一种转录因子蛋白及其编码基因与应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101456908 B (45)授权公告日 2011.10.05 CN 101456908 B *CN101456908B* (21)申请号 200810246802.5 (22)申请日 2008.12.31 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利。

2、权人 中国科学院遗传与发育生物学研 究所 地址 100101 北京市朝阳区大屯路中科院遗 传所 (72)发明人 阳文龙 张爱民 刘冬成 孙家柱 李俊明 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 CN 1733802 A,2006.02.15, CN 1216905 C,2005.08.31, (54) 发明名称 一种转录因子蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种转录因子蛋白及其编码基 因与应用。该蛋白是如下 a) 或 b) 的蛋白质 ： a) 由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白 质 ； b) 将序列表中序列 1 所示的。

3、氨基酸序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。 本发 明的转录因子具有 DREB 类转录因子家族共有的 特征 ： 具有一个含有 58 个氨基酸的 EREBP/AP2 保 守区。 该转录因子， 可与多个逆境应答基因启动子 共有的 DRE 调控元件特异结合， 调控这些基因的 表达， 从而激活植物体内的多种抗逆机制， 提高抗 逆能力。因此本发明转录因子为基因工程改良植 物耐逆性提供了一条新的技术途径， 尤其在小麦 等农作物抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应 用前景和巨大的经济价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 郭亮 。

4、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 2 页 CN 101456908 B1/1 页 2 1. 一种蛋白， 是由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 2. 权利要求 1 所述蛋白的编码基因。 3. 根据权利要求 2 所述的基因， 其特征在于 ： 所述蛋白的编码基因为如下 1) 或 2) 的 基因 ： 1) 其核苷酸序列是序列表中序列 2 中自 5末端第 1-768 位核苷酸所示 DNA 分子 ； 2) 其核苷酸序列是序列表中序列 2 所示 DNA 分子。 4.扩增权利要求2或3所述基因的引物对， 其特征在于 ： 所述引物对。

5、为如下1)或2)所 示 ： 1) 一条引物的序列如序列表中序列 3 所示， 另一条引物的序列如序列表中序列 4 所 示 ； 2)一条引物的序列如序列表中序列3所示， 另一条引物的序列如序列表中序列5所示。 5. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的重组载体。 6. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的重组菌。 7. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的转基因细胞系。 8. 含有权利要求 2 或 3 所述编码基因的表达盒。 9. 根据权利要求 5 所述的重组载体， 其特征在于 ： 所述重组载体为在载体 YEpGAP112 的多克隆位点插入序列表中序列 2 中自 5 末端起第 1-76。

6、8 位所示核苷酸序列得到的重组 载体。 10. 一种培育抗逆性植物的方法， 是将权利要求 2 或 3 中所述的基因导入植物中， 培养 得到抗逆性植物。 11. 根据权利要求 10 所述的方法， 其特征在于 ： 所述抗逆性为抗低温和 / 或抗干旱。 12. 根据权利要求 10 或 11 所述的方法， 其特征在于 ： 所述植物为欧山羊草 (Aegilops biuncialis)。 权 利 要 求 书 CN 101456908 B1/9 页 3 一种转录因子蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种转录因子蛋白及其编码基因与应用。 背景技术 0002 转录因子是生物体内与基因启动子。

7、区顺式作用元件相结合、 调控该基因表达的蛋 白质。它们在生物的生命活动中起着非常重要的作用， 不仅参与了生物体的生长、 发育， 同时也调控着生物体对外界逆境如干旱、 高盐、 低温、 病原物侵染等的应答反应。1994 年， Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki 在对拟南芥逆境应答基因 rd29A 启动子区域的研究 中， 发现了一个逆境胁迫应答顺式作用元件， 即干旱应答元件 (DRE， drought-responsive element)。1998 年， 刘强等运用酵母单杂交方法 (yeast one-hybrid method) 克隆 出与该 DRE 元件结合的反式作。

8、用因子编码基因， 即干旱应答元件结合蛋白 (DREB， drought-responsive element binding protein)基因。 该DREB基因表达的产物与顺式作 用元件 DRE 结合后， 可激活一系列与植物抗性相关基因的表达。自从对 DREB 类转录因子的 研究工作开展以来， 对其结构和功能的研究及其在植物遗传改良上的应用研究已成为生物 化学及分子生物学等领域研究的热点。 目前已发现植物中许多逆境应答基因启动子区域含 有 DRE 元件 ； DREB 类转录因子在植物中普遍存在， 是植物中特有的调控对外界干旱、 高盐、 低温等逆境的应答反应的转录因子， 具有巨大的潜在应用价。

9、值。 0003 在水资源日益短缺的当今世界， 大量培育耐旱节水高产优质的农作物新品种是解 决粮食危机、 实现农业可持续发展的最有效方式。 小麦是世界上的重要粮食作物， 是我国第 三大粮食作物， 对我国粮食安全、 民生和可持续发展有着至关重要的意义。 在我国由干旱引 起的小麦减产常年达到 15以上， 干旱是首要的减产因子。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供一种转录因子蛋白及其编码基因， 该蛋白能与 DRE 元件 特异结合。 0005 本发明所提供的蛋白， 来源于欧山羊草 (Aegilops biuncialis)， 是如下 a) 或 b) 的蛋白质 ： 0006 a) 由序列表中序列 。

10、1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0007 b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和 / 或添加且具有相同功能的由 a) 衍生的蛋白质。 0008 为了使上述 (a) 中的蛋白便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0009 表 1 标签的序列 0010 标签 残基 序列 说 明 书 CN 101456908 B2/9 页 4 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLAG 8 DYKDDD。

11、DK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0011 上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得 到。上述 (b) 中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或 几个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0012 所述蛋白的编码基因为如下 1)、 2)、 3) 或 4) 的基因 ： 0013 1) 其核苷酸序列是序列表中序列 2 中自 5末端第 1-768 位核苷酸所示 D。

12、NA 分 子 ； 0014 2) 其核苷酸序列是序列表中序列 2 所示 DNA 分子 ； 0015 3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码所述蛋白的 DNA 分子 ； 所 述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中， 在 65下杂交， 并用该 溶液洗膜。 0016 4) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列具有 95以上的同源性且编码所述蛋白的 DNA 分 子。 0017 序列表中 SEQ ID ： 2 所示的 DNA 长度为 945bp， 其中， 自其 5 端的第 1-768 位 核苷酸为编码序列 ( 开放阅读框架 )。

13、， 自 5 端第 127 到第 300 位核苷酸为 EREBP/AP2 保守 结构域的编码序列， 编码 58 个氨基酸， 其 3 端的非翻译区长度为 177bp ； 该基因的蛋白的 氨基酸序列为序列表中 SEQ ID ： 1 所示， 由 255 个氨基酸残基组成， 该蛋白具有 DREB 蛋 白家族的特征， 其中自 N 端第 43-100 位为 EREBP/AP2 保守结构域。将欧山羊草的 DREB 基 因命名为 AebDREB， 编码蛋白命名为 AebDREB。 0018 扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。 0019 所述引物对具体可为如下 1)、 2) 或 3) 所。

14、示的引物对 ： 0020 1) 一条引物的序列如序列表中序列 3 所示， 另一条引物的序列如序列表中序列 4 所示 ； 此引物对可用于扩增基因的全长 ； 0021 2) 一条引物的序列如序列表中序列 3 所示， 另一条引物的序列如序列表中序列 5 所示 ； 此引物对可用于扩增基因的编码区 ； 0022 3) 一条引物的序列如序列表中序列 6 所示， 另一条引物的序列如序列表中序列 7 所示 ； 此引物对可用于扩增基因的 3 末端区。 0023 含有上述任一所述基因的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系或表达盒也属于本发 明的保护范围。 0024 所述重组载体具体可为在载体YEpGAP112的多克。

15、隆位点插入序列表中序列2中自 5 末端起第 1-768 位所示核苷酸序列得到的重组载体 ； 所述重组菌是可以通过将上述任一 说 明 书 CN 101456908 B3/9 页 5 种重组载体导入大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌或酵母得到的。 0025 本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性植物的方法。 0026 本发明所提供的培育抗逆性植物的方法， 是将上述任一所述基因导入植物中， 培 养得到抗逆性植物。 0027 所述基因可以通过重组载体导入植物。 0028 所述抗逆性可为抗低温和 / 或抗干旱。 0029 所述植物具体可为欧山羊草 (Aegilops biuncialis)。 0030 本发明的转。

16、录因子具有 DREB 类转录因子家族共有的特征 ： 具有一个含有 58 个氨 基酸的 EREBP/AP2 保守区。酵母单杂交实验证明该转录因子具有转录激活功能。此外实验 还表明 AebDREB 基因明显受干旱和低温的诱导表达。所以该转录因子， 可与多个逆境应答 基因启动子共有的 DRE 调控元件特异结合， 调控这些基因的表达， 从而激活植物体内的多 种抗逆机制， 提高抗逆能力。本发明的转录因子 AebDREB 可同时激活一系列抗性相关基因 的表达， 克服了传统植物抗逆基因工程中用单个功能基因提高抗逆性的局限性， 使植物抗 逆特性的大幅度提高成为可能。 因此本发明转录因子为基因工程改良植物耐逆性。

17、提供了一 条新的技术途径， 尤其在小麦等农作物抗逆性的综合改良过程中具有广泛的应用前景和巨 大的经济价值。 0031 附图说明 0032 图 1 为不同胁迫处理下欧山羊草总 RNA 的琼脂糖凝胶检测结果。 0033 图 2 为不同胁迫处理下欧山羊草 AebDREB RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶检测结果。 0034 图 3 为不同胁迫处理下欧山羊草 tubulin RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶检测结果。 0035 图 4 为 0mM 3-AT 条件下， 欧山羊草 AebDREB 酵母单杂交功能鉴定结果。 0036 图 5 为 40mM 3-AT 条件下， 欧山羊草 AebDREB 酵母单杂交。

18、功能鉴定结果。 具体实施方式 0037 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0038 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从生物公司购买。 0039 实施例 1、 蛋白及其编码基因的发现 0040 1、 欧山羊草 AebDREB 基因的分离， 具体包括如下步骤 ： 0041 1) 将欧山羊草 (Aegilops biuncialis) 种子 ( 购自中国农业科学院 ) 浸泡于 1 次氯酸钠溶液中消毒 20 分钟后， 用无菌水洗三遍， 播于 1/2MS 固体培养基 (pH5.8) 中， 在 22、 16 小时 /8 小时 ( 光 / 暗 ) 的条件下培。

19、养 14 天后， 取幼苗洗净， 将其置于超净工作台 上自然风干 4 小时， 随后用液氮速冻， 保存于 -80冰箱用于总 RNA 的提取。 0042 2) 用 Trizol 法 (Trizol 购于天根公司 ) 提取步骤 1) 保存的受脱水胁迫 4 小时的 欧山羊草植株的总 RNA， 经 DNA 酶 I 处理后备用。 0043 3) 用 oligo(dT) 引物和 MMLV 反转录酶 (Promega 公司产品 ) 将步骤 2) 的总 RNA 反转录成 cDNA。oligo(dT) 引物序列为 ： 5 -ACTCTATGAGAATTCGATGAGCGATCTGTTTTTTTTTT TTTTTTT。

20、T-3 。反应体系及参数为 ： 0044 说 明 书 CN 101456908 B4/9 页 6 0045 反应条件为 ： 42 90 分钟， 75 10 分钟。反转录产物存于 -20待用。 0046 4)根据已报道的DREB基因的AP2/EREBP保守区序列设计一个兼并引物， 引物序列 为 ： 引物 1( 正向引物 ) ： 5 -G(C/a)CGC(C/t/g)TGCCTCAACTTC-3 ； 以步骤 3) 中的 cDNA 为 模板， 在引物 1 和 oligo(dT)( 反向引物 ) 的引导下， 用 PCR 方法扩增得到欧山羊草 DREB 基 因的 3 - 末端 ； 其中， 0047 反应。

21、体系及参数 0048 反应条件 0049 PCR 产物经纯化回收后克隆到 T 载体 (Promega 公司产品 ) 中， 挑阳性克隆送到诺 赛公司测序， 得到欧山羊草 DREB 基因的 3 - 末端 cDNA 序列。 0050 5) 将步骤 4) 获得的欧山羊草 DREB 基因的 3 - 末端 cDNA 序列送到基因库进行 blast， 与已报道的 DREB 基因序列进行序列比对， 从中找出相似性高的基因序列 ； 以这些序 列为基础， 在其 5 - 末端和 3 - 末端分别设计基因特异引物， 引物序列为 ： 引物 2( 正向引 物) ： 5 -ATGGACGTCGCCGACATC-3 ， 引物。

22、3(反向引物) ： 5 -CCCTTTTCCCCAAAACTAGAAACC-3 ； 以步骤 3) 中的 cDNA 为模板， 在引物 2 和引物 3 的引导下， 用步骤 4) 的 PCR 反应体系及反 应条件扩增得到欧山羊草 DREB 基因的全长 cDNA 序列。 0051 将得到的欧山羊草 DREB 基因的全长 cDNA 序列克隆测序， 得到如序列表中 SEQID ： 2 所示的核苷酸序列， 该序列长度为 945bp， 3 端的非翻译区长度为 177bp， 其编码序列 ( 开放阅读框架 ) 长度为 768bp， 是自 SEQ ID ： 2 的 5 端的第 1-768 位碱基， 其编码的蛋 白的。

23、氨基酸序列如序列表中 SEQ ID ： 1 所示， 具有 255 个氨基酸残基的蛋白质。将欧山 羊草的 DREB 基因命名为 AebDREB， 编码的蛋白命名为 AebDREB。对 AebDREB 进行生物信息 学分析， 结果表明 ： AebDREB 具有 DREB 蛋白家族的特征， 其中自 N 端第 43-100 位为 EREBP/ AP2 保守结构域。 0052 2、 冷、 干旱和盐诱导处理下 AebDREB 基因的表达模式 说 明 书 CN 101456908 B5/9 页 7 0053 1) 分别对实验 1 中培养的欧山羊草幼苗进行冷诱导、 干旱诱导和盐诱导处理， 处 理方法如下 ： 。

24、1) 冷诱导处理 ： 欧山羊草幼苗置于 4光照培养箱处理， 其根部置于蒸馏水 中 ； 2) 干旱诱导处理 ： 欧山羊草幼苗置于超净工作台上风干处理， 湿度为 50 ； 3) 盐诱导 处理 ： 欧山羊草幼苗的根部置于 250mM NaCl 溶液中进行处理 ； 分别于处理后 0、 1、 2、 4、 8 和 24 小时对经上述不同方法诱导处理的欧山羊草幼苗间隔取样， 然后将样品立即用液氮速 冻， -80保存用于提取总 RNA。用 Trizol 法 (Trizol 购于天根公司 ) 提取上述不同样品 的总 RNA， 并用 1.0琼脂糖凝胶电泳对不同样品的总 RNA 进行检测， 检测结果如图 1A， B。

25、， C 所示 (A 为冷处理， B 为干旱处理， C 为盐处理 ； 泳道 0、 1、 2、 4、 8 和 24 分别表示第 0、 1、 2、 4、 8 和 24 小时采集的样品的总 RNA)。 0054 2) 用 RT-PCR 法分析冷、 干旱、 盐诱导条件下 AebDREB 基因的表达模式 0055 分别以步骤 1) 提取的不同样品的总 RNA 为模板， 在引物 2( 正向引物 ) ： 5 -ATGGACGTCGCCGACATC-3 ， 和引物 4( 反向引物 ) ： 5 -GCTAAATTAGTCGAACAAGCAGCTCC-3 的引导下， 用One-step realtime RT-PC。

26、R kit(TaKaRa)进行RT-PCR反应， 检测在冷、 干旱和 盐诱导条件下AebDREB的表达模式， 并在引物5(正向引物) ： 5 -ACCGCCAGCTCTTCCACCCT-3 和引物 6( 反向引物 ) ： 5 -TCACTGGGGCATAGGAGGAA-3 引导下， 用同样的参数条件及反应 条件下 PCR 扩增欧山羊草的看家基因微管蛋白 tubulin 基因 ( 内参 )， RT-PCR 反应体系 为 ： RNase Free H2O 10.5l， 10One step RNA PCR 缓冲液 2.5l， dNTP 混合物 ( 各 10mM)2.5l， MgCl2(25mM)5。

27、l， RNase Inhibitor(40U/l)0.5l， M-MLV RTase(25U/ l)0.5l， TaKaRa Ex Taq HS(5U/l)0.5l， 引物2和引物4(各10M)各1l， 总RNA 1g ； 反应条件 ： 先 50 30 分钟， 94 2 分钟 ； 再 94 30 秒， 58 30 秒， 72 60 秒， 进行 22 个循环 ； 最后 72 5 分钟。将 PCR 产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果如图 2A， B， C 和图 3A， B， C 所示。( 图 2 和图 3 中， A 表示受冷诱导处理的欧山羊草， B 表示受干 旱诱导处理的欧山羊草， C。

28、表示受盐诱导处理的欧山羊草， 泳道0、 1、 2、 4、 8和24分别表示第 0、 1、 2、 4、 8 和 24 小时采集的样品的 RT-PCR 产物， 图 2 示目的条带， 图 3 示 tubulin 基因 ) 0056 结果表明基因 AebDREB 受低温和干旱诱导表达。 0057 实施例 2、 蛋白及其编码基因的功能 0058 1、 基因 AebDREB 的制备 0059 1) 以实施例 1 中基因 AebDREB 的全长 cDNA 序列为模板， 在引物 2 和引物 4 的引导 下， 用高保真 Pfu DNA 聚合酶 (Promega 公司 ) 通过 PCR 法获得 AebDREB 的。

29、编码区 ； 其中， 0060 反应体系及参数 0061 反应条件 说 明 书 CN 101456908 B6/9 页 8 0062 2) 将步骤 1) 获得的 AebDREB 的编码区片段克隆到载体 pGEM-T(Promega 公司 ) 上， 获得重组载体， 经测序检测无误后， 用限制性内切酶 Sac II 和 Pst I 从重组载体上切 下 AebDREB 的编码区片段， 并将其与用相同酶酶切的 YEpGAP112(ATCC 公司 ) 连接获得 重组载体， 命名为 AebDREB/YEpGAP112， 测序进行验证， 结果表明载体构建正确， 插入载体 YEpGAP112的Sac II和Ps。

30、t I位点间的基因序列为序列表中序列2中自5 末端起第1-768 位核苷酸， 获得阳性重组载体。 0063 将阳性重组载体 AebDREB/YEpGAP112 分别转化到含双报道子 (HIS3 和 LacZ) 的含野生型 DRE 元件酵母菌株 YM4271(Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K， Plant Cell， 1998， 10(8) ： 1391-1406， )( 中国科 学院遗传与发育生物学研究所 ) 和含突变型 DRE 元件酵母菌株 YM4271(Liu Q， K。

31、asuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K， Plant Cell， 1998， 10(8) ： 1391-1406， )( 中国科学院遗传与发育生物学研究所 ) 中， 再将转化有重组载体 AebDREB/YEpGAP112 的重组酵母菌株涂于含有 3-AT( 浓度分别为 0mM， 40mM) 的 SD-Agar 三 缺固体培养基 (His-， Leu-， Ura-， Clontech 公司 ) 上检测其生长情况。 0064 同时以含拟南芥 DREB1A 的重组载体 DREB1A/YEpGAP112。

32、(Liu Q， Kasuga M， Sakuma Y， Abe H， Miura S， Yamaguchi-Shinozaki K， Shinozaki K， Plant Cell， 1998， 10(8) ： 1391-1406， ) 为对照， 将其分别转化到含双报道子 (HIS3 和 LacZ) 的含野生型 DRE 元件 酵母菌株 YM4271 和含突变型 DRE 元件酵母菌株 YM4271 中， 再将转化有重组载体 DREB1A/ YEpGAP112 的重组酵母菌株分别涂于含有 3-AT( 浓度分别为 0mM， 40mM) 的 SD-Agar 三缺固 体培养基 (His-， Leu-， 。

33、Ura-， Clontech 公司 ) 上检测其生长情况。 0065 结果如图 4-5 所示。1 为拟南芥 DREB1A 在含野生型 DRE 元件酵母中 ； 2 为 AebDREB 基因在含野生型DRE元件酵母中 ； 3为野生型酵母对照 ； 4为拟南芥DREB1A基因在含突变型 DRE 元件酵母中 ； 5 为 AebDREB 基因在含突变型 DRE 元件酵母中 ； 6 为突变型酵母对照。 0066 结果表明含 AebDREB 和野生型 DRE 元件的酵母菌株在 3-AT-SD-Agar 三缺培养基 上生长良好， 而含 AebDREB 和突变型 DRE 元件的酵母菌株在 3-AT-SD-Agar。

34、 三缺培养基上不 能生长。说明 AebDREB 可特异结合 DRE 元件， 从而激活下游目的基因的表达， 具有调控欧山 羊草抗逆性应答的功能。 0067 序列表 0068 7 0069 1 0070 255 0071 PRT 0072 山羊草属 欧山羊草 (Aegilops biuncialis) 0073 1 0074 Met Asp Val Ala Asp Ile Ala Ser Pro Ser Ala Gln Gln Val Gln Gly 0075 1 5 10 15 0076 His Arg Thr Val Ser Ser Glu Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gl。

35、y Arg Thr 0077 20 25 30 0078 Lys Phe His Glu Thr Arg His Pro Leu Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg 说 明 书 CN 101456908 B7/9 页 9 0079 35 40 45 0080 Gly Arg Val Gly Gln Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Ile Lys 0081 50 55 60 0082 Gly Ser Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asn Thr Ala Glu Met Ala Ala 0083 65 70 75。

36、 80 0084 Arg Ala His Asp Ala Ala Val Leu Ala Leu Ser Gly Arg Ala Ala Cys 0085 85 90 95 0086 Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Arg Met Leu Pro Val Leu Ala Ala 0087 100 105 110 0088 Gly Ser Phe Gly Phe Gly Ser Ala Ser Glu Ile Lys Ala Ala Val Ala 0089 115 120 125 0090 Val Ala Val Val Ala Phe Gln Arg Lys 。

37、Gln Ile Ile Pro Val Ala Val 0091 130 135 140 0092 Ala Val Val Ala Leu Gln Lys Gln Gln Val Pro Val Ala Val Ala Val 0093 145 150 155 160 0094 Val Ala Leu Gln Gln Leu Lys Val Pro Val Ala Val Ala Val Val Ala 0095 165 170 175 0096 Leu Gln Gln Gln Gln Ile Ile Leu Pro Val Ala Cys Leu Ala Pro Glu 0097 180 1。

38、85 190 0098 Phe Tyr Met Ser Ser Gly Asp Leu Leu Glu Leu Asp Glu Glu Gln Trp 0099 195 200 205 0100 Phe Gly Gly Met Asp Ala Gly Leu Leu Arg Glu Leu Gly Ala Gly Tyr 0101 210 215 220 0102 Ala Arg Val Thr Ala Gly Arg Glu Arg Glu Ala Gly Glu Arg Arg Ala 0103 225 230 235 240 0104 Glu Arg Arg Pro Asp Thr Al。

39、a Met Glu Leu Leu Val Arg Leu Ile 0105 245 250 255 0106 2 0107 945 0108 DNA 0109 山羊草属 欧山羊草 (Aegilops biuncialis) 0110 2 0111 atggacgtcg ccgacatcgc ctccccgtct gcccagcagg tgcagggcca ccggacggtg 60 0112 tcgtcggagc cgccgaagcg gccggccgga cgcaccaagt tccacgagac gcgccacccg 120 0113 ctgtaccgtg gcgtgcggcg ccgt。

40、ggccgc gtcgggcagt gggtgtgcga ggtgcgcgtg 180 0114 cccgggatca agggctccag gctctggctc ggcaccttca acacggccga gatggcggcg 240 0115 cgcgcgcacg acgccgccgt gctcgcgctc tccggccgcg ccgcctgcct caacttcgcc 300 0116 gattccgcat ggcgcatgct gcccgtgctc gcggccgggt ccttcggctt cggcagcgcg 360 0117 agcgagatca aggccgccgt cgcc。

41、gtcgcc gtcgtcgcgt tccagcggaa gcagattatt 420 说 明 书 CN 101456908 B8/9 页 10 0118 ccggtcgccg tcgcggtcgt tgctctccag aagcagcagg ttccggtcgc cgtggccgtc 480 0119 gtggcgctcc agcagctgaa ggttccggtc gccgtcgccg tcgtggcgct ccagcagcag 540 0120 cagatcattc ttccagtcgc gtgcctggcg cccgagtttt acatgtcttc cggcgacctg 600 01。

42、21 ttggagctcg acgaggagca gtggtttggc ggcatggacg ccgggttact acgcgagctt 660 0122 ggcgcagggt atgctcgtgt caccgccgga cgagagcgcg aggccggaga acggcgagca 720 0123 gagcggcgtc cagacaccgc tatggagctg cttgttcgac taatttagcg ctactgtcaa 780 0124 gttgtagata gtcgcgttct tccagatttc ggaagaaacg tagtactagg cagtttgttc 840 01。

43、25 cttcatttgt agtagtattt gtcgaggtcc cggtttctag ttttggggaa aagggctaga 900 0126 ttgcttaata catcaattgt tggttctgaa aaaaaaaaaa aaaaa 945 0127 3 0128 18 0129 DNA 0130 0131 0132 3 0133 atggacgtcg ccgacatc 18 0134 4 0135 24 0136 DNA 0137 0138 0139 4 0140 cccttttccc caaaactaga aacc 24 0141 5 0142 26 0143 DNA。

44、 0144 0145 0146 5 0147 gctaaattag tcgaacaagc agctcc 26 0148 6 0149 46 0150 DNA 0151 0152 0153 6 0154 actctatgag aattcgatga gcgatctgtt tttttttttt tttttt 46 0155 7 0156 18 说 明 书 CN 101456908 B9/9 页 11 0157 DNA 0158 0159 misc-feature 0160 (2， 6) 0161 m c 或 a， b c 或 t 或 g 0162 7 0163 gmcgcbtgcc tcaacttc 18 说 明 书 CN 101456908 B1/2 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101456908 B2/2 页 13 图 4 图 5 说 明 书 附 图 。