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1、(10)授权公告号 CN 101705206 B (45)授权公告日 2011.05.04 CN 101705206 B *CN101705206B* (21)申请号 200910073257.9 (22)申请日 2009.11.25 C12N 5/071(2010.01) (73)专利权人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴 路 26 号 专利权人 滕春波 李丹 (72)发明人 滕春波 李丹 (54) 发明名称 一种新型高效小鼠胰腺单细胞悬液的制备方 法 (57) 摘要 本发明公开了一种新型、 高效的分离制备小 鼠胰腺单细胞悬液的方法， 包括小鼠胰腺取材、 胰 酶冷。
2、消化、 胰腺单细胞分离与纯化等步骤。本发 明的技术关键是利用胰酶在低温低活力状况下浸 入胰腺组织， 然后再通过短时温消化解离胰腺组 织， 从而获得高数量、 高纯度、 高活力、 无粘连的胰 腺单细胞悬液。与常规胰腺细胞分离方法相比， 该发明具有操作稳定、 细胞得率高、 细胞活性高等 特点， 避免了常规胰腺分离方法中胰酶长时间温 孵育对胰腺细胞造成伤害、 细胞大量死亡释放出 DNA 缠绕造成细胞粘连等缺点， 解决了胰腺单细 胞分离和分析困难问题， 为进一步利用胰腺细胞 奠定基础。 (51)Int.Cl. 审查员 于婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明。
3、书 3 页 附图 1 页 CN 101705206 B1/1 页 2 1. 一种小鼠胰腺单细胞悬液的制备方法， 其特征在于 ： 通过胰酶冷消化法分离小鼠胰 腺、 制备单细胞悬液的技术方法， 步骤如下 ： (1) 胰酶冷消化 ： 于培养皿中加入 4预冷的 0.25胰蛋白酶消化液， 体积以没过组织 为准， 4冷孵育 14-18 小时 ； (2) 胰腺单细胞的分离 ： 从 4取出培养皿， 去除上层消化液， 加入 37预热的 DMEM 培 养基以及 0.1mg/mL 的 Dnase I， 37消化 10min 后， 采用吸打 - 沉降法分离胰腺组织， 经 8-12 次吸打 - 沉降， 收集上层的单细胞。
4、悬液 ； 向剩余未消化胰腺组织中加入 0.8mg/mL 胶原酶 IV 进行第 2 次消化， 酶量以没过组织 为准， 37消化 10 分钟， 然后经 2-3 次吸打 - 沉降， 收集上层的单细胞悬液 ； (3) 胰腺单细胞悬液的制备 ： 对两次收集的单细胞悬液离心， 转速为 800 1000 rpm/ min， 离心 5 分钟后弃去上清液、 上层的组织细胞碎片、 DNA 絮状缠绕物， 以及中间层的血细 胞， 保留最下层乳白色的胰腺实质细胞层， 用小体积 PBS 缓冲液重悬细胞， 即得到了制备好 的胰腺单细胞悬液。 权 利 要 求 书 CN 101705206 B1/3 页 3 一种新型高效小鼠胰。
5、腺单细胞悬液的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种新型高效的分离制备小鼠胰腺单细胞悬液的技术， 具体涉及到采 用胰蛋白酶冷消化法分离制备高活力、 高纯度、 不粘连的胰腺单细胞悬液的方法。 背景技术 0002 糖尿病是一种由于胰岛 细胞缺乏或功能缺陷引起的， 以血糖增高为特征的代 谢病。 近年来， 随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高， 糖尿病的发病率和患 病率逐年提高。糖尿病不仅影响患者的生活质量给病人带来沉重的心理负担， 而且糖尿病 并发症对患者的健康和生命构成威胁。 0003 胰腺干细胞是一类具有高增殖能力和定向分化为胰岛 细胞的多能细胞， 利用 胰腺干细胞可以有效解决移。
6、植供体来源不足问题。 胰腺干细胞通常采用流式细胞术从活体 胰腺分离的单个细胞悬液中进行分离纯化， 因此高质量单细胞悬液的制备是获得高比率、 高活性胰腺干细胞的关键环节。但胰腺是一个较为特殊的器官， 大部分细胞均为外分泌腺 泡细胞， 其中包含有大量的消化酶类， 在传统方法分离制备单细胞悬液过程中， 利用胰酶直 接长时间温孵育易于引起外分泌腺泡细胞破碎死亡， 释放出大量 DNA 缠绕粘连成团、 杂质 碎片过多、 细胞数量过少， 易于导致胰腺细胞分离纯化的失败。 发明内容 0004 本发明利用模式动物小鼠建立了一种新型胰腺单细胞分离方法， 通过使胰酶在低 活力状况下浸入胰腺组织， 短时温消化即可高效。
7、解离胰腺组织。该发明与传统分离方法相 比较， 具有能够将胰腺彻底消化分离， 得到的细胞比率高， 且分离得到的细胞以单个形式存 在， 没有粘连， 杂质少， 分离得到的细胞活力高(经台盼蓝染色活力95)等优点， 很好地 解决了胰腺单细胞分离纯化困难、 分析困难的问题， 为进一步利用胰腺单细胞奠定基础。 0005 具体步骤如下 ： 0006 一、 小鼠胰腺组织的取材 0007 1. 取健康成年小鼠作为材料， 颈椎脱臼法处死， 用 70 -75乙醇浸泡 3-5 分钟， 超净台内打开小鼠腹腔， 沿脾脏下方， 至十二指肠回弯处， 用剪刀小心剪下淡粉色的胰腺组 织。 0008 2. 在体视显微镜下剔除胰腺组。
8、织中的脂肪、 血管、 系膜及淋巴结， 用 PBS 缓冲液清 洗两遍。 0009 3. 将胰腺移入干净的 3.5cm 培养皿中， 用弯头剪剪成约 1mm3大小的组织块， 加入 适量 PBS 缓冲液清洗一次， 去除组织及细胞碎片。 0010 二、 胰蛋白酶冷消化 0011 往盛有胰腺组织的培养皿加入 4预冷的 0.25胰蛋白酶消化液， 体积以没过组 织为准， 然后将培养皿置于冰箱， 4消化 14-18 小时。 0012 三、 胰腺单细胞的分离 说 明 书 CN 101705206 B2/3 页 4 0013 1.14-18h 后， 将培养皿从 4取出， 尽量吸去胰蛋白酶消化液， 加入 2mL 37。
9、预热 0.8mg/mL 的 DMEM 培养基以及 20ul 0.1mg/mL 的 Dnase I， 置于 37培养箱消化 10min。 0014 2. 加入少量血清终止消化后再加入 1.5-2mL 冷 PBS 缓冲液， 用带有剪去尖部枪头 的移液器反复吹打组织， 使组织块及细胞团中的单细胞尽可能多的解离释放出来， 经自然 沉降约 10-15 秒， 吸取上清， 收集于 15mL 离心管中。 0015 3. 重复清洗组织块操作 8 12 次， 直至清洗组织块所得悬液不再浑浊， 往剩余胰 腺组织中加入 1mL 经 37预热 0.8mg/mL 的浓度胶原酶 IV 消化液， 于 37恒温培养箱中消 化 。
10、10min。 0016 4. 加入 1.5 2mL 预冷 PBS 终止消化， 剩余组织用枪头吸打， 重复操作 2 3 次， 收集所有细胞悬液于 15mL 离心管中。 0017 四、 胰腺单细胞纯化及单细胞悬液的制备 0018 1. 将所收集到的上清液置于水平离心机中， 800 1000rpm/min 离心 5min。 0019 2. 弃去上清液、 上层的细胞碎片、 DNA 絮状缠绕物以及中间层的血细胞， 保留最下 层乳白色的实质细胞层。 0020 3. 用小体积 PBS 缓冲液重悬细胞， 即得到了制备好的胰腺单细胞悬液。 具体实施方式 0021 1. 超净台和无菌间用紫外照射灭菌 40min，。
11、 然后关闭紫外设备， 打开排风系统， 5min 后进入无菌间。 0022 2. 取 3 个直径 3.5cm 的培养皿， 置于超净台， 其中两个皿倒入约 2mL 的冷 PBS(4 )， 置于冰袋上， 备用。 0023 3. 准备两套干净手术器械， 置于超净台， 备用。 0024 4. 用颈椎脱臼法处死一只小鼠， 将其置于 75乙醇中浸泡 3min， 消毒后拿入无菌 间。 0025 5. 将小鼠左腹面向上， 平置于干净的 10cm 玻璃皿中， 在超净台将小鼠腹腔打开， 暴露内脏， 小心的将胰腺取下， 置于盛有冷 PBS 的 3.5cm 培养皿中。 0026 6. 盛有胰腺组织的小皿移至体视显微镜下。
12、， 用尖头镊子剔除脂肪、 血管、 系膜以及 淋巴结， 然后将剩余组织移至另一盛有冷 PBS 的 3.5cm 培养皿中。 0027 7.将剔净的胰腺组织移入第三个培养皿， 用弯头剪将胰腺组织剪成0.1mm3大小的 组织块， 加入 2mL PBS 清洗一次， 以去除组织及细胞碎片。 0028 8.加入1mL 4预冷的0.25胰蛋白酶消化液， 将培养皿置于冰箱4， 消化16h。 0029 9.16h 后， 将培养皿从 4取出， 吸去上层胰蛋白酶消化液， 加入 2mL 37预热的 DMEM 培养基以及 20ul 0.1mg/mL 的 Dnase I， 置于 37培养箱消化 10min。 0030 10。
13、. 加入少量 FBS 终止消化， 然后用移液器加入 1.5-2mL 冷 PBS， 将枪头剪成合适 大小， 反复吹打组织， 使组织块及细胞团中的单细胞尽可能多的解离释放出来， 经自然沉降 约 10-15 秒， 吸取上清， 收集于 15mL 离心管中。 0031 11.重复10步骤清洗组织块的操作10次左右， 直至清洗组织块所得的悬液不再浑 浊， 这时大部分胰腺组织已经被分离成单细胞悬液， 只剩余少量管状及膜状物质。 0032 12.往剩余胰腺组织中加入1mL经37预热的0.8mg/mL胶原酶IV消化液， 于37 说 明 书 CN 101705206 B3/3 页 5 恒温培养箱中消化 10min。
14、。 0033 13. 加入 1.5 2mL 预冷 PBS 终止消化， 剩余组织用枪头吸打， 静置后收集上层细 胞悬液于 15mL 离心管。 0034 14. 重复 13 步骤清洗组织块的操作 2 3 次， 此时几乎所有胰腺组织都能够被分 解成为细胞悬液， 收集所有细胞悬液于 15mL 离心管中。 0035 15. 将所收集到的上清液置于水平离心机中， 800 1000rpm/min 离心 5min。 0036 16. 弃去上清液， 上层的细胞碎片、 死细胞来源的 DNA 絮状缠绕物等， 以及中间层 的血细胞， 保留最下层乳白色的实质细胞。 0037 17. 用一定体积的 PBS 重悬细胞， 用血球计数板进行计数， 并通过台盼蓝染色法对 细胞活力进行测定， 细胞活力达到 95以上。 附图说明 0038 附图是采用胰酶冷消化法制备小鼠胰腺单细胞悬液的具体流程。 说 明 书 CN 101705206 B1/1 页 6 说 明 书 附 图 。