技术领域
本发明涉及一种转基因水稻外源基因插入的纯合/杂合状态检测的方法， 特别涉及转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物及其检 测方法。
背景技术
标准物质是食品、农产品中转基因成分检测的“金标准”，是依法开展转 基因生物安全监管的重要物质基础。转基因成分检测标准物质研制对原材料 的均匀性、稳定性、特征量值范围等方面有严格要求。目前，国内外转基因 成分检测普遍采用基于核酸的定性、定量检测方法。其中定量检测通常采用 RealTime-PCR方法对样品中靶标核酸序列进行绝对定量，即测定外源DNA插 入特征序列的拷贝数，并以此为基础计算样品中转基因成分的含量。在转基 因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位，一个纯合体的2倍体基 因组中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2，一个杂合 体的2倍体基因组中外源DNA插入特征序列的拷贝数为1，非转基因材料中则 为0。因而，转基因检测标准物质制备原材料的均匀性、稳定性、特征量值范 围主要体现在外源DNA插入所产生的特征序列的杂合或纯合状态。在标准物 质的研制过程中，必需对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确 认外源DNA插入所产生的特征序列是纯合还是杂合状态。
此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材 料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便 鉴定纯合体/杂合体育种材料，也有利于缩短育种进程。
目前，已报道的转基因成分检测方法，主要包括针对外源目的基因、调 控元件的筛选检测和基因特异性检测，针对遗传转化载体构建特征的构建特 异性检测，针对外源DNA插入特征序列的品系特异性检测等三类。利用以上 方法，只能确定样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分，但无法 直接鉴别样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态。迄今未止，国内外目前还 没有针对转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/ 杂合状态的PCR检测引物。
本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂 合状态的PCR检测方法。
本发明的目的还在于提供转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂 合状态的PCR检测试剂盒。
一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测引物，所述 引物为：PA110-LA-F，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；PA110-LA-R， 其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。
专利CN201410081893公开的了转基因水稻PA110-15外源插入片段旁侧 序列及应用。本发明根据PA110-15外源插入片段旁侧序列信息，在水稻染色 体部分设计出一对能够准确检测转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/ 杂合状态的PCR检测引物。
一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测方法，按照 如下步骤进行：
(1)提取待检测水稻样品的DNA；
(2)以提取的DNA为模板，以SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核 苷酸序列为扩增引物，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；
(3)如果仅扩增出一条3856bp片段，则待检测的样品为纯合转基因水 稻PA110-15；如果扩增出3856bp和751bp的两条片段，待检测的样品为杂 合转基因水稻PA110-15；如果只扩增出一条751bp片段，待检测的样品为非 转基因水稻。
其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料 中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或经验证适用于植 物DNA提取的试剂盒等各种方法。
所述PCR扩增体系按照以下方式建立：反应体系的总体积为25.0μL，其 中，10×LATaqBufferII(Mg2+Plus)缓冲液2.5μL，5U/μL的TaKaRa LATaq聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/LSEQ IDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25ng/μL DNA模板2μL，余量为双蒸水。
所述PCR扩增的条件为：94℃变性1min；98℃，10s，66℃，5min， 30个循环；72℃延伸10min。
一种转基因水稻PA110-15外源基因纯合杂合状态的PCR检测试剂盒，包 括：10×LATaqBufferII缓冲液，TaKaRaLATaq聚合酶，dNTPMixture， 引物和双蒸水；所述引物的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2 所示的序列。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明检测方法能够准确 的检测出转基因水稻PA110-15外源基因插入的纯合/杂合状态，为转基因水 稻PA110-15成分检测标准物质研制、转基因定量检测、样品鉴定奠定了基础。
附图说明
图1是PCR方法鉴定转基因水稻PA110-15纯合体琼脂糖凝胶电泳图；
图中，M：1KbplusDNAMarker；1：空白对照；2：PA110-15受体；3： PA110-15纯合体；4：PA110-15受体和PA110-15纯合体混合样品。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本 发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的PCR检测方法 的建立
1、引物设计及序列
该转化体外源整合结构位于水稻基因组4号染色体上，其中，引物 PA110-LA-F位于5’端水稻基因组上；引物PA110-LA-R位于3’端水稻基因 组上。
引物序列
PA110-LA-F：TCGATCAGTGCATCTGCTGTGGCT(SEQIDNo.1)。
PA110-LA-R：TCATACATAGGAATGCGAAGCCGAAGAT(SEQIDNo.2)。
2、PCR扩增反应体系及反应程序：
反应体系：10×LATaqBufferII(Mg2+Plus)缓冲液2.5μL，TaKaRaLA Taq(5U/μL)聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/L SEQIDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25 ng/μLDNA模板2μL，用去离子水补至25μL。
由于扩增大的基因片段出现假阴性的概率较大，常常将杂合转基因水稻误 认为是非转基因水稻，因此，有必要优化一下反应体系，使得出现假阴性的 概率降低，通过反复实验，摸索出来一套假阴性出现概率极低的反应体系如 下：10×LATaqBufferII(Mg2+Plus)缓冲液2.5μL，TaKaRaLATaq(5U/ μL)聚合酶0.25μL，dNTPMixture(2.5mMeach)4.0μL，10μmol/LSEQ IDNo.1所示的引物1μL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物1μL，25ng/μL DNA模板2μL，牛血清蛋白1μL(1μg/μL)或槐耳多糖蛋白1μL(1μg/μL), 用去离子水补至25μL。所述槐耳多糖蛋白采用专利201310144971.9所公开 的方法制备。
PCR扩增程序：94℃变性1min；(98℃10s，66℃5min)30个循环； 72℃延伸10min。
3、结果判定
纯合转基因水稻PA110-15中仅能扩增出一条3856bp的片段；杂合转基 因水稻PA110-15同时扩增出两条片段，一条为3856bp，另一条为751bp； 而非转基因水稻中只能扩增出一条751bp片段。
实施例2转基因水稻PA110-15外源基因纯合/杂合状态的PCR检测的应用实 验
一、植物材料
1、转基因水稻PA110-15纯合体；
2、非转基因水稻：PA110-15受体；
3、PA110-15受体和PA110-15纯合体混合样品。
二、实验方法
(一)、植物基因组DNA的提取与检测
1植物材料DNA提取
1.1试剂盒法提取水稻基因组DNA
采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305(天根生化科技有限公司)进行 PA110-15水稻及其受体水稻基因组DNA提取和纯化.
1.2提取方法
1)取200mg水稻粉末样品；
2)加入800μL65℃预热的GP1缓冲液，迅速颠倒混匀，将离心管放 在65℃水浴1h，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。
3)加入等体积酚：氯仿(1:1)，充分混匀，12000rpm离心10min。
4)转移上清至一新离心管，加入等体积氯仿，充分混匀，12000rpm 离心10min。
5)取上清，加入等体积GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液 (吸附柱容积700μL，可分次加入离心)。
7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s， 倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
9)重复步骤8。
10)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。 将吸附柱CB3至于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加 入60μL0.1×TE缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，将 溶液收集到离心管中。
2DNA检测
采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在OD260处有显著 吸收峰，OD260/OD280比值应为1.7-1.9。
(二)、PCR反应体系及反应程序的建立
按照实施例1所述的PCR扩增反应体系及反应程序进行。
三、实验结果
实验结果如图1所示；纯合体PA110-15仅能扩增出一条3856bp的片 段；PA110-15受体和PA110-15纯合体混合样品扩增出两条片段，一条为 3856bp，另一条为751bp；非转基因水稻只能扩增出一条751bp片段。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任 何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。