技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种白蛋白/角蛋白(ALB/CK19)双表达 小鼠胚胎干细胞系及其建立方法。
背景技术
胚胎干细胞(ESC)是从哺乳动物囊胚内细胞团中分离得到的全能干细胞，可以无限 增殖并分化为全身200多种细胞类型。胚胎干细胞在悬浮培养情况下可以形成拟胚体 (EB)，拟胚体是胚胎干细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体，其三 胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞的分化过程。1996年，日本 学者abe等首先检测到了在拟胚体发育过程中内胚层基因的表达，并且其表达模式与小鼠 胚胎发育相一致，说明小鼠胚胎干细胞在体外分化为肝细胞具有可行性。自此，大量有关 体外分化ESC为肝细胞的研究迅速开展起来。由于胚胎干细胞肝向分化得到的细胞复杂 多样，如果要利用分化得到的肝细胞来进行细胞移植和治疗等用途，则需要对分化细胞中 的肝细胞进行标记以利于纯化。所以研究人员对胚胎干细胞进行必要的遗传修饰，利用报 告基因，例如荧光蛋白和细胞膜蛋白等，来标记特定的肝脏发育基因，以利于分化过程中 对肝细胞的形成进行追踪、分选以及定量。
2002年，基因标记技术第一次被应用在ES细胞向肝细胞的分化研究中，Yin实验室 利用基因敲入(Knock in)技术在小鼠ES细胞的甲胎蛋白(AFP)基因后连接绿色荧光蛋 白(EGFP)，用以标记在ES细胞分化过程中产生的肝祖细胞。随后在2003年，Yamamoto 等利用白蛋白ALB启动子调控的EGFP稳定转染胚胎干细胞，建立基因修饰胚胎干细胞 系，通过绿色荧光检测分化得到的肝细胞，并同时证明了标记ALB阳性的细胞具有肝细 胞基因表达特征和功能。随后的几年中，这种利用肝基因调控的报告基因标记分化得到肝 细胞的方法，在体外分化ES细胞的研究中屡见不鲜。日本科学家Teratani和Heo利用EGFP 标记ALB的小鼠胚胎干细胞，分别采用完全不同的诱导方法，成功诱导得到高比例的肝 脏细胞，Teratani采用单层培养法，第一步，利用RA刺激细胞为诱导内胚层阶段；第二 步，加入生长因子进行诱导则为肝诱导阶段；第三步，加入OSM继续诱导，为肝细胞成 熟阶段；第四步，利用肝细胞培养液培养分化细胞，对细胞进一步筛选，通过EGFP分选 得到ALB阳性的细胞，移植入肝纤维化损伤小鼠，发现绿色荧光细胞整合入小鼠肝脏同 时缓解肝病症状；而Heo采用拟胚体诱导法，通过氢化可的松、维生素C、尼克酰胺等化 合物诱导得到30％ALB阳性的细胞，将ALB阳性细胞分选后，移植入四氯化碳损伤小鼠 和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂缺陷性小鼠，结果发现分化得到的ALB阳性细胞能够整 合入小鼠肝脏中，并部分恢复小鼠肝脏功能。从这些研究可以看出，在体外诱导分化过程 中，由肝脏基因启动子调控的报告基因可以标记和分离类肝脏细胞。然而，从小鼠胚胎发 育的顺序上来看，肝细胞是由肝祖细胞(hepatoblast)分化而来，肝祖细胞则来源于内胚 层，已经有科学家利用基因敲入技术标记了内胚层相关基因来研究内胚层的分化情况，例 如Gondern和Nishikawa，可是对肝祖细胞的标记和分选的研究却鲜有报道。
肝祖细胞是一种在胚胎肝发育中处于特异时间点的带有肝细胞和胆管表皮细胞双潜 能的细胞类型，在特定的条件下，既可以分化为肝实质细胞又可以分化为胆管细胞。在以 往有关于ES细胞分化为肝祖细胞的报道中，AFP被作为肝祖细胞的一个标志性基因与 EGFP相连，通过检测AFP的表达来证明肝祖细胞的出现，但是实际上，AFP并不仅仅表 达在肝祖细胞中，它同时在脏壁内胚层也有高表达，而脏壁内胚层最终分化为胚外组织并 不参与肝脏的分化和发育，所以AFP的表达不能准确地标定肝祖细胞的存在。目前为止， 仍然没有公认的识别肝祖细胞的表面标志蛋白，所以这给ES细胞分化得来的肝祖细胞追 踪和分选带来一定的困难。但有一点科学家们是肯定的，那就是白蛋白ALB和角蛋白CK19 双表达的细胞则为肝祖细胞。
发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系。
本发明的第二个目的在于，提供一种建立白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系的 方法。
本发明的第三个目的在于，提供一种白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系的应用。
本发明提供的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系，所述小鼠胚胎干细胞系由白 蛋白/角蛋白双表达的小鼠胚胎干细胞传代培养建立，所述小鼠胚胎干细胞整合有红色荧 光/绿色荧光蛋白双报告基因，所述报告基因由组织特异性启动子白蛋白ALB或角蛋白 CK19调控。
根据本发明所述的小鼠胚胎干细胞系，所述绿色荧光蛋白为GFP。
根据本发明所述的小鼠胚胎干细胞系，所述红色荧光蛋白选自mRFP或tdTOMATO。
根据本发明所述的小鼠胚胎干细胞系，所述小鼠胚胎干细胞还整合有筛选基因，具体 的，所述筛选基因选自新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。
本发明的建立ALB/CK19双表达小鼠胚胎干细胞系的方法，包括以下步骤：
A)构建由启动子调控，包含报告基因、筛选基因的两载体；所述启动子选自：白蛋 白ALB或角蛋白CK19；所述报告基因选自：红色荧光蛋白mRFP、tdTOMATO或绿色荧 光蛋白EGFP；所述筛选基因选自：新霉素抗性基因Neo或潮霉素抗性基因Hygro；
B)将步骤A)所得两载体共转染小鼠胚胎干细胞；
C)筛选存活的、带有GFP/mRFP或GFP/tdTOMATO双基因标记的小鼠胚胎干细胞；
D)将步骤C)所得小鼠胚胎干细胞传代培养，建立ALB/CK19双表达的小鼠胚胎干 细胞系。
根据本发明所述的方法，所述两载体为：以ALB启动子调控的包含mRFP、Hygro基 因的载体以及以CK19启动子调控的包含EGFP、Neo基因的载体。
根据本发明所述的方法，所述两载体为：以ALB启动子调控的包含EGFP、Neo基因 的载体以及CK19启动子调控的包含人膜白hCD25基因、tdTOMATO、Hygro基因的载体。
本发明的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞系的应用，用于标志小鼠胚胎干细胞 分化得到肝祖细胞。
本发明选用ALB启动子和CK19启动子分别调控不同的报告基因，建立了两株基因 修饰胚胎干细胞系：E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP和E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES- tdTOMATO，这两株胚胎干细胞在体外诱导分化时，可以分化为带有绿色/红色荧光标志的 CK19/ALB双阳性的肝祖细胞，从而标记肝祖细胞的出现。与基因敲入的方法相比，本发 明利用转染组织特异启动子操纵报告基因的方法更简便、更快捷、具有更大的实用性。利 用本发明的白蛋白/角蛋白双表达小鼠胚胎干细胞分化，可以明确地分选得到发育阶段均 一的肝祖细胞，对接下来的肝祖细胞分化机制研究和细胞移植及治疗带来极大的有益效 果。
附图说明
图1A是pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)载体的结构图；图1B是pmCK19-EGFP载体 的结构图；图1C是pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)载体的结构图； 图1D是pmALB-EGFP-N2载体的结构图。
图2是mALB和mCK19启动子组织特异性的荧光镜检结果(200×)，其中：
A：转染pmCK19-EGFP的GBC-SD细胞；
B：转染pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)的GBC-SD细胞；
C：转染pmCK19-EGFP的NIH-3T3细胞；
D：转染pmALB-EGFP-N2的Huh7细胞；
E：转染pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)的Huh7细胞；
F：转染pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)的NIH-3T3细胞。
图3是基因组PCR检测转染载体在胚胎干细胞基因组整合情况的电泳结果，其中
A：pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)与pmCK19-EGFP共同转染组；
B：pmALB-EGFP-N2与pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)共同转染 组。
图4是基因修饰后胚胎干细胞形态学、全能性及分化潜能的荧光镜检结果，其中A： ALP染色(100×)；B：E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP细胞克隆(100×)；C、D：E14-ALB- mRFP/CK19-EGFP形成2天的拟胚体(40×)(100×)；E：E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP 细胞的DAPI染色(100×)；F：细胞膜蛋白SSEA-1染色(100×)；G：细胞核蛋白Oct4 染色(100×)；H：细胞免疫组化后可见光视野(100×)；I：E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25 -IRES-tdTOMATO细胞的DAPI染色(100×)；J：细胞膜蛋白SSEA-1染色(100×)；K： 细胞核蛋白Oct4染色(100×)；L：细胞免疫组化后可见光视野(100×)；。
图5是血清诱导E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP向肝祖细胞分化诱导的荧光镜检结果 (200×)，其中A：E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP形成拟胚体两天后，贴壁22天(总诱导 24天)的可见光视野；B：为A图的ALB红色荧光表达；C：为A图的CK19绿色荧光 表达；D：为B和C合并，可见少量的黄色荧光细胞(ALB+/CK19+)。
图6是无血清诱导E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdTOMATO向肝祖细胞分化 诱导的荧光镜检结果(200×)，其中A：球状克隆贴壁培养12天可见光视野；B：为A图 的ALB绿色荧光表达；C：为B图的CK19红色荧光表达；D：为B和C的合并，黄色 细胞为ALB和CK19双阳性细胞；E：FACS分析D图的分化细胞ALB-EGFP+/ CK19-hCD25+的分化比例。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验 室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
无特别注明外，本发明所用抗体均购自R&D公司；所用试剂均购自NEB公司。
本发明的实施例中使用的质粒：
pDB587：参考文献(M.Fischer et al.A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium.FEBS 577(2004)227-232)的方法构建。
pcDNA3.1/Hygro(-)载体：购自invitrogen公司，具有CMV启动子，氨苄霉素抗性基 因。
pGEMALBSVPA：参考文献(Zaret et al.Conditional enhancement of liver-specific gene transcription.PNAS 85(1988)9076-9080；Shiota et al.Hepatocyte growth factor inhibits growth of hepatocellular carcinoma cells.PNAS 89(1992)373＝377)的方法构建，具有ALB 启动子，氨苄霉素抗性。
pEGFP C1：购自CLONTECH公司，具有CMV启动子，卡那霉素抗性。
pcDNA3.1-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)：具有CMV启动子，氨苄霉素抗性基因， tdTomato片段，其构建步骤如下：
1)根据质粒ptdTomato的序列设计以下PCR引物，扩增tdTomato：
A1：5’AGTAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3’；
A2：5’ATGACTTAAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG3’
2)PCR扩增
以质粒ptdTomato(通过签署材料使用协议material transfer agreement，MAT获得)为 模板，以A1和A2为引物进行PCR扩增，具体如下：
反应体系(50μl)：10×Buffer5μl，dNTP(100μmol/L)4μl，MgSO4(50mM)2μl， HIFIDNA聚合酶0.5μl，P1、P2(10mM)各1μl，ddH2O 35.5μl。
反应条件：94℃，3min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，68℃ 90sec，循环25次；72℃，10min。
3)pcDNA3.1-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)载体的构建
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN公司的试剂盒回收约1.4kb的 tdTomato片段，用BamHI和AflII双酶切。同样用BamHI和AflII双酶切pcDNA3.1-hCD25- IRES/Hygro(-)载体(购自invitrogen公司)，得载体的骨架片段，将载体的骨架片段和 tdTomato片段用T4DNA连接酶(NEB公司)于16℃连接过夜。将连接产物转化DH5α 感受态细胞，在琼脂平板上(含氨苄抗生素)，于37℃培养12小时，从平板上挑取阳性 单菌落，提取质粒并进行酶切，电泳验证鉴定大小和方向，送invitrogen公司测序，将所 得载体命名为pcDNA3.1-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)，大小约为8.4kb。
实施例1、载体构建
1.1、pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)载体的构建
1.1.1、根据质粒pDB587的序列设计以下PCR引物，扩增mRFP：
P1：5’ACGCGGCCGCAGATCCACCATGGCCAGCTCCG3’
P2：5’CTCAAGCTTTTAGCTTCCAGCGCCTGTGCTATGT3’
1.1.2、PCR扩增
以质粒pDB587为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，具体如下：
反应体系(50μl)：10×Buffer5μl，dNTP(100μmol/L)4μl，MgSO4(50mM)2μl， HIFI DNA聚合酶0.5μl，P1、P2(10μM)各1μl，ddH2O35.5μl。
反应条件：94℃，3min；94℃ 30sec，62℃ 30sec，68℃ 60sec，循环25次；72℃，10min。
1.1.3、pcDNA3.1-mRFP/hygro载体的构建
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN公司的试剂盒回收约692bp的 mRFP片段，用Not I和HindIII双酶切。同样用Not I和HindIII双酶切pcDNA3.1/Hygro(-) 载体，得载体的骨架片段，将载体的骨架片段和mRFP片段用T4DNA连接酶(NEB公司) 于16℃连接过夜。
将连接产物转化DH5α感受态细胞，在琼脂平板上(含氨苄抗生素)，于37℃培养 12小时，从平板上挑取阳性单菌落，提取质粒并进行酶切，电泳验证鉴定大小和方向， 送invitrogen公司测序，将所得载体命名为pcDNA3.1-mRFP/hygro，大小约为6230kb。
1.1.4、pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)载体的构建
Mlu I和Xho I双酶切载体pGEMALBSVPA，得到2884bp的mALB启动子片段，将其 克隆入步骤1.1.3所得的载体pcDNA3.1-mRFP/hygro的Mlu I和Xho I位点，经酶切验证， 将得到载体命名为pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)，大小约为8.4kb，该载体具有ALB启动 子、mRFP基因和潮霉素抗性基因，载体结构如图1A所示。
1.2、pmCK19-EGFP载体的构建：
1.2.1、以小鼠尾基因组为模板，设计以下引物扩增CK19的启动子和5’UTR顺序(登 记号：AF237661)：
P3：5’AAATTAATTCTAAGACCCACC3’
P4：5’GATAGTCTAGAGAAGTCATGATG3’
1.2.2、PCR扩增
以小鼠尾基因组为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增，具体如下：
反应体系(50μl)：10×Buffer 5μl，dNTP(100μmol/L)1μl，Taq plus(100mM)1μl， P3、P4(10μM)各0.5μl，ddH2O41μl。
反应条件：94℃，3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，循环25次；72℃，10min。
1.2.3、pmCK19-EGFP载体的构建
将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN公司的试剂盒回收约2kb的 CK19启动子片段，经测序验证后用Vsp I和XbaI双酶切。用Vsp I和NheI双酶切pEGFP C1载体以去除CMV启动子，得载体的骨架片段，将载体的骨架片段和CK19启动子片段 用T4DNA连接酶(NEB公司)于16℃连接过夜。
将连接产物转化DH5α感受态细胞，在琼脂平板上(含卡那霉素)，于37℃培养12 小时，从平板上挑取阳性单菌落，提取质粒并进行酶切，电泳验证鉴定大小和方向，送 invitrogen公司测序，将所得载体命名为pmCK19-EGFP，大小约为6.2kb，该载体具有CK19 启动子、EGFP基因和卡那霉素抗性基因，载体结构如图1B所示。
1.3、pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)载体的构建
1.3.1根据质粒pmCK19-EGFP的序列设计以下PCR引物，扩增mCK19启动子：
P5：5’AAACGCGTTCTAAGACCCACC3’
P6：5’ATACTCGAGGAAGTCATGATG3’
1.3.2、PCR扩增
以质粒pmCK19-EGFP为模板，以P5和P6为引物进行PCR扩增，具体如下：
反应体系(50μl)：10×Buffer 5μl，dNTP(100μmol/L)5μl，Taq plus DNA聚合酶 0.5μl，P5、P6(10μM)各1μl，ddH2O46.5μl。
反应条件：94℃，3min；94℃30sec，55℃30sec，68℃150sec，循环25次；72℃， 10min。
1.3.3、pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)载体的获得
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用QIAGEN公司的试剂盒回收约2045bp的 mCK19启动子片段，用MluI和XhoI双酶切；同样用MluI和XhoI双酶切pcDNA3.1-hCD25- IRES-tdTOMATO/hygro(-)载体，得载体的骨架片段，将载体的骨架片段和mCK19启动子 片段用T4DNA连接酶(NEB公司)于16℃连接过夜。
将连接产物转化DH5α感受态细胞，在琼脂糖平板上(含氨苄抗生素)，于37℃培 养12小时，从平板上挑取阳性单菌落，提取质粒并进行酶切，电泳验证鉴定大小和方向， 送invitrogen公司测序，将所得载体命名为pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO /hygro(-)，大小约为9750kb，该载体具有CK19启动子、hCD25基因、tdTomato基因和潮 霉素抗性基因，载体结构如图1C所示。
1.4、pmalb-EGFP-N2载体的构建
参考文献(Heo，J.，et al.，Hepatic precursors derivedfrom murine embryonic stem cells contribute to regeneration of injured liver.Hepatology，2006.44(6)：p.1478-86)的方法构建 pmalb-EGFP-N2载体，该载体具有ALB启动子、EGFP基因和卡那霉素抗性基因，载体 结构如图1D所示。
实施例2、ALB和CK19启动子组织特异性表达
2.1、抽提质粒
将实施例1构建的四个载体参照QIAGEN公司大抽试剂盒说明书抽提质粒备用。
2.2、细胞转染
转染前一天将人肝癌细胞Huh7、小鼠成纤维细胞NIH-3T3、人胆管癌细胞GBC-SD (均购自中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所细胞库)铺于6孔板上，待细胞长 到60％-80％汇合时，使用QIAGEN转染试剂盒，分别将步骤2.1所得质粒与8μl增强剂 混合，室温放置5min，加入转染试剂混合5次，室温放置8min后，与1ml培养液混匀， 按照表1所示，分别加入细胞培养液中，转染24-48小时后，显微镜下观察荧光表达(200 ×)，结果如图2所示。
表1
序号 转染的载体 质粒浓度 (μg/μl)转染的细胞 ApmCK19-EGFP1GBC-SDBpcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)1GBC-SDCpmCK19-EGFP1NIH-3T3Dpmalb-EGFP-N21Huh7EpcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)1Huh7FpcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)1NIH-3T3
由图2可知，将载体pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)、pmalb-EGFP-N2瞬时转染人肝 癌细胞系Huh7和小鼠成纤维细胞系NIH-3T3，由于Huh7特异性表达ALB，因此仅在Huh7 细胞中检测到绿色荧光(图2D)和红色荧光(2E)，而在NIH-3T3细胞中检测不到荧光 表达(图2F)；同理，将载体pmCK19-EGFP、pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO /hygro(-)瞬时转染人胆管癌细胞系GBC-SD和NIH-3T3后，由于GBC-SD特异性表达 CK19，因此仅能在GBC-SD细胞中检测到绿色荧光(图2A)和红色荧光(2B)，而在NIH-3T3 细胞中检测不到荧光表达(图2C)，由以上结果可以证明ALB和CK19启动子具有组织 特异性。
实施例3、小鼠胚胎干细胞系的建立
3.1、质粒线性化
取实施例1构建的载体pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pcDNA3.1-mCK19-hCD25- IRES-tdTOMATO/hygro(-)各5μg，加入2μl的Nru I，37℃酶切过夜；取pmalb-EGFP-N2 和pmCK19-EGFP各5μg，加入2μl的Apal I，37℃酶切过夜。所得酶切产物加入1/10体 积的醋酸钠混匀，加入4μl的DNAmate，2.5倍体积的-20℃乙醇，混匀，13000rpm 4℃离 心15min得白色沉淀，用无菌水溶解备用。
3.2小鼠胚胎干细胞的培养
将胚胎干细胞E14.1(购自ATCC，保藏号CRL-1821)培养在无滋养层但是铺有0.1％ 明胶的培养瓶中，以GMEM(GIBCO公司)为基础培养基加入10％KO-血清、1％FBS、 100×P/S、100×非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠和1,000U/ml LIF 进行培养，培养2-3天后，利用0.25％的胰酶消化E14.1细胞，按1：5-8的比例传代。
3.3、转染小鼠胚胎干细胞
在转染前12小时，为胚胎干细胞E14.1换上新鲜培养液，每个样品需2-4×106细胞。
按表2所示，将nucleofector(Amaxa公司)的试剂与质粒和细胞混合后，放入电转 杯中，置于nucleofector样品槽中，选择电转仪(Amaxa公司)的程序A23进行转染，转 染后马上将细胞从电转杯中取出，放入事先预热到37℃的培养液中，48小时后，加入终 浓度350μg/ml G418和180μg/mlHygromycin B筛选细胞，两种抗生素筛选10天后，挑取 单细胞克隆，消化后放入12孔细胞培养板，扩增培养到6孔板中。
表2
转染组转染的载体浓度A pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-) pmCK19-EGFP1μg/μl B pmalb-EGFP-N2 pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)1μg/μl
3.4、基因组PCR检测基因整合情况
3.4.1、引物设计
针对mRFP和Neomycin设计引物：
P7(mRFP-F)：5’ACGCGGCCGCAGATCCACCATGGCCAGCTCCG3’
P8(mRFP-R)：5’CTCAAGCTTTTAGCTTCCAGCGCCTGTGCTATGT3’
P9(Neo-F)：5’ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG3’
P10(Neo-R)：5’CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT3’
P11(EGFP-F)：5’CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3’
P12(EGFP-R)：5’TTATCTAGATCCGGTGGATC3’
P13(IRES-F)：5’CCCTAACGTTACTGGCCGAAGC3’
P14(IRES-R)：5’TGTGCCATATATCATCGTGT3’
3.4.2、PCR扩增
按照基因组试剂盒说明书(上海TIANGEN公司)，提取经扩增的单细胞克隆的细胞 基因组，以基因组为模板，选择元件EGFP(引物P11、P12)和mRFP(引物P7、P8)为 一组，IRES(引物P13、P14)和Neomycin(引物P9、P10)为一组，分别对5株单克隆 细胞进行PCR检测，具体如下：
反应体系(50μl)：10×Buffer 5μl，dNTP(100μmol/L)5μl，Taq plus DNA聚合酶 0.5μl，上下游引物(10μM)各1μl，ddH2O46.5μl。
反应条件：95℃，5min；94℃ 30sec，退火温度30sec，72℃ 30sec，循环36-38次； 72℃，10min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测载体在细胞基因组中的整合情况，结果如图3 所示。由图3A可以看出，在转染组A中，挑取的5个单克隆细胞中有3个呈双阳性，说 明pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pmCK19-EGFP都已经整合入基因组。由此，建立了 ALB启动子调控红色荧光蛋白(mRFP)和CK19启动子调控绿色荧光蛋白(EGFP)的 ALB/CK19双表达的小鼠胚胎干细胞系，即E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP。
由图3B可以看出，在转染组B中，挑取的5个单克隆细胞中有4个呈双阳性，说明 pmalb-EGFP-N2和pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)都已经整合入基因 组。由此，建立了ALB启动子调控绿色荧光蛋白(EGFP)和CK19启动子调控人膜白 (hCD25)和红色荧光蛋白(tdTOMATO)的ALB/CK19双表达的小鼠胚胎干细胞系，即 E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdTOMATO。
3.5、胚胎干细胞系全能性检测
选取pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pmCK19-EGFP共转染得到的3株双阳性的克 隆中的一株建立的胚胎干细胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP做全能型检测，结果见图 4A—4G。
3.5.1、形态学观察
用显微镜观察(100×)，结果如图4B所示，遗传修饰后的胚胎干细胞集落呈鸟巢状， 边缘清晰，表面平滑，结构致密，隆起生长，与未转染ES细胞形态无区别。
3.5.2、荧光镜检
将E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干细胞培养在MEF上，用碱性磷酸酶ALP 染色，用荧光显微镜观察(100×)，结果如图4A所示。由图4A可见细胞克隆成蓝紫色， 而MEF未被染色，说明建系后的小鼠胚胎干细胞具有全能性，而成体细胞MEF则为阴性 结果。
3.5.3、拟胚体(EB)细胞的形成
将E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干细胞悬滴培养，用荧光显微镜观察，结果 如图4C(40×)、4D(100×)所示。由图4C、4D可见，建系的小鼠胚胎干细胞悬滴培养 形成拟胚体，成球状，表面有结节状突起。
3.5.4、免疫组化检测OCT4和SSEA-1的表达
将灭菌后的盖玻片置于培养皿中，铺上0.1％明胶，将建系后的小鼠胚胎干细胞培养 在上面，48小时后去除培养液。用PBS清洗三次，加入4％多聚甲醛，室温固定30min， 再次用含1％BSA的PBS清洗三次，每次5min，加入封闭液，室温放置30min，加入细胞 膜蛋白SSEA-1抗体(1：200)和细胞核蛋白OCT4抗体(1：400)，4℃过夜，含1％BSA 的PBS清洗三次后，加入二抗(Cy3-IgG，1:100，Cy2-IgG，1：50)，室温反应1h，PBS 洗三次，加入终浓度5μg/ml DAPI，室温避光放置10min，PBS清洗后，用中性树脂胶封 片，荧光显微镜观察(100×)，DAPI染色结果如图4E所示，细胞膜蛋白SSEA-1染色结 果如图4F所示，细胞核蛋白Oct4染色结果如图4G所示，细胞免疫组化后可见光视野如 图4H所示。
由图4F、4G的结果可知，E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干细胞的细胞膜蛋 白SSEA-1和细胞核蛋白Oct4均得到表达。
选取pmalb-EGFP-N2和pcDNA3.1-mCK19-hCD25-IRES-tdTOMATO/hygro(-)共转染得 到的4株双阳性的克隆中的一株建立的胚胎干细胞系E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES- tdTOMATO做全能型检测，其免疫组化检测OCT4和SSEA-1的表达结果见图4I—4L。
由图4J、4K的结果可知，E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdTOMATO小鼠胚胎 干细胞的细胞膜蛋白SSEA-1和细胞核蛋白Oct4均得到表达。
由检测结果可知，通过以上方法建立了带有双基因(红色荧光/绿色荧光)标记，即 ALB/CK19双表达的小鼠胚胎干细胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGF和E14-ALB-EGFP/ CK19-hCD25-IRES-tdTOMATO。
实施例4、传统/无血清分化法将建系的小鼠胚胎干细胞向肝祖细胞分化诱导
4.1、传统血清分化法
4.1.1、悬滴法制备EB细胞
配制血清诱导培养液：82％IMDM，15％FBS，1％MTG，1％Glutamin，1％P/S(青链 霉素)。
将E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP ES细胞稀释在血清诱导培养液中，按照每滴30μl， 1×103cell/30μl将细胞悬液滴在培养皿盖上，置于37℃培养箱培养2天。
4.1.2、诱导EB细胞分化
将培养2天后的EB细胞贴附于铺有I型胶原(BD公司)的培养皿中，持续用血清诱 导液培养，每天换液，镜检观测，结果见图5。
镜检观察，在诱导分化到第5天的时候，发现CK19开始表达，但是第7天时迅速消失。 如图5所示，直到第24天(贴壁培养第22天)又开始表达；ALB的表达是从23天开始，但 是ALB和CK19双表达的细胞很少，因为在ALB和CK19双阳性的细胞群周围分布着ALB阳 性细胞和CK19阳性细胞，由此可推断ALB和CK19双阳性的细胞可能是肝祖细胞一个瞬时 的状态，由于细胞分化的不同步性，使得ALB和CK19双阳性细胞的捕获具有“拖尾”现象。
由以上结果可知，E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP胚胎干细胞可以分化为带有荧光标示 的CK19/ALB)双阳性的肝祖细胞。
4.2、无血清分化法
4.2.1、悬浮法制备EB细胞
配制无血清诱导培养液：75％IMDM，25％Ham’s F-12，1％P/S，0.05％BSA，0.5％Vc， 1％MTG，0.5％N-2，1％B-27。
用无血清培养液悬浮培养1.0×104cell/ml E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES- tdTOMATO ES细胞于Petri培养皿中，48小时后，加入终浓度50ng/ml activin A(苯丙酸 诺龙A)，继续培养2-4天。
4.2.2、FACS分选定形内胚层细胞
收集EB细胞，用0.25％胰酶消化后，离心去上清，用含0.5％BSA的PBS重悬细胞， 清洗两次后，细胞计数，取2×105cell/ml，加入2μg大鼠IgG，室温封闭15min，分为两 管，其中一管加入抗小鼠CXCR4-Allophycocyanin(别藻蓝蛋白)单克隆抗体和抗小鼠 C-KIT-Phycoerythrin(藻红蛋白)单克隆抗体各10μl，另一管加入Isotype control-Allophycocyanin(别藻蓝蛋白同型对照)、Isotype control-Phycoerythrin(藻红蛋白 同型对照)各10μl作为阴性对照，4℃孵育30min，再次用含0.5％BSA的PBS清洗细胞三 次，用300μl PBS重悬细胞，进行流式细胞仪FACS分选(Becton Dickinson FACS Calibur) 得到定形内胚层细胞。
4.2.3、诱导定形内胚层细胞到肝祖细胞
在实施例4.2.1所述的无血清诱导培养液中加入50ng/mlBMP4(骨形态蛋白4)， 10ng/mlbFGF(碱性纤维生长因子)，10ng/mlEGF(表皮生长因子)，20ng/mlHGF(肝生长 因子)继续培养，经过FACS分选后得到定形内胚层细胞以4×105cell/ml细胞浓度悬浮培 养在petri培养皿中，悬浮培养2天后，分化的细胞再次球状生长，将球状体贴附于I型胶 原涂层的培养皿中继续诱导分化，隔天换液，每天镜检观测。
镜检观察到在第10天，克隆周围的细胞变成柱状上皮状，带有大量细胞空泡，同时 开始表达ALB，主要集中在克隆中间，但没观察到CK19的表达，在第12天时，CK19 和ALB开始同时表达，荧光显微镜观察结果如图6A—D所示(200×)，其中6A显示球状 克隆贴壁培养12天可见光视野；图6B为图6A的ALB绿色荧光；图6C为图6B的CK19 红色荧光；图6D为图6B和6C的合并，黄色细胞为ALB和CK19双阳性细胞。
利用FACS对第12天的分化细胞分析ALB-EGFP+/CK19-hCD25+细胞群，以同时分 化的E14.1细胞作为对照，结果如图6E所示。利用FACS软件分析得到双阳性细胞占总 分化细胞23％，ALB-EGFP+/CK19-hCD25-细胞为15％，则ALB阳性细胞为总分化细胞的 38％。
综上所述，本发明选用ALB启动子和CK19启动子分别调控不同的报告基因，建立 了两株基因修饰胚胎干细胞系：E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP和E14-ALB-EGFP/CK19- hCD25-IRES-tdTOMATO，这两株胚胎干细胞在体外诱导分化时，可以分化为带有绿色/ 红色荧光标志的CK19/ALB双阳性的肝祖细胞，从而得到发育阶段均一的肝祖细胞，对接 下来的肝祖细胞分化机制研究和细胞移植及治疗带来极大的有益效果。