杏黄兜兰EST-SSR标记引物、其开发方法及其应用.pdf

《杏黄兜兰EST-SSR标记引物、其开发方法及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《杏黄兜兰EST-SSR标记引物、其开发方法及其应用.pdf（44页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711280553.7 (22)申请日 2017.12.06 (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 贾瑞冬徐玉凤葛红杨树华 赵鑫周妍慧程浩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 杏黄兜兰EST-SSR标记引物、 其开发方法及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一组基于杏黄。

2、兜兰转录组序 列开发的EST-SSR标记引物组， 包括13对引物， 所 述引物的核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1 SEQIDNO.26所示。 本发明还公开了包含本发明 所述的杏黄兜兰EST-SSR标记引物的试剂。 本发 明进一步公开了一种开发杏黄兜兰EST-SSR标记 引物的方法。 本发明提供的杏黄兜兰EST-SSR标 记引物具有诸多优势， 例如多态性丰富、 可重复 性好、 扩增稳定以及便于统计等， 可用于杏黄兜 兰和兜兰属其它种的种质资源遗传多样性分析、 分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子 研究。 权利要求书2页 说明书9页 序列表5页 附图27页 CN 107974510 A 2。

3、018.05.01 CN 107974510 A 1.基于杏黄兜兰转录组序列开发的EST-SSR引物对， 所述引物对选自以下(1)-(13)项 任一项： (1)引物对PA_SSR039， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示， 其反向引物的序 列如SEQ ID NO.2所示； (2)引物对PH_SSR047， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示， 其反向引物的序 列如SEQ ID NO.4所示； (3)引物对PH_SSR097， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示， 其反向引物的序 列如SEQ ID NO.6所示； (4)引物对PH_SSR115，。

4、 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示， 其反向引物的序 列如SEQ ID NO.8所示； (5)引物对PH_SSR116， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示， 其反向引物的序 列如SEQ ID NO.10所示； (6)引物对PH_SSR119， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.12所示； (7)引物对PH_SSR137， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.14所示； (8)引物对PH_SSR146， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID。

5、 NO.15所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.16所示； (9)引物对PH_SSR176， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.18所示； (10)引物对PH_SSR179， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.20所示； (11)引物对PH_SSR206， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.22所示； (12)引物对PH_SSR224， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示， 其反向。

6、引物的 序列如SEQ ID NO.24所示； (13)引物对PH_SSR252， 其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示， 其反向引物的 序列如SEQ ID NO.26所示； 或其任意组合。 2.如权利要求1所述的杏黄兜兰EST-SSR引物对， 其中所述引物对中的一条引物被可检 测地标记。 3.如权利要求2所述的杏黄兜兰EST-SSR引物对， 其中所述标记是荧光标记。 4.基于杏黄兜兰转录组序列开发的EST-SSR引物组， 所述引物组包括权利要求1-3任一 项所述的引物对的任意组合。 5.用于分离杏黄兜兰EST-SSR标记的试剂， 所述试剂包含如权利要求1-3任一项所述的 引物对。

7、或如权利要求4所述的引物组。 6.如权利要求5所述的试剂， 其中所述试剂包含如权利要求4所述的引物组， 其中所述 引物组中的每一对引物被单独包装。 7.一种试剂盒， 所述试剂盒包括如权利要求5或6所述的试剂。 权利要求书 1/2 页 2 CN 107974510 A 2 8.一种基于杏黄兜兰转录组序列开发如权利要求1所述的EST-SSR引物的方法， 所述方 法包括： (a)基于杏黄兜兰花器官转录组测序拼接得到的unigenes的序列数据设计EST-SSR引 物； (b)提取杏黄兜兰植物样品基因组DNA； (c)利用步骤(a)得到的EST-SSR引物， 以步骤(b)所得DNA为模板进行PCR； 。

8、(d)将步骤(c)所得PCR产物进行电泳， 并对电泳结果进行分析， 从而筛选出杏黄兜兰 EST-SSR引物。 9.如权利要求8所述的方法， 其中所述步骤(b)包括用改良的CTAB法批量提取样品DNA， 具体操作如下： 用液氮将亨利兜兰的叶片研磨成粉末， 加入65预热的CTAB； 在65水浴1h； 取出冷却至室温(或放入冰箱)， 加入预冷的氯仿 异戊醇(24 1)， 轻摇5min； 离心， 取上清， 重复两次后加入2倍体积的预冷无水乙醇， 轻轻上下颠倒混匀； -20放置30min， DNA抱团析出， 将液体弃掉； 加入70乙醇洗涤沉淀， 上下颠倒6-8次， 离心后弃上清， 再用90乙醇洗涤； 通。

9、风处吹干2h， 至DNA干燥透明， 无酒精味道； 加入无菌水复溶。 10.如权利要求8或9所述的方法， 其中所述步骤(c)通过降落PCR进行， 其反应程序为： 94变性5min； 9430s， 6530s， 7240s， 循环10次； 9430s， 6030s， 7240s， 循环15 次； 9430s， 5530s， 7240s， 循环10次； 然后是72延伸10min。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107974510 A 3 杏黄兜兰EST-SSR标记引物、 其开发方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及基于杏黄兜兰(Paphiopedilum armeniacum)转录组序列开。

10、发的EST- SSR标记引物、 其开发方法及其应用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 杏黄兜兰属于兰科(Orchidaceae)兜兰属(Paphiopedilum)植物， 是我国特有的原 生种， 有 “兰花大熊猫” 之称， 由于其分布区域狭窄、 生境丧失、 资源遭受掠夺性采挖， 导致杏 黄兜兰种群数量迅速减少而濒临灭绝， 在原产地已很难发现其野生资源。 现所有兜兰属植 物均被列入 濒危野生动植物种国际贸易公约 附录一名录而被禁止贸易。 因此杏黄兜兰的 遗传多样性的研究变得十分重要， 兜兰的保育工作更加刻不容缓。 0003 基于基因组或转录组数据开发的简单重复序列(Simple sequ。

11、ence repeat， SSR) 标记又称微卫星标记， 具有多态性高、 重复性好、 特异性强、 检测方便、 共显性、 标记覆盖整 个基因组且均匀分布等特点 ， 已成为遗传多样性分析中很重要的遗传标记之一 (Phuekvilai， Prattana&Pongtongkam， Pradit&Peyachoknagul， Surin，“Development of Microsatellite Markers for Vanda Orchid， ” Kasetsart Journal-Natural Science， 2009， 43(3)： 497-506； Kalia R K， Rai M K。

12、， Kalia S等，“Microsatellite markers： an overview of the recent progress in plants， ” Euphytica， 2011， 177(3)： 309-334)。 与 基因组SSR标记相比， EST-SSR来源于表达基因组区域， 可为功能基因提供 “绝对” 的标记， 开 发成本低， 物种间通用性较高(朱振东， 贾继增，“小麦SSR标记的发展及应用” ，遗传 ， 2003， (03)： 355-360； Varshney， R .K.等，“Interspecific transferability and comparat。

13、ive mapping of barley EST-SSR markers in wheat， rye and rice， ” Plant Science， 2005， 168(1)： 第195-202页)。 对于非模式生物或者是无全基因组测序的生物， 利 用转录组测序(RNA-Seq)开发具有基因信息的SSR标记来分析生物的遗传多样性也是一种 简单高效的研究方法， 该方法在兰花中也多次报道(Tsai CC， Shih HC， Wang HV， Lin YS， Chang CH等，“RNA-Seq SSRs of Moth Orchid and Screening for Molecular 。

14、Markers across Genus Phalaenopsis(Orchidaceae)， ” PLOS ONE， 2015， 10(11)： e0141761)。 在兜兰 属中， 曾宋君等在2010年开发了10对同色兜兰的基因组SSR标记(Li， L.， Zeng， S.， Zheng， F.， Chen， Z.， Wu， K.， Zhang， J.和Duan， J.，“Isolation and Characterization of 10Polymorphic Microsatellite Loci in Paphiopedilum concolor(Batem.)Pfitzer (。

15、Orchidaceae)and Cross-species Amplification， ” Hortscience， 2010， 45(8)： 1286- 1287)， 本实验室利用杏黄兜兰的转录组数据成功了开发出了13对具有多态性的EST-SSR引 物。 0004 本次我们利用杏黄兜兰转录组序列信息开发EST-SSR引物， 将会对杏黄兜兰及兜 兰属其它种的种质资源遗传多样性、 亲缘关系分析、 重要性状基因定位、 分子标记辅助育种 以及兜兰属植物相关的分子研究等起重要推动作用。 说明书 1/9 页 4 CN 107974510 A 4 发明内容 0005 本发明公开了一组基于杏黄兜兰转录组序。

16、列开发的EST-SSR标记引物组， 包括13 对引物， 所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1SEQ ID NO.26所示。 本发明还公开 了包含本发明所述的杏黄兜兰EST-SSR标记引物的试剂。 本发明进一步公开了用于开发杏 黄兜兰EST-SSR标记引物的方法， 包括： (a)基于杏黄兜兰花器官转录组测序拼接得到的 unigenes的序列数据设计EST-SSR引物； (b)提取杏黄兜兰植物样品基因组DNA； (c)利用步 骤(a)得到的EST-SSR引物， 以步骤(b)所得DNA为模板进行PCR； (d)将步骤(c)所得PCR产物 进行电泳， 并对电泳结果进行分析， 从而筛选出具。

17、有期望特性的杏黄兜兰EST-SSR引物。 本 发明提供的杏黄兜兰EST-SSR标记引物具有诸多优势， 例如多态性丰富、 可重复性好、 扩增 稳定以及便于统计等， 可用于杏黄兜兰和其兜兰属其它种的种质资源遗传多样性分析、 分 子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究。 0006 本发明的第一方面提供如下表1所示的基于杏黄兜兰转录组序列开发的EST-SSR 引物对： 0007 表1杏黄兜兰EST-SSR多态性引物信息 0008 0009 0010 上述引物的序列编号分别为SEQ ID NO.1SEQ ID NO.26。 0011 在一个实施方案中， 本发明所述的杏黄兜兰EST-SSR引物对中的任。

18、一条引物可以 被可检测地标记。 标记方法是本领域熟知的。 所述标记包括本领域常用的那些， 例如， 所述 标记包括但不限于荧光标记、 同位素标记等。 优选地， 所述标记是荧光标记。 在进一步地实 施方案中， 所述引物对中的正向引物被标记。 在另外的实施方案中， 所述引物对中的反向引 物被标记。 0012 在一个实施方案中， 本发明所述的杏黄兜兰引物对中的引物可由于一个或多个核 苷酸的插入、 缺失、 替换或本领域技术人员已知的修饰手段进行修饰而发生变化， 从而提高 所述引物的特异性、 用于同属或同种其他植物的分子生物学研究、 或获得其它期望的性能。 0013 本发明的第二方面提供了基于杏黄兜兰转录。

19、组序列开发的一组EST-SSR引物， 所 说明书 2/9 页 5 CN 107974510 A 5 述引物组包括本发明上述引物对的任意组合。 0014 本发明的第三方面提供了通过本发明所述的引物对或引物组从杏黄兜兰基因组 分离得到的DNA片段或基因产物， 即EST-SSR标记。 这些EST-SSR标记可用于杏黄兜兰和其它 兜兰种质资源遗传多样性分析、 分子标记辅助育种以及兜兰属植物相关的分子研究。 尤其 地， 由于这些EST-SSR标记来源于DNA的转录区域， 与功能基因相关， 因此可用于分子标记辅 助育种的相关研究如遗传连锁图构建、 重要性状相关标记关联分析、 分离和鉴定新基因等。 0015。

20、 本发明还提供利用本发明所述的EST-SSR引物构建的杏黄兜兰、 兜兰属其它植物 甚至兰科植物的SSR指纹图谱。 0016 本发明的第四方面提供了用于分离杏黄兜兰EST-SSR标记的试剂， 所述试剂包含 本发明所述的任何一对引物或一组引物。 0017 在一个实施方案中， 本发明所述的试剂包含如上所述的一组引物， 其中所述引物 组中的每一对引物被单独包装。 0018 本发明的第五方面提供了一种试剂盒， 所述试剂盒包括本发明如上所述的试剂。 0019 本发明的第六方面提供了一种基于杏黄兜兰转录组序列开发EST-SSR引物的方 法， 所述方法包括： 0020 (a)基于杏黄兜兰花器官转录组测序拼接得。

21、到的unigenes的序列数据设计EST- SSR引物； 0021 (b)提取杏黄兜兰植物样品基因组DNA； 0022 (c)利用步骤(a)得到的EST-SSR引物， 以步骤(b)所得DNA为模板进行PCR； 0023 (d)将步骤(c)所得PCR产物进行电泳， 并对电泳结果进行分析， 从而筛选出杏黄兜 兰EST-SSR引物。 0024 在一个实施方案中， 所述步骤(a)如下进行： 将杏黄兜兰花器官转录组测序拼接得 到unigenes的序列数据； 运用MIcroSAtellite identification tool(MISA)软件查找各个 unigene中可能存在的SSR位点(Thiel，。

22、 T.， Michalek， W.， Varshney， R.K.和Graner， A.， “Exploiting EST databases for the development and characterization of gene- derived SSR-markers in barley(Hordeum vulgare L.)， ” Theoretical and Applied Genetics， 2003， 106： 411-422)， SSR位点的查找的标准是： 二、 三、 四、 五和六核苷酸的重复 序列基序的次数分别不小于7、 5、 5、 5和5次； 运用Primer3软。

23、件基于SSR位点两翼的序列设计 SSR引物。 0025 在一个实施方案中， 引物设计的筛选策略为： 长度在1724bp之间(最适20bp)， 熔 解温度(Tm)在5562之间， PCR扩增产物大小在100350bp之间， 含有的GC比例在40 60之间(最适为50)， 其他为默认设置。 以最接近设计要求的引物组合作为SSR位点的引 物。 0026 在一个实施方案中， 所述步骤(b)包括用改良的CTAB法批量提取样品DNA， 具体操 作如下： 0027 用液氮将杏黄兜兰的叶片研磨成粉末， 加入65预热的CTAB(含 -巯基乙醇v/v 1)； ； 0028 在65水浴1h； 0029 取出冷却至室。

24、温(或放入冰箱)， 加入预冷的氯仿： 异戊醇(24 1)， 轻摇5min； 说明书 3/9 页 6 CN 107974510 A 6 0030 离心， 取上清， 重复两次后加入2倍体积的预冷无水乙醇， 轻轻上下颠倒混匀； 0031 -20放置30min， DNA抱团析出， 将液体弃掉； 0032 加入70乙醇洗涤沉淀， 上下颠倒6-8次， 离心后弃上清， 再用90乙醇洗涤； 0033 通风处吹干2h， 至DNA干燥透明， 无酒精味道； 0034 加入无菌水复溶。 0035 用改良后的CTAB法提取DNA的优势在于： 在DNA抱团后直接弃掉液体， 巧妙地避免 了离心法导致的各种杂质沉淀， 使最后。

25、得到的DNA纯度及浓度质量均大幅度提高。 0036 在一个实施方案中， 所述步骤(c)通过降落PCR(Touch Down PCR)进行， 其反应体 系如下表2所示： 0037 表2 PCR反应体系 0038 0039 使用降落PCR的方式， 具有扩增效率高， 非特异性扩增少且通用性强的优势。 0040 在一个实施方案中， 采用荧光毛细管电泳法对PCR产物进行电泳， 以识别电泳图谱 上的多态性条带， 从而筛选出条带清晰、 多态性高、 特异性好的杏黄兜兰EST-SSR引物。 0041 在进一步的实施方案中， 可利用本发明所述的方法开发兜兰属其他植物的EST- SSR引物， 甚至可用于开发兰科其他。

26、植物或兰科以外的其他植物的EST-SSR引物。 0042 本发明的另一方面还提供了本发明所述的EST-SSR引物在杏黄兜兰不同居群间、 不同品种间、 兜兰属植物间以及兰科植物间进行遗传多样性分析中的应用。 0043 在本发明中，“一对引物” 与 “引物对” 可互换使用， 是指由正向引物和反向引物组 成的一对引物；“一组引物” 与 “引物组” 可互换使用， 是指包括两对引物或更多对引物的一 组引物。 0044 本发明的实施方案中提供了技术方案带来的有益技术效果是： 首次开发了杏黄兜 兰的EST-SSR引物， 提供了13对多态性丰富、 可重复性好、 特异性高、 扩增稳定的亨利兜兰 EST-SSR引。

27、物， 为杏黄兜兰种质资源遗传多样性分析、 分子标记辅助育种以及兜兰属植物相 关的分子研究提供基础； 由于这些EST-SSR标记来源于DNA的转录区域， 与功能基因相关， 且 种间通用性好， 因此可用于同属植物的分子生物学研究， 尤其可用于分子标记辅助育种的 相关研究如遗传连锁图构建、 重要性状相关标记关联分析、 分离和鉴定新基因等； 并且， 本 发明提供的方法简单易高效、 生产成本低， 也可用于兜兰属其他植物EST-SSR引物的开发。 说明书 4/9 页 7 CN 107974510 A 7 0045 前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。 除了上述示意性方面、 实施 方式和特征， 通。

28、过参考下述详细说明， 进一步的方面、 实施方式和特征将更容易被理解。 0046 附图简述 0047 通过参考下述附图， 本发明的进一步的方面、 特征将更容易被理解。 本领域技术人 员应该理解， 这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式， 而不应将其视为是 对本发明范围的限制。 0048 图1示出了来自5个杏黄兜兰野生居群的170份不同杏黄兜兰材料样品中的部分样 品的DNA琼脂糖凝胶电泳图。 0049 图2-图131示出了表1所列出的13对引物在部分杏黄兜兰样品上的多态性扩增结 果的荧光电泳图， 其中： 0050 图2-图11示出了引物XH039在YL-3、 YL-11、 PH-6、 P。

29、H-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM-14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0051 图12-图21示出了引物XH047在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0052 图22-图31示出了引物XH097在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0053 图32-图41示出了引物XH115在YL-。

30、3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0054 图42-图51示出了引物XH116在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0055 图52-图61示出了引物XH119在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0056 图62。

31、-图71示出了引物XH137在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0057 图72-图81示出了引物XH146在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0058 图82-图91示出了引物XH176在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增。

32、结果的荧光电泳图； 0059 图92-图101示出了引物XH179在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0060 图102-图111示出了引物XH206在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0061 图112-图121示出了引物XH224在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 1。

33、4、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 和 0062 图122-图131示出了引物XH252在YL-3、 YL-11、 PH-6、 PH-13、 LW-7、 LW-33、 WM-8、 WM- 14、 LJ-7、 LJ-27样品上的多态性扩增结果的荧光电泳图； 0063 图132示出了利用表1列出的13对引物对来自5个杏黄兜兰野生居群的170份不同 杏黄兜兰材料进行聚类分析后的UPGMA聚类图。 说明书 5/9 页 8 CN 107974510 A 8 具体实施方式 0064 在下文中， 仅简单地描述了某些示例性实施例。 正如本领域技术人员可认识到的 那样， 在不脱离本。

34、发明的精神或范围的情况下， 可通过各种不同方式修改所描述的实施例。 因此， 附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。 0065 实施例1.杏黄兜兰EST-SSR引物的开发 0066 1.EST-SSR引物设计 0067 实验材料： 本发明所有实施例中使用的各种试剂或培养基成分均经商购获得。 0068 1)构建转录组文库： 提取杏黄兜兰花器官总RNA， 分离mRNA， 反转录合成并纯化 cDNA， 末端修复、 加腺嘌呤核苷连接测序接头， 通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200700bp 的片段， 将回收片段进行PCR扩增， 即构建得到转录组文库。 0069 2)转录组数据的获得： 将步骤1)得。

35、到的转录组文库进行测序， 获得转录组测序数 据， 将测序数据进行拼接， 得到unigenes的序列数据。 0070 3)SSR位点查找： 运用MIcroSAtellite identification tool(MISA)软件查找各 个unigene中可能存在的SSR位点。 SSR位点的查找的标准是： 二、 三、 四、 五和六核苷酸的重 复序列基序的次数分别不小于7、 5、 5、 5和5次。 0071 4)设计EST-SSR引物： 运用Primer3软件基于SSR位点两翼的序列设计SSR引物。 引 物设计的筛选策略为： 长度在1724bp之间(最适20bp)， 熔解温度(Tm)在5562之间，。

36、 PCR扩增产物大小在100350bp之间， 含有的GC比例在4060之间(最适为50)， 其他 为默认设置。 以最接近设计要求的引物组合作为SSR位点的引物。 用于PCR扩增的SSR引物由 生工生物工程(上海)有限股份公司合成。 0072 2.植物样品基因组DNA提取 0073 实验材料： 杏黄兜兰植物叶片分别取自云南省怒江州兰坪拉井镇、 福贡县匹河乡、 泸水县老窝乡、 隆阳区杨柳乡及隆阳区瓦马村的170个植株。 0074 用改良的CTAB法批量提取样品DNA， 具体操作如下： 0075 (1)2ml离心管(灭菌)， 装叶片， 管盖大小两片； 0076 (2)液氮研磨成粉末， 加65预热的C。

37、TAB 800 L(含 -巯基乙醇v/v 1)； 0077 (3)65水浴1h， 每十分钟摇动一次； 0078 (4)取出冷却至室温(或放入冰箱)， 加入预冷的氯仿： 异戊醇(24 1)800 L， 轻摇 5min(手摇)； 0079 (5)13000rpm离心10min， 取上清450 L至1.5 L离心管中， 再抽提一次(24 1， 450 L)， 吸上清300 L， 加入2倍体积的预冷无水乙醇600 L， 轻轻上下颠倒混匀； 0080 (6)-20放置30min， DNA抱团析出， 用枪头拖住DNA团， 将液体弃掉； 0081 (7)加入1ml 70乙醇洗涤沉淀， 上下颠倒6-8次， 7。

38、500rpm离心5min， 倒上清， 1ml 90乙醇洗涤沉淀， 7500rpm离心倒上清； 0082 (8)通风处吹干2h， 至DNA干燥透明， 无酒精味道； 0083 (9)加100 L无菌水复溶。 0084 进行琼脂糖凝胶电泳， 结果显示(图1)所提取的总DNA电泳条带清晰， 说明提取的 DNA质量好。 说明书 6/9 页 9 CN 107974510 A 9 0085 3.利用EST-SSR引物进行PCR扩增 0086 以上面提取的基因组DAN为模板， 利用上面设计的EST-SSR引物进行PCR扩增， 从而 鉴定引物有效性。 PCR反应体系如表2所示。 0087 4.PCR扩增产物的分。

39、析 0088 采用荧光毛细管电泳法对PCR产物进行电泳。 根据电泳图谱， 筛选条带清晰、 多态 性高、 特异性好的杏黄兜兰EST-SSR引物。 0089 结果筛选出13对扩增效果好且多态性高的引物对， 所述引物对如表1所示。 如图2- 图131所示， 利用13对引物共检测得到等位基因96条， 每对引物等位基因的变异幅度在2-21 之间， 平均等位基因数为7.38， 表明本发明开发的EST-SSR引物完全可以用于杏黄兜兰的遗 传多样性分析。 0090 实施例2.利用杏黄兜兰EST-SSR引物进行遗传多样性分析 0091 实验材料： 杏黄兜兰实验样品分别获自云南省怒江州兰坪拉井镇(LJ)、 福贡县。

40、匹 河乡(PH)、 泸水县老窝乡(LW)、 隆阳区杨柳乡(YL)及隆阳区瓦马村(WM)的170个植株。 0092 对这13对EST-SSR引物的扩增多态性信息进行分析(见下面表3)显示， 观测及期望 杂合度范围分别是0.1934-0.9722及0.0278-0.8066， Shannon信息指数的分布范围在 0.1709-2.2988之间， 平均值为1.05， 表明这170份杏黄兜兰材料的遗传分化比较丰富。 0093 利用13对引物对5个杏黄兜兰居群的遗传多样性分析(见下面表4)可知， 杏黄兜兰 5个居群的多态性位点百分率(PPL)在83.33-100之间变化， 平均值为93.33。 其中泸 。

41、水老窝(LW)和保山瓦马(WM)居群多态性位点百分率多达100， 保山杨柳(YL)居群多态性 位点百分率最低83.33。 5个居群的Nei s基因多样性指数(h)变幅在0.3978-0.5003之间， 平均值为0.4564； Shannon指数(I)在0.7207-0.9938之间变化， 平均值0.8803。 5个杏黄兜兰 居群中， 泸水老窝(LW)居群的遗传多样性指数h和I均表现为最高， 但LJ居群均为最低。 总体 来看， 5个居群的遗传多样性十分丰富。 0094 表3 13对EST-SSR引物扩增多态性信息分析 0095 说明书 7/9 页 10 CN 107974510 A 10 009。

42、6 0097 表4云南怒江两岸杏黄兜兰居群遗传多样性 0098 0099 实施例3.居群间遗传关系的聚类分析 0100 实验材料： 杏黄兜兰实验样品分别获自云南省怒江州兰坪拉井镇、 福贡县匹河乡、 泸水县老窝乡、 隆阳区杨柳乡及隆阳区瓦马村的170个植株。 0101 以Nei s遗传距离(D)和遗传一致度(IN)评价杏黄居群之间的遗传分化程度(表 5)。 5个居群的遗传相似性非常高， 在0.9188-0.9683之间变化； 相应地， 其遗传距离变化幅 度也不大， 保持0.0323-0.0847之间， 表明杏黄兜兰居群间遗传一致度较高， 遗传距离偏小。 0102 进一步的UPMGA聚类分析表明，。

43、 云南省怒江两岸的5个杏黄兜兰居群中， LY和LW的 遗传距离最小， 亲缘关系较近； LJ和PH居群遗传距离最大， 亲缘关系较远， 见图132。 0103 表5云南怒江两岸杏黄兜兰居群的遗传距离(下三角)与Nei s遗传一致度(上三 角) 0104 0105 实施例4.利用杏黄兜兰EST-SSR引物在兜兰属植物中进行通用性分析 0106 利用杏黄兜兰微卫星对来自兜兰属的其他四种兜兰属植物进行通用性分析， 结果 (见下面表6)显示13对EST-SSR引物在麻栗坡兜兰(P .malipoerise)、 硬叶兜兰 (P.micranthum)、 德氏兜兰(P.delenatii)、 同色兜兰(P.c。

44、oncolor)的扩增成功率分别为 0.62、 0.54、 0.62、 0.69， 说明这13对EST-SSR引物在兜兰属中具有较高的通用性。 证明利用 说明书 8/9 页 11 CN 107974510 A 11 杏黄兜兰转录组测序开发的13对EST-SSR引物可用于近缘物种的遗传多样性与遗传结构的 研究。 0107 表6 13对EST-SSR引物在其他四种兜兰属植物中的扩增情况 0108 0109 0110 以上所述， 仅为本发明的具体实施方式， 但本发明的保护范围并不局限于此， 任何 熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内， 可轻易想到其各种变化或替换， 这些都应涵盖在本发明的。

45、保护范围之内。 因此， 本发明的保护范围应以所述权利要求的保 护范围为准。 说明书 9/9 页 12 CN 107974510 A 12 序列表 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 杏黄兜兰EST-SSR标记引物、 其开发方法及其应用 2017-11-26 26 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 1 gttcgcctca ttgaagcatt 20 2 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 2 gggatttata gagctcgccc 20 3 2。

46、0 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 3 tccagccttc cacttttcac 20 4 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 4 ggaggaacgt acttggtgga 20 5 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 5 gggtcagcgt ctgctatctc 20 6 20 序列表 1/5 页 13 CN 107974510 A 13 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 6 aagccctct。

47、t atacagcgca 20 7 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 7 gaacggtcct gatcccacta 20 8 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 8 aaggtttgga ggaagctggt 20 9 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 9 agtcgcacaa gggacagact 20 10 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 10 actgtctgtg gttcccaa。

48、gg 20 11 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 11 gctgaaactg ggaaccttca 20 12 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 12 序列表 2/5 页 14 CN 107974510 A 14 ggagtggtga tcctgctgat 20 13 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 13 gaagaggttc gtgttggctc 20 14 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 14 caagcgtagc aaggaatgaa 20 15 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 15 cccttctccg tttcctctct 20 16 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 16 cttcctctgc tttctcacgc 20 17 20 DNA Paphiopedilum armeniacum (杏黄兜兰人工序列) 17 tttagcaaag accacagggg 20 。