供明显的保护力。对于猪霍乱沙门氏菌强毒株 攻毒试验，可以看出重组猪霍乱沙门氏菌asd- C500/pYA-06257菌株与对照菌株asd- C500/pYA-3493均具 有一定的保护力，而且本发明的重组菌株的保护效力更强。由此证明，本发明构建的重组猪霍乱沙门氏菌 asd- C500/pYA-06257菌株能够同时抵抗猪霍乱沙门氏菌和副猪嗜血杆菌感染，具有作为新型副猪嗜血杆菌 减毒沙门氏菌疫苗的良好应用前景。
表5免疫小鼠的攻毒保护结果
参考文献
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