技术领域
本发明涉及试剂盒，特别是涉及一种用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒。
背景技术
长期以来，心血管病是人类死亡的主要病因之一，其中因急性心肌梗死和慢性心 功能不全导致的死亡占心血管病死亡率的50％以上。由于成熟的心肌细胞缺乏再生能 力，心肌梗死发生后，心肌细胞数量减少，梗死区通过纤维组织增生，由无收缩功能 的疤痕组织取代坏死损伤心肌，继而发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致 充血性心力衰竭。目前，临床上对于急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心功能不全的常 用治疗手段主要包括药物治疗、内科介入治疗和外科手术治疗等，基因治疗尚处于临 床试验阶段。但是目前的药物治疗和介入方法只能通过缩小MI面积、恢复缺血的存 活心肌的血液供应、延缓左心室重构，以改善患者的预后，而不能从根本上修复已坏 死的心肌组织，彻底恢复心脏的正常收缩功能，难以从根本上改善患者生活质量；而 外科冠状动脉旁路移植术(CABG)对陈旧性心肌梗死、三支病变、不宜内科介入治疗 的患者虽提供了一些帮助，但对于冠脉远端血运不佳及侧支循环不好的患者的应用也 存在困难，而且术后的移植血管病也在困扰着临床外科医生和患者，心脏移植手术理 论上可以根治各种原因造成的晚期心功能衰竭，但由于异体心脏移植供体来源匮乏、 移植排斥反应、移植组织功能衰竭及高昂的费用限制，难以在临床上广泛应用。细胞 治疗是近些年来飞速发展起来的一种高科技生物治疗手段。
目前，用于心脏细胞移植的细胞主要包括：心肌细胞移植、骨骼肌细胞移植、平 滑肌细胞移植、骨髓细胞移植以及胚胎或脂肪组织中的干细胞、成纤维细胞、血管内 皮细胞、胸腺肌样细胞移植等。其中骨髓间充质干细胞(MSC)具有多向分化潜能， 自体骨髓MSC在移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题，植入反应微弱，同时，骨 髓MSC连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，并保持正常的核型和一定的 端粒酶活性，是细胞治疗的理想种子细胞。随着骨髓干细胞研究的不断深入，心肌再 生的小样本临床研究也逐渐展开。2001年，Fuchs和Kamihata用小型猪进行了骨髓 单个核细胞移植的临床前期试验研究，分别证实了心内膜下注射和直视下心外膜注射 骨髓单个核细胞的安全可行性。同年，德国杜塞尔多夫大学医院的Strauer将骨髓单 个核细胞第一次应用于临床治疗(Strauer BE，et al.Repair of Infarcted Myocardium by Autologous Intracoronary Mononuclear Bone Marrow Cell Transplantation in Humans.Circulation.2002，106：1913-1918.)；2002年，该 研究小组又对10例急性心肌梗死患者采用自体骨髓单个核细胞进行移植治疗，研究 结果提示经冠状动脉内移植自体骨髓单个核细胞治疗急性心肌梗死在临床上是安全 有效的，其疗效可能与心肌再生和血管新生有关。不仅国外研究者做了大量的工作， 国内学者也于2004年将用自身血清培养出的MSC移植到34例PCI术后18天的病人， 同时给35例患者注射生理盐水作为对照。随访6个月发现，骨髓MSC移植可明显改 善左室功能，且未见与移植MSC相关的副作用(Shao-liang Chen，et al.Effect on Left Ventricular Function of Intracoronary Transplantation of Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell in Patients With Acute Myocardial Infarction. Am J Cardiol.2004，94：92-95)。2003年，在巴西和德国分别各进行了14例自体 骨髓干细胞治疗心力衰竭的临床试验研究，在此基础上，2004年4月美国FDA批准了 第一例自体骨髓干细胞治疗心力衰竭的临床试验(Dohmann Hans F.R.，et al. Transendocardial Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Injection in Ischemic Heart Failure：Postmortem Anatomicopathologic and Immunohistochemical Findings.Circulation.2005，112：521-526.)。但是目前 还未有用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒，使得相关科研工作的进展相对缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用方便、成本低廉的用于制备骨髓间充质干细胞的试 剂盒。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：一种用于制备骨髓间充质干细胞的 试剂盒，包括稀释液，洗涤液，由分离液A和分离液B组成的分离液，细胞培养液A， 细胞培养液B以及细胞消化液A。
所述稀释液可为生理盐水、PBS或Hank’s等溶液，优选为质量/体积百分比浓度 为0.85-0.9％的生理盐水。
所述洗涤液可为生理盐水、PBS或Hank’s等溶液，优选为质量/体积百分比浓度 为0.85-0.9％的生理盐水。
所述分离液A可为质量/体积百分比浓度为5.5-6.5％的羟乙基淀粉溶液或质量/ 体积百分比浓度为0.45-0.55％的甲基纤维素溶液，优选为质量/体积百分比浓度为6 ％的羟乙基淀粉溶液。
所述分离液B可为密度为1.073g/mL的Percoll液或密度为1.077g/mL的聚蔗糖 -泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液(商品名Ficoll液)，优选为密度为1.073g/mL 的Percoll液。
所述细胞培养液A可为低糖DMEM液体培养基或DF12培养基，优选为低糖DMEM 液体培养基；细胞培养液B可为胎牛血清、新生牛血清或小牛血清，优选为胎牛血清。 所述由细胞培养液A和细胞培养液B组成的细胞培养液的使用方法可为：将细胞培养 液A与细胞培养液B按照9∶1的体积比混合。
为获得更好的培养效果，所述试剂盒中还可添加细胞培养液C，可为150-250mM L- 谷氨酰氨溶液，优选为200mM L-谷氨酰氨溶液。添加细胞培养液C后的细胞培养液的 使用方法可为：将细胞培养液A与细胞培养液B按照9∶1的体积比混合后，再加入 体积百分浓度为1.0％的细胞培养液C，混匀后即可。
所述细胞消化液A可为质量/体积百分比浓度为0.4-0.6％的胰蛋白酶液，优选为 质量/体积百分比浓度为0.5％的胰蛋白酶液。所述细胞消化液A的使用方法可为：将 细胞消化液A和稀释液按照1∶1的体积比混合。
此外，所述试剂盒还可添加细胞消化液B，如质量/体积百分比浓度为0.03-0.05 ％的EDTA溶液，优选为质量/体积百分比浓度可为0.04％的EDTA溶液。添加细胞消 化液B后的细胞消化液的使用方法可为：将细胞消化液A和细胞消化液B按照1∶1 的体积比混合。
本发明提供了一种用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒。在该试剂盒中，生理盐 水等试剂等稀释和/或洗涤液起到稀释和/或洗涤的作用，分离液A的作用是分离有核 细胞，去除红细胞，分离液B的作用是分离单个核细胞，细胞消化液的作用是细胞传 代培养时，消化贴壁的骨髓间充质干细胞。用该试剂盒可在较短时间(20-30天)内 获得大量的骨髓间充质干细胞(可达107数量级)，并具有使用方便、成本低廉的优 点，将在心血管疾病的治疗及相关研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度均为质量/ 体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液和洗涤液(简称稀释/洗涤液)均为：质量/体积百分比浓度为0.9 ％的生理盐水；
(2)分离液A为：质量/体积百分比浓度为6.0％的羟乙基淀粉溶液；
(3)分离液B为：密度为1.073g/mL的Percoll液，配制方法为：在无菌条件 下取Percoll原液9份，加入1份的1.5mmol/L的PBS，充分混匀，再取其中0.56份， 加入0.44份0.15mmol/L的PBS，充分混匀，得到密度为1.073g/mL的Percoll液 (Percoll原液购自Sigma公司)；
(4)细胞培养液：培养液A为低糖DMEM液体培养基(购自GIBCO公司)；培养 液B为胎牛血清；培养液C为200mM L-谷氨酰氨溶液；使用方法为：将细胞培养液A 与细胞培养液B按照9∶1的体积比混合后，再加入体积百分浓度为1％的细胞培养液 C，混匀后即可使用(使用前配制)；
(5)细胞消化液：细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.5％的胰蛋白酶液； 细胞消化液B为质量/体积百分比浓度为0.04％的EDTA溶液；使用方法为：将细胞消 化液A与细胞消化液B按照1∶1的体积比混匀后即可使用。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释/洗涤液6瓶(250mL/瓶)， 分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，培养液A 2瓶(225mL/瓶)， 培养液B 2瓶(25mL/瓶)，培养液C 2瓶(2.5mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶(25mL/ 瓶)，细胞消化液B 1瓶(25mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装， 包装后得到用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
现用步骤一的试剂盒制备骨髓间充质干细胞，具体制备方法包括以下步骤(所有 步骤均在洁净工作台中完成)：
1、骨髓单个核细胞的分离
1)将采集的骨髓置于500mL无菌的盐水瓶中，按1∶1的比例加入稀释液，充分 混匀，再按总体积比4∶1(分离液A)的比例加入分离液A，室温静置25min；
2)吸取上清至50mL无菌离心管中，4-8℃、1500rpm离心10min，弃上清，将所 有细胞集中于一个离心管中，再加入洗涤液补足体积至40mL，4-8℃、1500rpm离心 10min，弃上清，将此洗涤过程重复2次，然后用20mL或40mL洗涤液重悬细胞；
3)吸取提前预温至室温(20-25℃)的分离液B 20mL于50mL离心管中，将细胞 悬液沿管壁按照1∶1比例缓慢加入分离液B液面上，室温，1800rpm离心30min。
4)小心吸取中间层细胞，置于另一50mL离心管中，再加入洗涤液补足体积至40mL， 4℃、1500rpm离心10min，弃上清，将此洗涤过程重复3次；
5)用5mL细胞培养液重悬所有细胞，镜下计数及活细胞检定，结果分离的骨髓 单个核细胞细胞数达107个数量级。
2、骨髓间充质干细胞的体外培养扩增
1)将步骤1分离的骨髓单个核细胞按照0.8×106个/cm2接种于25cm2的培养瓶中， 置CO2培养箱中在37℃、5％CO2下静置培养48-72小时；
2)更换培养液：打开培养瓶口，倒掉培养液，加入5mL细胞培养液，置CO2培养 箱内在与步骤1)相同的条件下继续培养(依细胞生长的实际情况更换培养液)；
3)待培养瓶内细胞长至80％以上融合时，打开培养瓶口，吸弃培养液，加入5mL 洗涤液，充分洗涤，吸弃液体，加入2mL细胞消化液，待细胞完全变圆后，加入等量 的细胞培养液终止反应，收集细胞，计数；
4)分别按5.5×103个/cm2接种于25cm2的培养瓶中，每瓶加入5mL细胞培养液， 置CO2培养箱中在37℃、5％CO2下培养，此培养细胞为第一代骨髓单个核细胞(依细 胞生长的实际情况更换培养液)；
5)待培养瓶内细胞长至80％以上融合时，重复步骤3)；
6)分别按5.5×103个/cm2接种于75cm2的培养瓶中，置CO2培养箱中在37℃、5 ％CO2下培养，此培养细胞为第二代骨髓单个核细胞(依细胞生长的实际情况更换培养 液)；
7)待培养瓶内细胞长至80％以上融合时，重复步骤3)；
8)分别按5.5×103个/cm2接种于75cm2的培养瓶中，置CO2培养箱中在37℃、5 ％CO2下培养，此培养细胞为第三代骨髓单个核细胞。
9)培养72h后，取培养的第三代骨髓单个核细胞，重复步骤3)，将收集的细胞 用40mL洗涤液重悬，4-8℃、1500rpm离心10min，重复洗涤3次，得到骨髓间充质 干细胞。
用2mL稀释液(或洗涤液)重悬细胞，置于微量离心管中，计数，约为2.5×107个/mL，表明用本发明的试剂盒可在较短时间(20天)内获得大量的骨髓间充质干细 胞。
实施例2、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液和洗涤液(简称稀释/洗涤液)均为：PBS，配方为NaCl 0.8克，KCl0.2克，Na2HPO4·12H2O 2.9克，KH2PO4 0.2克，加去离子水定容至1000mL，高压灭菌；
(2)分离液A：质量/体积百分比浓度为0.5％的甲基纤维素溶液，配方为：将 0.5g甲基纤维素加入100mL质量/体积百分比浓度为0.9％的生理盐水中，高压灭菌 后，置于4℃，溶解后即可；
(3)分离液B：密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠(ficoll-hypaque)溶液 (商品名Ficoll液)；
(4)细胞培养液：培养液A：DF12培养基(购自GIBCO公司)；培养液B：新生 牛血清；培养液C：150mM L-谷氨酰氨；使用方法与实施例1相同(现用现配)；
(5)细胞消化液：细胞消化液A：质量/体积百分比浓度为0.6％胰蛋白酶液； 使用方法：将细胞消化液A与稀释液按照1∶1的体积比混合后即可。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释/洗涤液6瓶(250mL/瓶)， 分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，细胞培养液A 2瓶(225mL/ 瓶)，培养液B 2瓶(25mL/瓶)，培养液C 2瓶(2.5mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶 (25mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于制备骨髓 间充质干细胞的试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参照实施例1步骤二中的方法制备骨髓间充质干细胞，并用 相同方法对获得的骨髓单个核细胞计数，结果细胞数达约为2.2×107个/mL，表明用 本发明的试剂盒可在较短时间(约25天)内获得大量的骨髓间充质干细胞。
实施例3、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液和洗涤液(简称稀释/洗涤液)均为：Hank’s等溶液，配方为：NaCl8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·H2O 0.06g，KH2PO4 0.06g，NaHCO3 0.35g，加去离子水定容为 1000mL，高压灭菌后，4℃保存；
(2)分离液A：质量/体积百分比浓度为0.55％的甲基纤维素溶液；
(3)分离液B：密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液；
(4)细胞培养液：细胞培养液A：低糖DMEM液体培养基；细胞培养液B：新生 牛血清；使用方法为：将细胞培养液A与细胞培养液B按照9∶1的比例充分混合；
(5)细胞消化液：细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.4％的胰蛋白酶液； 细胞消化液B为质量/体积百分比浓度为0.05％的EDTA溶液；使用方法为：将细胞消 化液A与细胞消化液B按照1∶1的体积比混匀后即可使用。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释/洗涤液6瓶(250mL/瓶)， 分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，细胞培养液A 2瓶(225mL/ 瓶)，细胞培养液B 1瓶(25mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶(25mL/瓶)，细胞消化 液B 1瓶(25mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于 制备骨髓间充质干细胞的试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参照实施例1步骤二中的方法制备骨髓间充质干细胞，并用 相同方法对获得的骨髓单个核细胞计数，结果细胞数约为2.0×107个/mL，表明用本 发明的试剂盒可在较短时间(约28天)内获得大量的骨髓间充质干细胞。
实施例4、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液为：质量/体积百分比浓度为0.85％的生理盐水；
(2)洗涤液为：PBS；
(3)分离液A：质量/体积百分比浓度为5.5％的羟乙基淀粉溶液；
(4)分离液B：密度为1.077g/mL的聚蔗糖-泛影酸钠溶液；
(5)细胞培养液：细胞培养液A为低糖DMEM液体培养基；细胞培养液B为小牛 血清；细胞培养液C为250mM L-谷氨酰氨溶液；使用方法与实施例1相同；
(6)细胞消化液：细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.6％的胰蛋白酶液； 细胞消化液B为质量/体积百分比浓度为0.03％的EDTA溶液；使用方法与实施例1相 同。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤 液5瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(40mL/瓶)，细 胞培养液A 2瓶(225mL/瓶)，细胞培养液B 2瓶(25mL/瓶)，细胞培养液C 2瓶 (2.5mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶(25mL/瓶)，细胞消化液B 1瓶(25mL/瓶)。 按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于制备骨髓间充质干细胞的 试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参照实施例1步骤二中的方法制备骨髓间充质干细胞，并用 相同方法对获得的骨髓单个核细胞计数，结果细胞数约为1.8×107个/mL，表明用本 发明的试剂盒可在较短时间(约30天)内获得大量的骨髓间充质干细胞。
实施例5、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液为：Hank’s液；
(2)洗涤液为：质量/体积百分比浓度为0.85％的生理盐水；
(3)分离液A：质量/体积百分比浓度为6.5％的羟乙基淀粉溶液；
(4)分离液B：密度为1.073g/mL的Percoll液；
(5)细胞培养液：细胞培养液A为DF12培养基；细胞培养液B为胎牛血清；使 用方法为：将细胞培养液A与细胞培养液B按照9∶1的体积比混合后即可使用(使 用前配制)；
(6)细胞消化液：细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.5％的胰蛋白酶液； 使用方法与实施例2相同。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤 液5瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(30mL/瓶)，细 胞培养液A 2瓶(225mL/瓶)，细胞培养液B 2瓶(25mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶 (25mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于制备骨髓 间充质干细胞的试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参照实施例1步骤二中的方法的制备骨髓间充质干细胞，并 用相同方法对获得的骨髓单个核细胞计数，结果细胞数约为2.2×107个/mL，，表明 用本发明的试剂盒可在较短时间(约23天)内获得大量的骨髓间充质干细胞。
实施例6、用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒的制备及其分离效果检测
一、制备用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒
1、溶液配制
本发明用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒包括以下试剂：
(1)稀释液为：PBS；
(2)洗涤液为：Hank’s液；
(3)分离液A：质量/体积百分比浓度为0.45％的甲基纤维素溶液；
(4)分离液B：密度为1.073g/mL的Percoll液；
(5)细胞培养液：细胞培养液A为DF12培养基；细胞培养液B为小牛血清；培 养液C为200mM L-谷氨酰氨溶液；使用方法与实施例1相同；
(6)细胞消化液：细胞消化液A为质量/体积百分比浓度为0.4％的胰蛋白酶液； 使用方法与实施例2相同。
2、各组分的分装
试剂盒的规格为1次/盒，每盒中各组分的量为：稀释1瓶(250mL/瓶)，洗涤 液5瓶(250mL/瓶)，分离液A 1瓶(100mL/瓶)，分离液B 1瓶(30mL/瓶)，细 胞培养液A 2瓶(225mL/瓶)，细胞培养液B 2瓶(25mL/瓶)，细胞培养液C 2瓶 (2.5mL/瓶)，细胞消化液A 1瓶(25mL/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进 行分装，包装后得到用于制备骨髓间充质干细胞的试剂盒。
二、骨髓间充质干细胞的制备
用步骤一的试剂盒，参照实施例1步骤二中的方法制备骨髓间充质干细胞，并用 相同方法对获得的骨髓单个核细胞计数，结果细胞数约为2.5×107个/mL，表明用本 发明的试剂盒可在较短时间(约22天)内获得大量的骨髓间充质干细胞。