6－羟基－3－4－2－哌啶－1－基乙氧基苯氧基－2－4－甲氧基苯基苯并B噻吩盐酸盐的新晶形.pdf

下述实施例进一步举例说明制备本发明水合物的方法。这些实施
例不是、并且也不应当理解为以任何方式对本发明方法范围的限制。

实施例

实施例1
用6-异丙氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基
苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐制备F-Ⅲ

在-10℃--20℃、氮气氛下，以将反应温度维持在-10℃以下的
速度把BCl_3(g)(4．23g，34mmol)加到6-异丙氧基-3-(4-[2-(哌啶
-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐(10
g，18mmol)的二氯甲烷溶液(100ml)中。加入完成后，将该反应
混合物搅拌2小时。在低于-10℃温度下，把异丙醇(IPA，12．35ml，
167mmol)缓慢地加到该反应混合物中，继续搅拌30分钟。把一个
分液瓶中置于100ml水，并用冰浴冷却至约0℃。通过套管将产物溶
液转移到水中，同时维持剧烈搅拌。将所得白色浆状液在0℃搅拌1
小时。通过过滤、并依次用25ml 40％CH₂Cl₂／水和25ml冷水洗涤
来回收产物。把产物悬浮在60ml IPA和60ml水中，并加热至60
℃。在48℃获得了溶液。再加入水(120ml)。将该溶液冷却至35
℃，把该浆状液进一步缓慢地冷却至0-5℃，搅拌数小时。通过过滤
并用冷的去离子水(25ml)洗涤来分离产物。将F-Ⅲ湿滤饼在50
℃真空干燥12-24小时至恒定重量，获得了F-Ⅲ。

实施例2
用6-苄氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯
基)苯并[b]噻吩-(S-氧化物)制备F-Ⅲ

在室温，将去离子水(5．25ml)、1M盐酸(7．74ml，7．75mmol)、
10％Pd／C(A32110型、1．37g，1．29mmol Pd)、6-苄氧基-3-(4-
[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩-
(S-氧化物)(3g，5．16mmol)、和异丙醇(32ml)加到250mL Parr
瓶中。将该瓶安放在Parr震动器上，然后抽空并充氮气两次，之后
再抽空并充入氢气至压力为30psig。启动该震动器并把该反应混合
物加热至60℃。大约4小时后，通过HPLC分析确定反应完全。将该
反应混合物经由硅藻土垫过滤，把该滤垫用0．1M盐酸(2×10ml)
洗涤。将溶剂在约50℃真空除去。把所得残余物溶于50％异丙醇／去
离子水(30ml)，在蒸汽浴中轻微加热直至获得溶液。向该溶液中
加入去离子水(22ml)，将该溶液冷却至室温。把产物浆状液进一
步冷却至0℃。通过过滤分离产物，用冷的去离子水(2×15ml)洗
涤，在50℃真空干燥至恒定重量，获得了F-Ⅲ。

实施例3
用[6-异丙氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基
苯基)]苯并[b]噻吩-(S-氧化物)制备F-Ⅲ

将二氯甲烷(105L)和[6-异丙氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧
基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)]苯并[b]噻吩-(S-氧化物)(10．5
kg)合并，并冷却至-15℃--20℃。加入三氯化硼(4．6kg)，同时
将反应温度维持在-10--20℃。连续搅拌直至通过HPLC分析原料的
面积％小于1％为止。HPLC系统(4．6mmID×25cm Zorbax SB-Phenyl
柱30℃，70∶30甲醇：0．01 N硫酸；流速1．5ml／分钟；在300nm
处检测)。加入异丙醇(10．28kg)，同时将反应温度维持在-10-
-20℃。将该反应混合物搅拌30-45分钟。通过将该反应混合物加入
到105L预冷却至2-7℃的水中来分离反应粗产物，同时将反应温度
维持在2-7℃。然后用预冷却至2-7℃的二氯甲烷(20L)洗涤。
把该结晶浆状液搅拌2-3小时，过滤，依次用预冷却至2-7℃的二
氯甲烷(26kg)和预冷却至2-7℃的水(53L)洗涤。将粗产物滤
饼与水(42L)和异丙醇(40L)混合，并加热至65-70℃以使溶解
完全。将该热溶液过滤。然后用加热至65-70℃的异丙醇(20L)与
水(21L)的混合物洗涤，之后用预加热至65-70℃的水(126L)
洗涤。将该溶液冷却至40-45℃，加入晶种，并在该温度下搅拌2-
3小时以使晶体生长。将该浆状液冷却至0-5℃，搅拌3-4小时，
过滤。将滤饼用预冷却至2-7℃的水(122．6L)洗涤。将产物在最
高50℃温度下真空干燥直至滤饼重量在2-4小时期间内的变化不到
0．05kg为止。产量：8．468kg(87．3％)。HPLC效能：98．5％。
卡尔·费歇尔法测定的水含量：3．0％。通过HPLC测定的总相关物质：
1．79％。

实施例4
用[6-苄氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯
基)]苯并[b]噻吩-(S-氧化物)制备F-Ⅲ

将四氢呋喃(261ml)、水(45ml)、浓硫酸(6．14g)、和
[6-苄氧基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯
基)]苯并[b]噻吩-(S-氧化物)(HPLC效能为99％，HPLC总相关物质
水平为0．35％)合并，并搅拌直至均匀。加入10％Pd／C(5．6g在
22ml水中的浆状液)，用5ml水洗涤。将所得浆状液抽空，充入
60psi氢气。将反应温度调节至30℃。2小时后，加入10％Pd／C(5．6
g)和水(30ml)。在30℃和60psi再继续氢化22小时。加入在
30ml水中的4．40g 10％Pd／C，在30℃和60psi再继续氢化2．5
小时。通过过滤除去催化剂，用50％氢氧化钠把滤液pH调节至7．24。
加入溶解在水(18ml)中的氯化钠(8．66g)，将该两相溶液搅拌
30分钟。分离各相，用50ml四氢呋喃萃取水相。合并有机相，通过
常压蒸馏浓缩至50ml体积。在24℃用1小时向该浓缩液中加入180
ml甲醇。把所得结晶浆状液在24℃搅拌30分钟，冷却至0℃并搅拌
1小时。通过过滤分离固体，依次用39ml水和39ml甲醇洗涤，然
后在50℃真空干燥过夜。产量：15．52g(67．8％)

将异丙醇(33ml)、水(66ml)和10g上面分离的固体合并。
在25℃，向该搅拌的混合物中加入1．8M HCl(21ml)。固体迅速
地溶解，之后又再沉淀成盐酸盐。搅拌30分钟后，将该浆状液加热
至70℃以使固体全部溶解。把该溶液冷却至60℃，加入33ml水。
用3小时把所得溶液冷却至25℃，期间沉淀出了盐酸盐。把该浆状液
在25℃搅拌大约3小时，过滤，用水(30ml)洗涤，在50℃真空干
燥过夜，获得了8．9g(82．7％)F-Ⅲ。HPLC效能：96．5％。卡尔·费
歇尔法测定的水含量：2．44％。HPLC相关物质：1．09％。

实用性

本说明书所用术语“有效量”是指，能有效地抑制本文所述病症、
或病症有害影响的F-Ⅲ的量。当F-Ⅲ与雌激素、孕激素、芳香酶
抑制剂、LHRH类似物、或AChE抑制剂联合给药时，术语“有效量”
也表示能实现其预定作用的该活性剂的量。

术语“抑制”包括其通常含义，即预防、阻止、遏制、减轻、改
善、减缓、停止、或逆转本文所述病症或其后遗症的发展或严重性。

本说明书所用术语“预防”“防止”和“阻止”是指，降低F-Ⅲ
接受者患有或发生本文所述病症或其后遗症的可能性。

术语“缺乏雌激素”和“雌激素缺乏”是指，天然发生或临床招
致的、女性不能产生足够内源性雌激素来维持依赖于雌激素的功能例
如月经、骨质内环境稳定、神经功能、心血管功能等的病症。这种雌
激素缺乏情境是由于下述原因、但不限于下述原因引起的：绝经、手
术或化学卵巢切除术，包括其功能同等事件，例如用芳香酶抑制剂、
GnRH激动剂或拮抗剂、ICI 182780等进行药物治疗。与雌激素缺乏
有关的病症包括但不限于：骨损失、骨质疏松、心血管疾病和高血脂。

本说明书所用术语“雌激素”包括具有雌激素活性的甾体化合
物，例如17β-雌二醇、雌酮、共轭雌激素(Premarin^)、马雌激素
17β-乙炔基雌二醇等。优选的基于雌激素的化合物是Premarin^和异
炔诺酮。

本说明书所用术语“孕激素”包括具有促孕活性的化合物，例如
孕酮、异炔诺酮、nongestrel、乙酸甲地孕酮、炔诺酮等。炔诺酮是
优选的基于孕激素的活性剂。

本说明书所用术语“芳香酶抑制剂”包括能抑制芳香酶的化合
物，例如市售芳香酶抑制剂如氨鲁米特(aminoglutemide)
(CYTANDREN^)、Anastrazole(ARIMIDEX^)、来曲唑(FEMARA^)、
福美司坦(LENATRON^)和依西美坦(AROMASTIN^)等。

本说明书所用术语“LHRH类似物”是指能在绝经前妇女中抑制雌
激素生成的黄体生成素释放激素类似物，包括例如性瑞林
(ZOLADEX^)和亮丙瑞林(LUPRON^)等。

本说明书所用术语“AChE抑制剂”包括能抑制乙酰胆碱酯酶的化
合物，例如水杨酸毒扁豆碱、盐酸他克林、盐酸donepezil等。

术语“上调ChAT”是指增加ChAT的酶活性，即促进胆碱转化成
乙酰胆碱。该促进包括提高ChAT与胆碱反应的效率和／或速度，和／
或提高ChAT在反应位点存在的量。酶存在量的增加可能是由于基因
调控、或酶形成的其它合成步骤和／或该酶的失活和代谢下降。
选择的实验方法

常规大鼠制备方法：从Charles River Laboratories(Portage，
MI)获得75天大小(除非另外指出)的雌性Sprague Dawley大鼠重
200-250g。在Charles River Laboratories中，将大鼠两侧卵巢
切除(OVX)，或进行Sham手术操作，1周后用船运送。到达后，把
大鼠放置在悬挂的金属笼子中，每个笼子放3只或4只，使它们能随
意摄取食物(钙含量约为0．5％)和水，放置1周。将房间温度保持
在22．2±1．7℃，最小相对湿度为40％。房间光周期为12小时光照
和12小时黑暗。

给药方案组织收集：经过1周的新环境适应后(因此是OVX2周
后)，开始用F-Ⅲ每天给药。除非另外指出，否则17α-乙炔基雌
二醇或F-Ⅲ是作为在1％羧甲基纤维素中或溶解在20％环糊精中的
悬浮液而口服给药的。对大鼠每天给药，给药4天。该给药方案进行
完后，将大鼠称重，用氯胺酮∶甲苯噻嗪(2∶1，体积比)混合物麻醉，
通过心脏穿刺采集血样。然后通过用CO₂窒息把大鼠处死，通过中线
切口取出子宫，测定子宫湿重。17α-乙炔基雌二醇得自Sigma
Chemical Co．，St．Louis，MO。
心血管疾病／高血脂

将上述血样在室温凝结2小时，以3000rpm离心10分钟后获得
了血清。用Boehringer Mannheim Diagnostics高效胆固醇分析测
定血清胆固醇。简言之，将胆固醇氧化成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化
氢。然后在过氧化酶存在下将过氧化氢与苯酚和4-氨基安替比林反
应，以生成对醌亚胺染料，通过分光光度计在500nm读取对醌亚胺
浓度。然后通过标准曲线计算胆固醇浓度。整个分析都是用Biomek
Automated Workstation自动进行的。
子宫嗜酸性细胞过氧化酶(EPO)分析

将上述子宫保持在4℃直至开始进行酶法分析。然后将子宫在50
体积50mM含有0．005％Triton X-100的Tris缓冲液(pH=8．0)
中匀化。加入在Tris缓冲液中的0．01％过氧化氢和10mM邻苯二胺
(终浓度)，在450nm监测1分钟吸收度的增加。子宫中存在嗜酸
性细胞是化合物雌激素活性的指征。通过反应曲线的初始直线部分确
定15秒间隔的最大速度。
抑制骨损失(骨质疏松)的测试方法

进行完上述常规制备操作后，将大鼠每天都进行治疗，治疗35
天(每个治疗组包含6只大鼠)，在第36天通过用CO₂窒息把大鼠处
死。35天时间足以使按本说明书所述方法测定的骨密度有最大减小。
在处死时，取出子宫，解剖掉外部组织，在测定湿重之前将流体内容
物排出，以确定与完全子宫切除有关的雌激素缺乏。由于子宫切除，
子宫重量通常下降了约75％。然后将子宫置于10％中性缓冲福尔马
林中，以随后进行组织学分析。

切除右股骨，用X-射线进行数字化分析，在远侧干骺端通过图象
分析程序(NIH图象)进行分析。也通过定量计算机断层扫描来扫描
胫骨邻面。依据上述操作，将在20％羟基丙基β-环糊精中的F-Ⅲ
或乙炔基雌二醇(EE₂)对测试大鼠口服给药。F-Ⅲ还用于和雌激素
或孕激素联合给药。
MCF-7增殖分析

将MCF-7乳腺癌细胞(ATCC HTB 22)保持在补充有10％胎牛血
清(FBS)(V／V)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、HEPES{(N-[2-
羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸]10mM}、非必需氨基酸和牛胰岛素(1
ug／ml)(维持培养基)的MEM(最低必需培养基，不含酚红，Sigma，
St．Louis，MO)中。在分析前10天，将MCF-7细胞转换成补充有
10％用葡萄糖被覆盖活性炭脱色的胎牛血清(DCC-FBS)的维持培养
基来代替10％FBS，以耗尽甾体化合物内贮存。用细胞解离培养基(补
充有10mM HEPES和2mM EDTA的不含Ca⁺⁺／Mg⁺⁺的HBSS(不含酚红))
将MCF-7细胞从维持瓶中取出。用分析培养基将细胞洗涤2次，并调
节至80000个细胞／ml，将大约100ml(8000个细胞)加到平底微培
养孔(Costar 3596)中，在37℃、5％CO₂潮湿恒温箱中培养48小时，
以使细胞转移后粘着和平衡。在分析培养基中制备系列稀释的药物或
作为稀释剂对照的DMSO，将50ml转移到微培养基中(一式三份)，
然后加入50mL分析培养基以使终体积为200ml。在5％CO₂潮湿恒
温箱中再培养48小时后，将微培养基用含氚胸腺嘧啶核苷(1uCi／
孔)脉冲4小时。通过在-70℃冷冻24小时来终止培养，然后用Skatron
Semiautomatic Cell Harvester融解并收集微培养基。用Wallac
BetaPlace β计数器通过液体闪烁来把样本计数。
DMBA-诱导的乳腺癌抑制

在购自Harlan Industries，Indianapolis，Indiana的雌性
Sprague-Dawley大鼠中产生依赖于雌激素的乳腺癌。使55天大小的
大鼠单次口服20mg 7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)。口服DMBA6
周后，以每周一次的间隔触诊乳腺以确定肿块外观。每当出现一个或
多个肿块时，用度量卡尺测定每一肿块的最长和最短直径，记录测量
值，选择该大鼠进行实验。为了使治疗组和对照组中肿块大小均匀分
配，将平均大小的肿块在测试组间均等地分布。对于每一实验，对照
组和测试组包含5-9只大鼠。

将F-Ⅲ通过在2％阿拉伯胶中经由腹膜内注射或口服给药。将
口服给药的化合物溶解或悬浮在0．2ml玉米油中。对每一测试动物
每天进行一次包括阿拉伯胶和玉米油治疗在内的治疗。初始肿块测量
和测试动物选择之后，通过上述方法每周测量肿块。大鼠的治疗和测
定持续3-5周，在结束时测定肿决的最终面积。对于每一化合物和
对照治疗，测定平均肿块面积的变化。
子宫纤维变性测试方法
测试1：对患有子宫纤维变性的3-20个妇女给予F-Ⅲ。该化合物
的给药量为0．1-1000mg／天，给药期间为3个月。在给药期间和停
止给药后高达3个月内观察这些妇女，以确定对子宫纤维变性的影
响。
测试2：采用与测试1相同的方法，只是给药期间为6个月。
测试3：采用与测试1相同的方法，只是给药期间为1年。
测试4：采用长期雌激素刺激来在性成熟雌性豚鼠中诱导平滑肌瘤。
给豚鼠每周注射3-5次雌二醇，注射2-4个月或者直至长出肿瘤为
止。每天给予F-Ⅲ或载体来进行治疗，治疗3-16周，然后把豚鼠
处死，取出子宫并分析肿瘤消退。
测试5：将人平滑肌瘤组织植入性成熟、去生殖腺、雌性、裸小鼠的
腹膜腔和／或子宫肌层。补给外源性雌激素以诱导该移植组织生长。
在某些情况下，在移植前将收集的肿瘤细胞体外培养。以日基础通过
胃灌法进行F-Ⅲ或载体治疗，治疗3-16周，取出移植物，测定其
生长或消退。在处死时，取出子宫以确定该器官的情况。
测试6：收集人子宫纤维瘤组织并体外保存以作为初始非转化培养
物。将手术样本通过无菌网或筛，或者挑开除去周围组织，以制备单
细胞悬浮液。将细胞保持在含有10％血清和抗生素的培养基中。测定
在和不在雌激素存在下的生长速度。分析细胞产生补体组分C3的能
力，和它们对生长因子和生长激素的反应。评定用孕激素、GnRH、
F-Ⅲ、和载体治疗后体外组织的增殖反应。每周评定甾体激素受体
的水平，以测定在体外是否保持重要的细胞特征。使用取自5-25名
患者的组织。
测试7：基本上按照Fuchs-Young等人“通过选择性雌激素受体调节
剂抑制雌激素刺激的子宫平滑肌瘤生长”，Mol．Car．，17(3)：151-
159(1996)的方法(该文献引入本发明以作参考)，测定F-Ⅲ抑制
雌激素刺激的衍生自平滑肌瘤的ELT细胞系增殖的能力。
子宫内膜异位测试方法
测试1：使用12-30只成年CD株系雌性大鼠作为测试动物。将它们
分成等数量的3组。监测所有动物的动情周期。在动情前期这天，对
每一雌鼠进行手术。切除每一组中雌鼠的子宫左侧角，切成小方块，
将小方块在邻近肠系膜血流的不同位点宽松地缝合。此外，切除第2
组雌鼠的卵巢。从手术后那天开始，给第1组和第2组雌鼠腹膜内注
射水，注射14天，在相同期间内，给第3组雌鼠腹膜内注射1．0mg／kg
体重的F-Ⅲ。治疗14天后，将每一雌鼠处死，取出子宫内膜外植体、
肾上腺、剩余子宫、和卵巢(如果有的话)，并制备以进行组织学检
查。称重卵巢和肾上腺。
测试2：使用12-30只成年CD株系雌性大鼠作为测试动物。将它们
分成等数量的2组。监测所有动物的动情周期。在动情前期这天，对
每一雌鼠进行手术。切除每一组中雌鼠的子宫左侧角，切成小方块，
将小方块在邻近肠系膜血流的不同位点宽松地缝合。手术约50天后，
给第1组雌鼠腹膜内注射水，注射21天，在相同期间内，给第2组
雌鼠腹膜内注射1．0mg／kg体重的F-Ⅲ。治疗21天后，将每一雌
鼠处死，取出子宫内膜外植体和肾上腺并称重。测定外植体作为生长
的指征。监测动情周期。
测试3：在大鼠和／或兔子中使用子宫内膜组织真迹复制术来诱导子宫
内膜异位。将在生殖成熟期的雌动物进行两侧卵巢切除术，补充外源
性雌激素以提供特定且恒定的激素水平。将自体子宫内膜异位组织移
植到5-150只动物的腹膜内，补充雌激素以诱导该外植入组织的生
长。以日基础用本发明化合物通过胃灌注进行治疗，治疗3-16周，
取出移植体并测定其生长或消退。在处死时，收集完整的子宫角，以
评价该完整子宫内膜的情况。
测试4：将人子宫内膜损伤组织植入到性成熟、去生殖腺、雌性、裸
小鼠的腹膜内。补充外源性雌激素以诱导该外植入组织的生长。在某
些情况下，在植入前将收集的子宫内膜细胞体外培养。以日基础用
F-Ⅲ通过胃灌注进行治疗，治疗3-16周，取出移植体并测定其生
长或消退。在处死时，取出子宫，以评价该完整子宫内膜的情况。
测试5：收集人子宫内膜损伤组织并体外保存以作为初始非转化组
织。将手术样本通过无菌网或筛，或者挑开除去周围组织，以制备单
细胞悬浮液。将细胞保持在含有10％血清和抗生素的培养基中。测定
在和不在雌激素存在下的生长速度。分析细胞产生补体组分C3的能
力，和它们对生长因子和生长激素的反应。评定用孕激素、GnRH、
F-Ⅲ、和载体治疗后体外组织的增殖反应。每周评定甾体激素受体
的水平，以测定在体外是否保持重要的细胞特征。使用取自5-25名
患者的组织。
包括阿尔茨海默氏病在内的CNS障碍

雌激素、例如17β-雌二醇通过结合位于一些细胞的胞质内的雌
激素受体(ER)来调控基因转录。对于复合物的核运输，当结合上13
碱基对回文DNA共有序列(雌激素反应单元，或ERE)并开始装配在
适当靶基因的活化中达到顶峰的转录装置时，ER的配体活化是先决条
件。已经确定了多种通过雌激素调控的基因。其包括细胞支架蛋白、
神经递质生物合成和代谢酶与受体、以及其它激素和神经肽。已经在
许多雌激素反应性基因中确定了ERE’s，包括卵黄生成素、c-fos、催
乳素、和促黄体素。

在中枢神经系统中非常重要的是，已经在p75^ngr和trkA中确定了
类ERE序列，对于下述神经营养蛋白，p75^ngr和trkA都起信号传导分
子的作用：神经生长因子(NGF)、脑神经生长因子(BDNGF)、和神
经营养蛋白-3。

已经证明BDNF和NGF促进了组织内胆碱能神经元的存活。据假
定，如果神经营养蛋白和雌激素之间的相互作用对于基底前脑神经元
(其在阿尔茨海默氏病中退化)的发展和存活很重要，则其中存在雌
激素缺乏(例如绝经后)的临床病症可能促进这些神经元损失。

在切除卵巢的大鼠(如上所述制备的)中进行下述实验以确定
F-Ⅲ和雌激素在影响不同脑区域中基因表达方面的相似性和／或不
同。将6周大小的大鼠每日皮下注射雌二醇苯甲酸酯(0．03mg／kg)、
F-Ⅲ或载体(对照)。治疗5周后，把大鼠处死，将它们的脑取出，
通过显微解剖收集海马组织。将海马组织在液氮中迅速冷冻并贮存在
-70℃的环境中。用得自适当治疗组和对照组的混合组织制备总RNA，
用3’低聚核苷酸引物(选择其来进行特异mRNA(聚-A+)增殖)进行逆
转录。在由下述组分构成的鸡尾酒中进行聚合酶链式反应(PCR)：
随机5’低聚核苷酸(长度为10个碱基对；共150)、反应缓冲剂、
Tap聚合酶、和³²pdTCP。

扩增40轮后，将反应产物在6％TBE-尿素凝胶上进行大小分离，
干燥并露置于X-射线薄膜上。比较治疗组之间的所得mRNA显示图
案。
F-Ⅲ与雌激素的联合应用

绝经期间和绝经后妇女经常要接受激素替代治疗(HRT)来对抗
与循环内源性雌激素下降有关的不利后果，例如治疗热潮红。然而，
HRT会使患有包括子宫癌和乳腺癌在内的一些癌症的危险性增加。可
将F-Ⅲ与HRT联合采用以抑制这些危险。
F-Ⅲ与芳香酶抑制剂的联合应用

按照定义，绝经或妇女的卵巢不能行使其功能。她们仅有的雌激
素来源是通过在周围组织(包括脂肪、肌肉和自身乳腺肿瘤)中发现
的芳香酶把肾上腺雄激素转化成雌激素。因此，抑制芳香酶的药物(芳
香酶抑制剂)能使绝经后妇女的循环雌激素耗尽。对于患有转移性乳
腺癌的患者，通过抑制芳香酶来导致雌激素缺乏是重要的治疗选择。
在用芳香酶抑制剂治疗期间，缺乏循环雌激素可能会导致消极的、不
利的副作用，例如对血清脂质水平有影响。可采用F-Ⅲ来抑制这些
不利作用。
F-Ⅲ与LHRH类似物的联合应用

连续地给予LHRH(黄体生成素释放激素)类似物能通过脱敏垂
体、使得垂体不能刺激卵巢产生雌激素而抑制绝经前妇女的雌激素生
成。临床效应是“药物卵巢切除术”，停止使用LHRH类似物后，这
种效应是可逆的。在用LHRH治疗期间，缺乏循环雌激素可能会导致
消极的、不利的副作用，例如血清脂质水平。可采用F-Ⅲ来抑制这
些不利作用。
提高乙酰胆碱水平

已知与没患阿尔茨海默氏病的人相比，阿尔茨海默氏病患者在海
马中的胆碱能神经元水平要显著下降。在这些患者中，这些胆碱能神
经元的渐进性损失似乎是记忆和认识功能损失的反映。据认为这些神
经元减少的一个原因是神经递质-乙酰胆碱的功能损失或下降。

神经元内乙酰胆碱的水平基本上是由其生物合成和生物降解之
间的平衡决定的。胆碱乙酰转移酶(ChAT)是使其合成的主要酶，乙
酰胆碱酯酶(AChE)是使其降解的主要酶。

为了确定F-Ⅲ对ChAT水平的作用，进行下述实验：进行完上
述常规大鼠制备操作之后，每天给40只大鼠皮下注射或口服给予在
含10％环糊精的载体中的3mg／kg／天F-Ⅲ、0．03或0．3mg／kg／
天雌二醇苯甲酸酯、或对照载体。将大鼠治疗3天或10天。每一给
药方案包含20只大鼠。在适当时间间隔，将大鼠处死并解剖其脑。
将脑的特定部分匀浆并分析。处理海马和前皮层的匀浆物，并通过放
射标记分析乙酰胆碱的生物合成来测定ChAT的活性。Schoepp等人
在《神经传导杂志》(J．Neural Transmiss．)，78：183-193，1989
中描述了该方法，该文献引入本发明以作参考。

正如所预期的那样，与假操作对照大鼠相比，在OVX大鼠中，ChAT
水平下降了50％以上(p＜0．001)。

在本发明另一实施方案中，将F-Ⅲ与AChE抑制剂联合使用。
使用AChE抑制剂能通过抑制AChE来阻断乙酰胆碱降解而提高乙酰胆
碱水平。
良性前列腺增生(BPH)

对于雌激素作用与BPH和前列腺癌的治疗之间的联系的背景技
术，参见PCT申请WO 98／07247，国际出版日期：1998年10月15
日。

在下述实验中，在几个人前列腺癌细胞系中评价F-Ⅲ结合雌激
素受体的能力。

在包含50nM Tris．HCl pH 7．4、1．5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、
0．4M KCl、10％甘油、0．5mM 2-ME、和10mM钼酸钠、以及还含
有蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂(1mg／ml)、亮抑蛋白酶肽(2
mg／ml)、抑肽酶(5mg／ml)和苯甲磺酰氟(PMSF，0．1mM)的TEG
培养基(TEGP)中制备LNCaP、DU-45和PC-3人前列腺癌细胞系的溶
解产物。

将细胞溶解产物离心，把离心沉积物重悬在冷的TEGP中(1ml
TEGP／100mg离心沉积物)，并用Branson Model 450 Sonifier超
声30秒(忙闲度70％，排出量1．8)。通过在40℃以10000×G的
转速离心将溶解产物沉积，之后弃去上清液，立即使用或在-70℃贮
存。

竞争性结合分析：结合缓冲液是其中用50mM NaCl替代0．4M
KCl、并且还加入1mg／ml卵清蛋白的TEG(TEGO)。将F-Ⅲ在TEGO
中稀释至20nM，用该稀释液制备3重系列稀释液。在园底聚丙烯微
平板的三重微孔中进行分析。每一孔中加入35ml含氚17β-雌二醇
(0．5nM，特异活性60．1Ci／mmol、DuPont-New England Nuclear，
Boston，MA)和35ml冷的竞争测试化合物(0．1nM-5mM)或TEGO，
然后在4℃振摇下培养5分钟，加入70ml MCF-7细胞系溶解产物。

将平板在4℃培养24小时，然后向每一孔中加入70ml覆盖葡萄
糖的活性炭(DCC)，之后在4℃剧烈振摇8分钟。然后将平板在4℃
以1500×G的转速离心10分钟。把每一孔中的上清液收集到软聚苯
乙烯微平板中，以在Wallac Microbeta Model 1450计数器中进行
闪烁计数。放射活性表示为校正计数效率(35-40％)和本底后的每
分钟衰变次数(DPM)。其它对照是总计数，以总计数+DCC定义DCC
可推断计数的下限。使用下述公式，以平均百分之结合(％结合)+／-
标准偏差表示这些竞争性结合分析的结果：
％结合=(DPM_{测试化合物}-DMP_{总计数+DCC})／(DPM_{非测试化合物}-DMP_{总计数+DCC})×100
预防乳腺癌

本发明还涉及将F-Ⅲ对有患从头乳腺癌危险的个体给药。本说
明书所用术语“从头”是表示，在第一次情况中没有正常乳腺细胞转
化成或变成癌细胞或恶性细胞。这种转化可能在相同细胞或子细胞中
经过发展过程在多个阶段发生，或者可在单一关键事件中发生。该从
头过程与已经转化或恶化的细胞从初始肿瘤位点向新位点转移、移
生、或展开的过程不同。

发展成乳腺癌没有特别危险的人是可能发展从头乳腺癌、没有任
何证据或疑点表明该疾病超过正常危险、和从来没有被诊断出患有该
疾病的个体。发展成乳腺癌的最大危险因素是患有该疾病的个人病
史、或该疾病的早期发生，甚至当没有任何证据表明存在该疾病时也
是如此。另一危险因素是该疾病的家族史。

通过给予致癌物N-亚硝基-N-甲基脲来在大鼠中诱导乳腺癌是研
究乳腺癌的广为接受的动物模型，并且已经发现其适于对化学预防剂
的作用进行分析。

在两个独立的实验中，给55天大小的雌性Sprague-Dawley大鼠
静脉内(实验1)或腹膜内(实验2)给予50mg N-亚硝基-N-甲基
脲／kg体重，1周后让这些大鼠随意食用混合有不同量的F-Ⅲ、
(Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺碱(他莫
昔芬碱)、或对照物的饮食。

在实验1中，60mg／kg食物和20mg／kg食物的饮食剂量粗略地
相当于3和1mg／kg测试动物体重的可比剂量。

在实验2中，20、6、2、和0．6mg／kg食物的饮食剂量粗略地相
当于1、0．3、0．1、和0．03mg／kg测试动物体重的可比剂量。

每周一次观察大鼠中的毒性迹象、并称重和触诊肿瘤形成。13
周(实验1)或18周(实验2)后将大鼠处死，在尸体剖检时确认肿
瘤并称重。

制剂

在说明书中，当术语“药物”作为形容词使用时，其基本上指对
接受哺乳动物无害。“药物制剂”是指载体、稀释剂、赋形剂和活性
成分必须与该制剂中的其它组分相容，并且对其接受者无害。

优选在给药前将F-Ⅲ配制。制剂的选择应当由主治医师考虑涉
及确定有效剂量相同的因素来决定。

在这种制剂中，活性成分总量占该制剂重量的0．1％-99．9％。
在所述制剂中，优选包含不超过2种活性成分。也就是说，优选将
F-Ⅲ与选自雌激素、孕激素、芳香酶抑制剂、LHRH类似物和AChE
抑制剂的另一种活性成分一起配制。最优选的制剂是其中F-Ⅲ是唯
一活性成分的制剂。

本发明药物制剂是通过本领域已知方法、用众所周知且易得的成
分制得的。例如，可将F-Ⅲ单独或者和雌激素、孕激素、芳香酶抑
制剂、LHRH类似物或AChE抑制剂一起与常规赋形剂、稀释剂、或载
体配制成片剂、胶囊、悬浮剂、溶液剂、注射剂、气雾剂和粉剂等。

用于非胃肠道给药的本发明药物组合物包含无菌水或非水溶
液、分散体、悬浮液、或乳液，以及在使用前即刻重配成无菌溶液或
悬浮液的无菌粉末。适当无菌水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂
的实例包括水、生理盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚(乙
二醇)等)、和它们的适当混合物、植物油(例如橄榄油)、可注射
有机酯例如油酸乙酯。通过例如使用包衣材料如卵磷脂、对于分散剂
和悬浮剂通过维持适当粒径、和通过使用表面活性剂来保持适当流动
性。

非胃肠道给药组合物还含有辅料例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、
和分散剂，通过加入抗菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、
苯酚山梨酸等来阻止微生物体的作用。还可以加入等渗剂例如糖、氯
化钠等。通过加入延迟吸收的物质例如硬脂酸铝和明胶可制得缓释注
射剂。

在某些情况下，为了延迟药物的作用，需要在皮下或肌内注射后
减缓药物的吸收。这可通过使用低水溶性结晶材料的液体悬浮剂或通
过把药物溶解或悬浮在油性载体中来实现。当皮下或肌内注射含有低
水溶性药物的悬浮剂时，药物的吸收速度取决于其溶解速度。

F-Ⅲ的“贮库”注射制剂可通过将药物在生物可降解聚合物例
如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(原酸酯)、和
聚(酸酐)等本领域已知聚合物中形成微胶囊基体来制得。根据药物与
聚合物的比例和所用特定聚合物的特性，可控制药物的释放速度。

可通过例如经由细菌截留滤器过滤、或通过在混合前把混合物组
分预灭菌将注射剂在生产时或刚好给药前灭菌(例如在双室注射器包
装的实例中)。

口服给药固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂、和粒剂。在这
种固体剂型中，将F-Ⅲ与下述物质混合：至少一种惰性药物载体例
如柠檬酸钠、或磷酸氢二钙；和／或(a)填充剂或填料例如淀粉、包
括乳糖和葡萄糖在内的糖、甘露糖醇、和硅酸，(b)粘合剂例如羧
甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、
蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂例如甘油，(d)崩解剂例如琼脂、碳
酸钙、碳酸氢钠、土豆淀粉或木薯淀粉、藻酸、硅酸盐和碳酸钠，(e)
润湿剂例如甘油，(f)溶液阻滞剂例如石蜡，(g)吸收促进剂例如
季铵化合物，(h)湿润剂例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，(i)吸收
剂例如高龄土和膨润土粘土，和(j)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、
硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、和它们的混合物。对于
胶囊、片剂、和丸剂，剂型还可以含有缓冲剂。

相似类型的固体组合物还可包含用赋形剂例如乳糖以及高分子
量聚乙二醇等在软或硬明胶胶囊中的填充剂。

固体剂型例如片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和粒剂还可制成具有包
衣或外壳例如肠包衣或其它制药领域众所周知的包衣的剂型。包衣可
含有不透明剂、或在尤其是部分消化道内释放活性组分的物质例如用
于在胃中释放活性组分的酸溶性包衣、或用于在肠道内释放活性组分
的碱溶性包衣。

还可以将活性组分微囊包封在缓释包衣中，其中微胶囊构成胶囊
制剂药丸的一部分。

F-Ⅲ的口服液体剂型包括溶液剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂和酏
剂。除了活性组分以外，液体制剂还可包含本领域常用惰性稀释剂，
例如水或其它药用溶剂，加溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙
酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基
甲酰胺、油(尤其是棉籽油、坚果油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖
麻油、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、山梨醇脂肪酸酯、
和它们的混合物。

除了惰性稀释剂以外，液体口服制剂还可包含助剂例如润湿剂、
乳化剂和悬浮剂、和甜味剂、矫味剂、和香料。

除了活性组分以外，液体悬浮制剂还可包含悬浮剂例如乙氧基化
异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧
化铝、膨润土粘土、琼脂、和西黄蓍胶、以及它们的混合物。

直肠或阴道内给药用组合物是这样制得的：将F-Ⅲ与适当非刺
激赋形剂例如椰子油、聚乙二醇、或在室温是固体但是在体温是液体
并因此在直肠或阴道腔内熔化以释放活性组分的所有栓剂蜡混合。将
化合物溶解在熔化的蜡中，塑成所需形状、使其变硬以形成最终的栓
剂。

F-Ⅲ还可以以脂质体形式给药。正如本领域已知的那样，脂质
体通常是用磷脂或其它脂类制得的。脂质体制剂是通过将分散在水介
质中的液体晶体进行单层或多层水合而形成的。可使用所有能形成脂
质体的无毒、可药用、以及可代谢脂类物质。除了F-Ⅲ以外，本发
明脂质体剂型组合物还可含有稳定剂、赋形剂、防腐剂等。优选的脂
类物质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，二者都是天然和合成的。

形成脂质体的方法在本领域内是已知的，例如在Prescott，Ed．，
《细胞生物方法》(Methods in Cell Biology)，第ⅩⅣ卷，Academic
Press，New York，N．Y．(1976)，p．33中描述的方法。

下述制剂实施例仅是举例说明，而不是限制本发明的范围。
制剂1：明胶胶囊

可按照合理的变更改变上述制剂。

用下述组分制备片剂：
制剂2：片剂

将F-Ⅲ、淀粉、和纤维素过NO．45目U．S．筛并充分混合．把所得
粉末与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，然后过NO．14目u．s．筛。将由此
制得的颗粒在50-60℃干燥，并过NO．18目U．S．筛．把羧甲基淀粉
钠、硬脂酸镁、和滑石先过NO．60目U．S．筛，然后加到上述颗粒中，
混合后，用制片机压制成片。

如下所述制备每5ml分别含有0．1-1000mg的悬浮剂：
制剂5：悬浮剂

将F-Ⅲ过NO．60目U．S．筛，悬浮在饱和脂肪酸甘油酯中，然后用
最小所需热量熔化．之后将混合物倒入2g标准容量的栓剂模中，冷
却。

如下所述制备静脉内给药制剂：
制剂8：静脉内给药制剂

剂量

本发明F-Ⅲ的具体给药剂量取决于每一种情况的具体条件．这
些条件包括给药途径、受治疗者的先前病史、欲治疗的病症或症状、
欲治疗的病症／症状的严重程度、和受治疗者的年龄和性别。

F-Ⅲ的最小有效日剂量通常是大约1、5、10、1 5、或20mg。
有效剂量通常是大约800、100、60、50、或40 mg。最通常的剂量为
15mg-60 mg。可依据医学领域受治疗者“剂量逐步确定”中的标准
实施手段确定准确剂量；也就是说，先给予低剂量的本发明化合物，
然后逐渐提高剂量直至观察到理想治疗效果。

对于上述联合治疗，虽然需要逐步确定受治疗者的给药剂量，但
是除F-Ⅲ外的其它活性组分的剂量通常如下：乙炔基雌激素(0．01
-0．03 mg／天)、美雌醇(0．05-0．15 mg／天)、共轭雌激素(例如
Premarin^，Wyeth-Ayerst；0．3-2．5 mg／天)、甲羟孕酮(2．5-
10mg／天)、异炔诺酮(1．0-10．0mg／天)、炔诺酮(0．5-2．0 mg／
天)、氨鲁米特(250-1250 mg／天，优选250 mg／天、分4次给药)、
anastrazole(1-5 mg／天，优选1mg／天、每天给药1次)、来曲
唑(2．5-10 mg／天，优选2．5 mg／天、每天给药1次)、福美司坦
(250-1250mg／周，优选250 mg／周、分2次给药)、依西美坦(25
-100 mg／天，优选25 mg／天、每天给药1次)、性瑞林(3-15 mg／3
个月，优选3．6-7．2 mg／3个月、每3个月给药1次)、和亮丙瑞林
(3-15 mg／月，优选3．75-7．5 mg／月、每月给药1次)。

给药途径

F-Ⅲ可通过多种给药途径给药，包括口服给药、直肠给药、透
皮给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药，和鼻内给药。各雌激素
和孕激素给药方法与本领域已知给药方法一致．F-Ⅲ单独或与雌激
素、孕激素、或AChE抑制剂一起通常是在适宜制剂中给药。

可通过口服，直肠、阴道内，非胃肠道、局部、经颊、舌下、或
经鼻给药途径将本发明药物组合物给到人或其它哺乳动物(例如狗、
猫、马、猪等)中。在本说明书中，术语“非胃肠道给药”是指包括
静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、或关节内注射或输注在内的
给药方式。

给药方式／时间

对于本发明的主要给药方法，可将F-Ⅲ连续给药，每天给药1
-3次，或者按需要时常给药，以把有效量的F-Ⅲ给到受治疗者中。
当治疗子宫内膜异位时，周期治疗可能特别适用，当经受到疾病的疼
痛攻击时，可迅速采用周期治疗。对于再狭窄，在医疗操作例如血管
成形术之后，治疗可限制在短间歇(1-6个月)。