一种检测七星瓢虫的引物对、试剂盒及检测方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103436617 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103436617 A *CN103436617A* (21)申请号 201310373403.6 (22)申请日 2013.08.23 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 杨帆 王倩 陆宴辉 徐建祥 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 (54) 发明名称 一种检测七星瓢虫的引物对、 试剂盒及检测 。

2、方法 (57) 摘要 本发明涉及一种检测七星瓢虫的引物对， 所 述引物对序列如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所 示。本发明还涉及含有所述引物对的试剂盒及用 引物对和试剂盒检测七星瓢虫的检测方法。本发 明的检测方法简单、 快速、 特异、 灵敏。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103436617 A CN 103436617 A *CN103436617A* 1/1 页 2 1. 。

3、一种用于检测七星瓢虫的引物对， 其特征在于， 所述引物对序列如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示的序列。 2. 含有权利要求 1 所述引物对的试剂盒。 3.一种检测七星瓢虫的方法， 其特征在于， 包括用权利要求1的引物对进行PCR扩增的 步骤。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 从样品中提取基因组 DNA 为模板 ； 利用权 利要求1所述的引物对作为PCR扩增的引物， 进行PCR扩增， 得到扩增产物 ； 检测扩增产物， 并作出判断。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的方法， 其特征在于， PCR 反应体系为 20L， 其中 10EasyTaq bu。

4、ffer2.0L、 dNTP（2.5mM） 0.4L、 EasyTaq 聚合酶 （5U/L） 0.2L、 上游 引物和下游引物 （10p/mol） 各 0.4L、 样品基因组 DNA1.0L、 超纯水 15.6L。 6. 根据权利要求 3 或 4 所述的方法， 其特征在于， PCR 扩增程序为 94预变性 4min ； 94变性 30s、 54退火 30s、 72延伸 30s， 40 个循环。 7. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 所述的检测扩增产物是采用电泳检测， 出 现 189bp 左右的特异性扩增条带即判断为检出七星瓢虫。 8. 权利要求 1 所述的引物对在检测七星瓢虫中的。

5、应用。 9. 权利要求 2 所述的试剂盒在检测七星瓢虫中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103436617 A 2 1/6 页 3 一种检测七星瓢虫的引物对、 试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体而言， 涉及用于检测七星瓢虫的引物对、 试剂盒及 其检测方法。 背景技术 0002 七星瓢虫Coccinella septempunctata L.是一种鞘翅目瓢虫科捕食性天敌昆虫， 成虫和幼虫可捕食麦蚜、 棉蚜、 槐蚜、 桃蚜、 介壳虫、 壁虱等害虫， 减轻树木、 瓜果及各种农作 物遭受害虫的损害， 被人们称为 “活农药” 。 除了冬季外， 户外有蚜虫发生的地方均。

6、有机会找 到前来觅食的七星瓢虫成虫， 但其较少成群聚集。一年发生多代， 以成虫过冬， 次年 4 月出 蛰， 产卵于有蚜虫的植物上。分布范围广， 在中国 （北京、 河北、 黑龙江、 吉林、 河南、 陕西、 甘 肃、 新疆、 西藏、 云南、 贵州、 四川、 湖北、 湖南、 浙江、 福建、 广东、 广西、 海南、 台湾等） 、 蒙古、 朝鲜、 日本、 印度、 前苏联、 古北区、 欧洲都有它的踪迹。 0003 七星瓢虫成虫体长 ： 5.2-7.0mm， 体宽 ： 4.0-5.6mm。 体周缘卵形， 背面光滑无毛。 头 黑色。 前胸背板黑色， 在其前角上各有一个大型近于四边形的淡黄色斑， 伸展到缘折上形。

7、成 窄条。小盾片黑色。鞘翅红色或橙红色， 两鞘翅上共有 7 个黑斑， 其中位于小盾片下方的小 盾斑被鞘翅分割为两边一半， 其余每一鞘翅上各有 3 个黑斑。鞘翅基部靠小盾片两侧各有 一个小三角形的白斑。七星瓢虫以鞘翅上有 7 个黑色斑点而得名。每年发生世代数因地区 不同而异。例如， 在河南安阳地区每年发生 6-8 代。北方寒冷地区， 发生世代数则较少。七 星瓢虫成虫寿命长， 平均 77 天。1 头七星瓢虫雌虫可产卵 567-4475 粒， 平均每天产卵 78.4 粒， 最多可达 197 粒。七星瓢虫取食量大小与气温和猎物密度有关。以捕食蚜虫为例， 在猎 物密度较低时， 捕食量随密度上升而呈指数增。

8、长 ； 在密度较高时， 捕食量则接近极限水平。 较高的气温可影响七星瓢虫的活动能力， 提高其捕食率。 据统计， 不同虫态七星瓢虫对烟蚜 的平均日取食量分别为 ： 1 龄 10.7 头， 2 龄 33.7 头， 3 龄 60.5 头， 4 龄 124.5 头， 成虫 130.8 头。 七星瓢虫近80天的生命期可取食上万头蚜虫。 七星瓢虫对人、 畜和天敌动物无毒无害， 作为农田重要的天敌昆虫， 其合理利用可减轻农药使用， 减少环境污染， 取得良好的经济和 生态效益。早在 20 世纪 70 年代黄河下游地区即已用助迁法利用七星瓢虫防治棉花和小麦 蚜虫， 90 年代开始人工繁殖， 并用于生产。 000。

9、4 瓢虫种类全世界记载约 500 属 5000 种， 中国已记录近 400 种。种类繁多且仅根 据形态描述准确判断瓢虫种类有一定的难度。此外， 不同瓢虫间还普遍存在集团内捕食的 现象， 但常规的肠道解剖、 行为观察等方法无法准确评估这种重要的捕食关系。因此要更 好地鉴定瓢虫种类及研究瓢虫的集团内捕食作用， 需要建立一套快速而准确的分子检测 方法， 但目前对于七星瓢虫尚没有标准的检测方法。聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction,PCR） 技术可根据物种特异性引物清楚区分至种， 以其特异性强、 灵敏度高、 简便 快速的特点在物种种类鉴定中占据重要地位。 发明内容 说 。

10、明 书 CN 103436617 A 3 2/6 页 4 0005 本发明要解决的技术问题是 ： 提供一种快速、 简单、 特异且灵敏地检测七星瓢虫的 鉴定方法。 0006 为了实现本发明的目的， 本发明首先提供一种用于检测七星瓢虫的引物对， 所述 引物对序列如 SEQ ID No.1 和 SEQ ID No.2 所示的序列。 0007 本发明还提供一种含有SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的引物对的试剂盒。 0008 本发明还提供一种检测七星瓢虫的方法， 包括用所述引物对或者含所述引物对的 试剂盒进行 PCR 扩增的步骤。 0009 具体步骤为， 从样品中提取基因组 DNA。

11、 为模板 ； 利用所述引物对或者含所述引物 对的试剂盒中的引物对作为PCR扩增的引物， 进行PCR扩增， 得到扩增产物 ； 检测扩增产物， 并作出判断。 0010 所述 PCR 反应体系为 20L， 其中 10EasyTaq buffer2.0L、 dNTP（2.5mM） 0.4L、 EasyTaq 聚合酶 （5U/L） 0.2L、 上游引物和下游引物 （10p/mol） 各 0.4L、 样品 基因组 DNA1.0L、 超纯水 15.6L。 0011 所述 PCR 扩增程序为 94预变性 4min ； 94变性 30s、 54退火 30s、 72延伸 30s， 40 个循环。 0012 所述检。

12、测扩增产物是采用电泳检测， 出现 189bp 左右的特异性扩增条带即判断为 检出七星瓢虫。 0013 本发明提供了前述引物对及试剂盒在检测七星瓢虫中的应用。 0014 本发明引物对是通过通用引物对 LepF1(ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG) 和 LepR1( TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA) 扩增不同瓢虫线粒体细胞色素氧化酶 I 亚基 （cytochrome oxidase subunit I， COI） 基因序列进行比对设计得到。 0015 使用本发明的引物对， 能够特异、 灵敏地扩增出目的片段。 0016 使用本发明的引物对进行检测， 实施例显示。

13、， 只有七星瓢虫特异性产生 189bp 的 扩增条带， 其他 58 种近源种、 属瓢虫以及其他昆虫均未产生 189bp 的扩增条带。结果表明 建立的 PCR 方法具有良好的特异性， 可用于七星瓢虫的检测。 0017 使用本发明的引物对进行检测， 可从七星瓢虫 DNA 浓度为 0.375ng/L 的样品中 成功检测出七星瓢虫。具有较高的灵敏度， 符合日常检测的要求。 0018 使用本发明的引物对进行检测， 具有灵敏度高、 特异性强的特点 ； 本发明的 PCR 检 测方法， 具有高效、 快速和敏感性高的优点。 附图说明 0019 图 1 为七星瓢虫引物 CsF6/R6 特异性检测琼脂凝胶电泳图 （。

14、1-114 为棉田常见昆 虫模板 ； M ： DNA 分子量标准 2000bp ladder ； : 阴性对照 )。 0020 图 2 为七星瓢虫引物 CsF6/R6 质粒浓度梯度检测琼脂凝胶电泳图 （1-7 为模板 质粒浓度 1.385541649E+07 依次 10 倍稀释浓度梯度 ； : 阴性对照 ； M ： DNA 分子量标准 2000bp ladder)。 0021 图 3 为七星瓢虫引物 CsF6/R6DNA 浓度梯度检测琼脂凝胶电泳图 （1-7 为模板 DNA 浓度 3ng/L 依次 2 倍稀释浓度梯度 ； : 阴性对照 ； M ： DNA 分子量标准 2000bp ladder。

15、)。 说 明 书 CN 103436617 A 4 3/6 页 5 具体实施方式 0022 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0023 实施例 1 检测引物 CsF6/R6 对七星瓢虫的扩增效果 0024 （1） 瓢虫模板 DNA 的制备 0025 将单头瓢虫放入 1.5ml 离心管中将其磨碎， 用 TIANamp Genomic DNA Kit 血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试剂盒 （离心柱型） （天根生物 （北京） 有限公司） 提取单头瓢虫 基因组。 0026 （2） 合成检验七星瓢虫的特异性 COI 引物 0027 本发明引物对是通过通用引物对 Lep。

16、F1(ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG) 和 LepR1( TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA) 扩增不同瓢虫线粒体细胞色素氧化酶 I 亚基 （cytochrome oxidase subunit I， COI） 基因序列进行比对设计得到。 0028 设计得到检验七星瓢虫的特异性 COI 引物对 ： 0029 Primer CsF6:5 -AATATACGACCATTTGGC-3 0030 Primer CsR6:5 -TTGATAAAGGATGGGATCT-3 0031 （3） 进行 PCR 扩增反应 0032 1） 反应体系 0033 反 应 体 系 为。

17、 20L， 其 中 10EasyTaq buffer2.0L、 dNTP（2.5mM） 0.4L、 EasyTaq 聚 合 酶 （5U/L） 0.2L、 上 游 引 物 和 下 游 引 物 （10p/mol）各 0.4L、 模 板 DNA1.0L、 超纯水 15.6L。 0034 2） PCR 扩增程序 0035 本发明 PCR 扩增程序为 94预变性 4min ； 94变性 30s、 54退火 30s、 72延伸 30s， 40 个循环。 0036 （4） 鉴定 PCR 产物 0037 取 10L 产物用 1.0%（重量 / 体积） 琼脂糖凝胶电泳分离， 经溴化以锭染色后于 凝胶成像系统根据。

18、扩增产物的大小判定结果。 0038 （5） 实施结果 0039 利用引物 CsF6/CsR6 以七星瓢虫基因组 DNA 为模板， 以常见瓢虫以及其他昆虫种 类 （见表 1） 为对照进行 PCR 扩增， 扩增结果见图 1。从图 1 中可以看到， 利用引物 CsF6/CsR6 扩增后， 在 1、 2 泳道的七星瓢虫中扩增出了 189bp 的目的条带， 在其他 3-114 泳道中均无扩 增产物。说明本发明的特异性 PCR 引物 CsF6/CsR6 的特异性强。扩增出的 189bp 片段的核 苷酸序列如 SEQ ID No.3 所示。 0040 表 1 引物种特异性检验中所用的昆虫种类 0041 说 。

19、明 书 CN 103436617 A 5 4/6 页 6 0042 说 明 书 CN 103436617 A 6 5/6 页 7 0043 实施例 2 引物 CsF6/CsR6 对七星瓢虫最低检出量的测定 0044 （1） 七星瓢虫模板 DNA 的制备 说 明 书 CN 103436617 A 7 6/6 页 8 0045 按实施例 1 提取单头七星瓢虫成虫基因组 DNA。然后原模板溶液以 2 倍进行递减 梯度稀释至检测不出条带， 取 1L 作为 PCR 扩增的模板， 直接加到 PCR 反应体系中。 0046 （2） 合成检验七星瓢虫的特异性 COI 引物， 引物核苷酸序列与实施例 1 相同。。

20、 0047 （3） 进行 PCR 扩增反应， 反应体系和 PCR 扩增程序同实施例 1。 0048 （4） 鉴定 PCR 产物， 鉴定方法同实施例 1。 0049 （5） 实施结果 0050 利用引物 CsF6/CsR6 做最低检出量的测定， 以不同稀释倍数的七星瓢虫质粒浓度 及基因组DNA为模板进行PCR扩增， 模板质粒浓度检出限 （拷贝数） 为1.385541649E+05、 DNA 浓度检出限 0.375ng/L（图 2、 3） 。 0051 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103436617 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103436617 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 103436617 A 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 103436617 A 11 2/2 页 12 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103436617 A 12 。