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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811197533.8 (22)申请日 2018.10.15 (83)生物保藏信息 GDMCC No:60454 2018.09.25 (71)申请人 广东省生态环境技术研究所 地址 510650 广东省广州市天源路808号 (72)发明人 王跃强余震汤佳刘晓明 周顺桂周普雄 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 胡辉舒胜英 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C05F 15/00(2006.01) C05F 。
2、17/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一株假黄单胞菌及其微生物制剂在生物堆 肥方面的应用 (57)摘要 本发明公开了一株假黄单胞菌及其微生物 制剂在生物堆肥方面的应用， 本发明假黄单胞菌 GSS15T， 其分类命名为(Pseudoxanthomonas composti)GSS15T， 已保藏于广东省微生物菌种 保藏中心保藏， 保藏编号为： GDMCCNo.60454。 本 发明微生物种质资源GSS15T及其微生物制剂， 利 用该微生物制备的微生物制剂能够提高有机废 物高温好氧堆肥的发酵温度， 缩短堆肥发酵周 期， 提高堆肥发酵质量和效率。 权利。
3、要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 109294951 A 2019.02.01 CN 109294951 A 1.假黄单胞菌GSS15T， 其分类命名为(Pseudoxanthomonas composti)GSS15T， 已保藏于 广东省微生物菌种保藏中心保藏， 保藏编号为： GDMCC No.60454。 2.权利要求1所述的Pseudoxanthomonas composti GSS15T在堆肥中的应用。 3.一种微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)摇瓶培养： 将P.composti GSS15T接种于LB液体培养基中， 3037、 150240rpm培 养1。
4、236h； 2)种子罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液按25的接种量接入种 子罐中， 3037、 150200rpm培养1236h； 所用发酵培养基为LB液体培养基； 3)发酵罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液按210接种量接入发 酵罐中， 3037、 150200rpm培养2472h； 所用发酵培养基为LB液体培养基； 4)制剂制备： 将上述发酵液加入固体辅料中， 固体辅料与发酵液的质量比为1-3 1-5， 搅拌均匀， 烘干、 粉碎， 即得； 所述固体辅料选自麦麸、 秸秆、 米糠、 黄豆粉中的至少一种。 4.根据权利要求3所述的一种。
5、微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述固 体辅料由麦麸、 秸秆、 米糠和黄豆粉组成。 5.根据权利要求4所述的一种微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 所述固体辅料由麦 麸、 秸秆、 米糠和黄豆粉的质量比为12： 13： 13： 12。 6.根据权利要求3所述的一种微生物制剂的制备方法， 其特征在于， 步骤4)中， 所述烘 干的温度为2037。 7.权利要求36任一项所述方法制备的微生物制剂。 8.一种生物堆肥的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 在有机废物混合物料中按2 15比例接种权利要求7所述的微生物制剂， 混合， 进行生物堆肥。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特。
6、征在于， 所述有机废物混合物料选自畜禽粪便、 植 物。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述植物包括木屑、 秸秆、 植物残枝。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109294951 A 2 一株假黄单胞菌及其微生物制剂在生物堆肥方面的应用 技术领域 0001 本发明属于环境微生物领域， 具体涉及一株假黄单胞菌及其微生物制剂在生物堆 肥方面 的应用。 背景技术 0002 我国农业废弃物量大面广， 环境污染严重。 农业有机废弃物主要包括畜禽粪便和 农作物 秸秆， 其中尤以畜禽粪便更为突出， 已成为环境面源污染的重要来源。 农业废弃物 是一个重 大的环境污染源， 同时也是巨大生物质资。
7、源与能源库， 如畜禽粪便中含有大量农 作物生长所 必需的氮、 磷、 钾等营养成分和大量有机质， 可以用于生产优质有机肥， 提高土 壤有机质含 量， 改良土壤结构； 同时可消减污染， 使废弃物资源得到充分利用， 在获得最佳 经济效益的 同时完成生态农业良性循环。 因此， 构建农业废弃物资源化循环利用模式是农 业废弃物处置 的重要途径。 0003 目前农业废弃物资源化循环利用模式主要是利用利用农业废弃物作为原料， 通过 高温好 氧堆肥技术制备有机肥料， 实现其无害化、 减量化及资源化。 但是传统的高温好氧 堆肥技术 发酵温度低， 持续高温时间段， 发酵速度慢， 堆肥效率低。 现有研究表明， 接种外。
8、 源微生物 制剂可提高畜禽粪便等农业废弃物堆料发酵温度， 提高堆肥发酵质量。 如申请号 为 201010514582.7的中国专利介绍了一种将铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、 地衣芽孢杆 菌、 凝 结芽孢杆菌、 植物乳杆菌、 短小芽孢杆菌和珊瑚色诺卡氏菌以及将绿色木霉、 脱氮副 球菌、 黄曲霉、 黄孢原毛平革菌和圆褐固氮菌制备成两种堆肥接种剂， 用于堆肥发酵的不 同阶段。 专利号为CN 101486969A、 CN101186879A、 CN101696391A 等中国专利也公布了将 多种芽 孢杆菌、 放线菌、 酵母菌、 乳酸菌、 光合菌、 固氮菌、 霉菌等组合制备的堆肥复合制 剂。 但 未见有。
9、关于Pseudoxanthomonas composti及其微生物制剂应用于生物堆肥的报道。 发明内容 0004 本发明的目的之一在于弥补现有微生物种质资源的不足， 而提供一株新的微生物 菌种资 源Pseudoxanthomonas composti GSS15T及其应用 0005 本发明的另一目的在于提供一种利用Pseudoxanthomonas composti GSS15T制备 的微生物 制剂及其制备方法。 0006 本发明的再一目的在于提供上述微生物制剂在堆肥方面的应用。 0007 本发明所采取的技术方案是： 0008 假黄单胞菌GSS15T， 其分类命名为(Pseudoxanthom。
10、onas composti)GSS15T， 已保藏 于 广东省微生物菌种保藏中心保藏， 保藏编号为： GDMCC No.60454。 0009 Pseudoxanthomonas composti GSS15T在堆肥中的应用。 0010 一种微生物制剂的制备方法， 包括以下步骤： 0011 1)摇瓶培养： 将P.composti GSS15T接种于LB液体培养基中， 3037、 150 240rpm 培养1236h； 说明书 1/6 页 3 CN 109294951 A 3 0012 2)种子罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液按25的接种量 接入种 子罐中， 30。
11、37、 150200rpm培养1236h； 所用发酵培养基为LB液体培养基； 0013 3)发酵罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液按210接种量接 入发酵 罐中， 3037、 150200rpm培养2472h； 所用发酵培养基为LB液体培养基； 0014 4)制剂制备： 将上述发酵液加入固体辅料中， 固体辅料与发酵液的质量比为1-3 1-5， 搅拌均匀， 烘干、 粉碎， 即得； 所述固体辅料选自麦麸、 秸秆、 米糠、 黄豆粉中的至少一 种。 0015 进一步的， 步骤4)中， 所述固体辅料由麦麸、 秸秆、 米糠和黄豆粉组成。 0016 进一步的， 所述固体辅料由麦。
12、麸、 秸秆、 米糠和黄豆粉的质量比为12： 13： 1 3： 12。 0017 进一步的， 步骤4)中， 所述烘干的温度为2037。 0018 上述任一项所述方法制备的微生物制剂。 0019 一种生物堆肥的方法， 包括以下步骤： 在有机废物混合物料中按215比例接 种上述 所述的微生物制剂， 混合， 进行生物堆肥。 0020 进一步的， 所述有机废物混合物料选自畜禽粪便、 植物。 0021 进一步的， 所述植物包括木屑、 秸秆、 植物残枝。 0022 本发明菌株Pposti GSS15T， 简写为P.composti GSS15T， 已 于2018 年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，。
13、 保藏单位地址为广州市先烈中路 100号大院 59号楼5楼广东省微生物研究所， 保藏编号为： GDMCC No.60454。 0023 本发明的有益效果是： 0024 本发明提供了一种新的微生物种质资源及其微生物制剂， 利用该微生物制备的微 生物制 剂能够提高有机废物高温好氧堆肥的发酵温度， 缩短堆肥发酵周期， 提高堆肥发酵 质量和效 率。 附图说明 0025 图1本发明P.composti GSS15T的扫描电镜照片。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 0027 实施例1P.composti GSS15T的培养、 分离、 筛选、 鉴定及保存 0028 1.1。
14、菌株的培养、 分离 0029 本发明的P.composti GSS15T是从城市生活污泥堆肥样品富集培养进行分离纯化 得到的。 0030 具体分离纯化方法包括以下步骤： 0031 (1)取5.0g城市生活污泥堆肥样品接种于pH值为7.2的冨集分离培养基中， 30、 200rpm/min震荡培养； 当培养3d后， 以10的接种量将培养液转接至另一新鲜的冨集分离 培养基， 30、 200rpm/min震荡培养。 如此富集培养四代。 0032 (2)将第四代反应后的培养液采用稀释平板法稀释到10-5-10-6， 将稀释后的培养 液0.1mL 均匀涂布于琼脂固体培养基上， 置于30培养48h， 挑取单。
15、菌落进行分离与纯化。 说明书 2/6 页 4 CN 109294951 A 4 所述冨集 集分离培养基组成是： 蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， NaCl为10g/L， pH值为7.2。 所 述固体分离培养基组成是： 蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L， NaCl为10g/L， 琼脂粉20g/L， pH值为7.2。 0033 1.2菌体形态特性 0034 采用常规的细菌电子显微镜观察， 该菌株为革兰氏阴性菌， 杆状， 菌体大小为1.0- 1.6 m0.3-0.5 m， 极生鞭毛， 具运动性。 0035 1.3菌落形态特性 0036 在琼脂固体培养基平板上好氧培养48h后， 菌落圆形。
16、， 黄色， 中央突起， 菌落直径为 1.6-2.3 mm。 0037 1.4生理生化特征 0038 对菌株P.composti GSS15T进行生理生化特征的鉴定， 其结果见表1。 0039 表1.菌株生理生化鉴定结果 0040 0041 说明书 3/6 页 5 CN 109294951 A 5 0042 (表中： +表示为阳性， W表示为弱阳性， -表示为阴性) 0043 由鉴定结果(表1)可知： 菌株P.composti GSS15T好氧， 能在0-6NaCl的培养液中 生 长， 而最适NaCl为0.5； 生长温度为15-42， 最适生长温度为30； pH值为6-11， 最适 pH为8； 。
17、接触酶阳性， 氧化酶阴性； 具有明胶水解活性。 菌株P.composti GSS15T能够利用 D- 麦芽糖、 N-乙酰氨基葡萄糖、 D-甘露醇、 D-葡萄糖产酸； G+C含量为69.7。 0044 1.5分子生物学特征 0045 采用SDS-蛋白酶K， 氯仿-异戊醇(体积比24： 1)抽提， 0.6体积异丙醇沉淀的方法提 取细菌总DNA。 采用16S rRNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16S rRNA， 将PCR扩增 产物回 收后进行测序。 再将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序 列搜 索(Blast search)， 找出该菌株与数据库中同源性最高的模。
18、式菌株或保藏于ATCC或DSM 等 国际菌种保藏中心的菌株。 0046 根据比对结果发现， 该菌株序列与P.helianthiroo10T、 Stenotrophomonas panacihumi JCM 16536T、 Xanthomonas maliensis M97T最接近， 相似度分别为96.9、 96.7和96.4。 系统 发育分析显示， P.composti GSS15T属于Pseudoxanthomonas， 但由 于本发明菌株P.composti GSS15T与P.helianthiroo10T相似性小于97， 且具备显著不同 的表型特征， 与现有芽孢杆菌 具有显著不同的表型特。
19、征， 可以判定本发明菌株为 Pseudoxanthomonas属的一个新种。 命名 为Pposti GSS15T， 简写为 P.composti GSS15T， 已于2018年9月26日 在广东省微生物菌种保藏中心保藏， 保藏编号 为： GDMCC No.60454。 0047 实施例2P.composti GSS15T微生物制剂的制备 0048 具体方法为： 0049 (1)摇瓶培养： 从P.composti GSS15T斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基 的 锥形瓶中， 37、 200rpm/min摇床震荡培养24h。 所述的LB液体培养基配方为(g/L)： 酵母 提取物5g； 胰蛋。
20、白胨10g； NaCl 10g； 水1000mL； pH 7.2。 0050 (2)种子罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液接入10L发酵罐中， 37 、 180rpm/min发酵培养36h； 所用发酵培养基配方为上述液体培养基。 0051 (3)发酵罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液接入发酵罐中， 37、 200 rpm/min发酵培养48h； 所用发酵培养基配方为上述液体培养基。 0052 (4)制剂制备： 将上述发酵液浓缩5倍后加入固体辅料中， 固体辅料与发酵浓缩液 的质 量比为1.5 1， 搅拌均匀， 离心喷雾干燥机干燥， 包装。
21、装袋。 固体辅料麦麸、 秸秆、 米糠、 黄豆粉的混合质量比是： 1： 1： 1： 1。 制得的微生物制剂成品经活菌计数， 总菌数达到5亿 /克 以上。 0053 实施例3P.composti GSS15T微生物制剂的制备 0054 具体方法为： 0055 (1)摇瓶培养： 从P.composti GSS15T斜面上挑取菌苔一环接入装有LB液体培养基 的 锥形瓶中， 30、 200rpm/min摇床震荡培养24h。 所述的LB液体培养基配方为(g/L)： 酵母 提取物5g； 胰蛋白胨10g； NaCl 20g； 水1000mL； pH 7.2。 0056 (2)种子罐发酵： 将上述培养好的P.c。
22、omposti GSS15T发酵液接入10L发酵罐中， 30 、 200rpm/min发酵培养24h； 所用发酵培养基配方为上述液体培养基。 说明书 4/6 页 6 CN 109294951 A 6 0057 (3)发酵罐发酵： 将上述培养好的P.composti GSS15T发酵液接入发酵罐中， 30、 200 rpm/min发酵培养48h； 所用发酵培养基配方为上述液体培养基。 0058 (4)制剂制备： 将上述发酵液浓缩6倍后加入固体辅料中， 固体辅料与发酵液的质 量比 为2 1， 搅拌均匀， 离心喷雾干燥机干燥， 包装装袋。 固体辅料含有麦麸20、 秸秆 30、 米糠30、 黄豆粉20。
23、。 制得的微生物制剂成品经活菌计数， 总菌数达到5亿/克以 上。 0059 实施例4P.composti GSS15T微生物制剂在生物堆肥中的应用 0060 将畜禽粪便与粉碎的秸秆按一定1:1比例混合， 按0.5比例接种实施例2制备的 P. composti GSS15T微生物制剂， 调节物料pH至7.0， 混匀， 调节含水率至50， 在滚筒式堆 肥 发酵装置中进行堆肥， 堆肥周期为25d。 堆肥过程中每3d或温度超过60进行翻堆。 通过 堆肥温度变化、 C/N比、 种子发芽指数判定堆肥的腐熟度。 0061 对比例1 0062 另设置不接种微生物制剂作为对比例1， 对比例1其他操作均同实施例4。
24、。 0063 试验结果表明， 接种实施例2制备的微生物制剂后， 堆肥在1d后温度即可达到65 ， 达到最高温度70时间为发酵后第3d， 高温(55)为12d。 而不添加微生物制剂的堆 肥1d后温度为45， 达到最高温度65时间为发酵后第4d， 高温(55)为8d， 其 最高温度 及高温期维持时间均明显低于接种微生物制剂处理。 发酵完成后接种实施例2制备 的微生 物制剂的C/N比为16:1， 种子发芽指数为90.5， 均明显高于对照C/N(19： 1)和种 子发芽指 数(85.6)。 上述结果表明， P.composti GSS15T微生物制剂能够提高堆肥起温速率， 提高 堆肥发酵速度， 进而促。
25、进有机废物堆肥的腐殖化过程。 0064 实施例5P.composti GSS15T微生物制剂在生物堆肥中的应用 0065 按重量比1:1:1取畜禽粪污、 木屑、 秸秆初步混合均匀后， 按总物料2添加实施例 3中 制备的微生物制剂， 好氧堆肥发酵25d。 堆肥过程中每3d或温度超过60进行翻堆。 通 过 堆肥温度变化、 C/N比、 种子发芽指数判定堆肥的腐熟度。 0066 对比例2 0067 另设置不接种微生物制剂作为对比例2， 对比例2其他操作均同实施例5。 0068 表2为接种本发明微生物制剂对堆肥温度的影响。 从表2可以看出， 堆肥接种本发 明微 生物后， 最高温度可达75， 达到最高温度。
26、时间为发酵后第3d， 高温期可长达12d， 其 最 高温度及高温期维持时间均高于对照， 并且达到最高温度的时间也早于对照， 说明微生 物制 剂可明显促进堆肥前期发酵升温， 并提高堆肥温度， 而且高温持续时间长， 堆肥效率 高。 0069 表3为接种微生物制剂对堆肥腐熟度的影响。 从表3可以看出， 堆肥接种本发明微 生物 制剂后， 堆肥C/N降低。 与对比例2比较， 发芽指数升高， 并且发芽指数大于85的时间 明 显提早， 说明P.composti GSS15T微生物制剂可明显促进畜禽粪便生物堆肥过程， 提高 发酵效 率。 0070 表2.本发明菌株对堆肥温度的影响 0071 组别 堆肥最高温度/ 达到最高温度所需时间/d 高温期/d 实施例5 72 3 12 说明书 5/6 页 7 CN 109294951 A 7 对比例2 65 4 8 0072 表3.本发明菌株对堆肥腐熟度的影响 0073 0074 0075 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应 为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 109294951 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 109294951 A 9 。