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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410784315.X (22)申请日 2014.12.16 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104498606 A (43)申请公布日 2015.04.08 (73)专利权人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路800号 (72)发明人 陈素矫健姜东杰周振华 肖建如 (74)专利代理机构 上海元一成知识产权代理事 务所(普通合伙) 31268 代理人 赵青 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) 审查员 。
2、蔡放 (54)发明名称 m i c r o R N A s 在 制 备 早 期 筛 查 或 诊 断 Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用 (57)摘要 本发明涉及医学生物检测技术领域， 本发明 应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控 后发生显著上调的若干microRNAs， 并对这一系 列microRNAs进行了Real-TimePCR验证。 本发明 提供了Brachyury阳性肿瘤的分子标记物， 该分 子标记物hsa-miR-4286、 hsa-miR-449c在肺癌患 者中呈现显著高表达， 而在其它肺部实质性病变 患者和正常人群中则未见表达水平异常。 本发明 。
3、还提供了microRNAs在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。 本 发明的microRNAs可以在肿瘤发生的早期进行筛 查或诊断， 对于肿瘤的早期治疗和医疗成本的节 约都具有重要意义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图5页 CN 104498606 B 2017.02.22 CN 104498606 B 1.检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂盒中 的应用， 其特征在于， 所述的microRNAs选自hsa-miR-4286、 hsa-miR-449c中的任一或两者 的组合； 所述的Brachyury。
4、阳性肿瘤为肺癌。 2.根据权利要求1所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述的Brachyury阳性肿瘤是指该肿瘤 中Brachyury呈现出高水平的表达。 3.根据权利要求1或2所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述的检测microRNAs表达量的试剂是 寡聚核苷酸。 4.根据权利要求3所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述的寡聚核苷酸包括。
5、反转录引物、 PCR 上游引物， 或PCR下游引物。 5.根据权利要求3所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述的寡聚核苷酸序列为如下A组、 B组， 或AB两组的组合： A组： 反转录引物如SEQ ID NO:3所示； PCR上游引物如SEQ ID NO:4所示； PCR下游引物 如SEQ ID NO:5所示； B组： 反转录引物如SEQ ID NO:6所示； PCR上游引物如SEQ ID NO:7所示； PCR下游引物 如SEQ ID NO:5所示。 6.根据权利要求4或5所述的检测microRNAs表达量的。
6、试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 所述的试剂盒包括以下组分： A.反转录引物， 1管10uM浓度， 100uL； B.PCR上游引物， 1管10uM浓度， 100uL/管； C.PCR下游引物， 1管10uM浓度， 100uL/管； D.正常标准品， 1管， 10uM浓度， 100uL。 7.根据权利要求6所述的检测microRNAs表达量的试剂在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂盒中的应用， 其特征在于， 利用所述的寡聚核苷酸检测hsa-miR- 4286或hsa-miR-449c表达量的方法包括如下步骤： 取样本中的总RNA。
7、， 加入反转录引物、 5PrimeScript Buffer、 PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase Free dH2O反转录成cDNA， 应用EASY Dilution稀释试剂盒中的正常 标准品， 以所反转录的cDNA为模板向反应体系中加入PCR上游引物、 PCR下游引物， 通过反转 录联合聚合酶链式反应检测hsa-miR-4286或hsa-miR-449c的表达量。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104498606 B 2 microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或 试剂盒中的应用 技术领域 0001 本发明涉及医学生物检测技。
8、术领域， 具体是microRNAs在制备早期筛查或诊断 Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用。 背景技术 0002 随着肿瘤发病率的日益增高， 人类的健康和生命面临巨大挑战， 对肿瘤的防治成 为医学界刻不容缓的责任。 如何早期发现并及时治疗成为降低肿瘤死亡率最有效的途径。 随着在肿瘤分子和细胞层面研究的不断深入和现有治疗方法如放疗化疗严重的副作用， “肿瘤靶标” 这一概念被广泛认可并进行了大量的研究， 这一概念的核心是找到仅在肿瘤中 特异性表达而在正常组织中不表达或局限性表达的分子， 通过 “生物导弹” 直击肿瘤， 并对 正常组织造成最小化的破坏。 这一概念的出现和随之而进行的大量研。
9、究正逐渐使肿瘤独有 的特征具现化， 并有可能最终 “无所遁形” ， 也使得人类在与肿瘤的斗争中掌握了一定的主 动权。 对肿瘤的早期发现和有效治疗都有重大意义。 0003 TATA-box转录因子Brachyury是T-box转录因子家族的成员之一， 其同源体在诸多 多细胞生物体内表达， 如秀丽线虫、 非洲爪蛙、 老鼠、 人类等胚胎中表达( 参见文献 Papaioannou VE,Silver LM,et al.The T-box gene family.Bioessays 1998； 20:9- 19.Kispert A,Herrmann BG,et al.Homologs of the mo。
10、use Brachyury gene are involved in the specification of posterior terminal structures in Drosophila, Tribolium,and Locusta.Genes Dev 1994； 8:2137-50.Herrmann BG,Labeit S,et al.Cloning of the Tgene required in mesoderm formation in the mouse.Nature 1990； 343:617-22)。 T-box蛋白主要在中胚层的形成和分化中具有重要作用， 在胚胎发育。
11、晚 期则在大部分组织中关闭表达仅集中于脊索区表达， 并在脊柱形成后随着脊索的退化消失 而在大多数正常成人组织中不表达， 仅在睾丸中有表达、 脾和小肠中有低水平表达的限制 性表达方式(参见文献Duane H.Hamilton,Ph.D.,Postdoctoral Fellow,et al.Cancer vaccines targeting the epithelial-mesenchymal transition:tissue distribution of Brachyury and other drivers of the mesenchymal-like phenotype of carc。
12、inomas.Semin Oncol.2012Jun； 39(3):358-66.)。 然而， 在已知的人类多种肿瘤组织和 细胞系中， Brachyury却呈现出高水平的表达， 这些肿瘤组织和肿瘤细胞系是： 小肠、 胃、 肾、 膀胱、 子宫、 卵巢、 睾丸、 脑和淋巴组织， 肺组织、 结肠组织和前列腺组织来源的细胞系(参见 文献Palena C,Polev DE,et al.The human T-box mesodermal transcription factor Brachyury is a candidate target for T-cell-mediated cancer immu。
13、notherapy.Clin Cancer Res.2007Apr 15； 13(8):2471-8.Park JC,Chae YK,et al.Epigenetic silencing of human T(brachyury homologue)gene in non-small-cell lung cancer.Biochem Biophys Res Commun.2008Jan 11； 365(2):221-6.)。 以上研究结果都提示了Brachyury可 以应用于多种来源的肿瘤诊断和治疗中。 然而， 如何应用肿瘤组织中高表达的Brachyury对 说明书 1/8 页 3 CN 10。
14、4498606 B 3 人群进行早期的肿瘤筛查诊断却没有具体有效的方法和研究。 作为转录因子， Brachyury具 有强大的启动或抑制下游基因转录的作用， 因此， 通过检测其下游被调控的某些外分泌蛋 白质或miRNA的表达量便可以作为Brachyury表达水平的指标。 0004 microRNA作为仅有20-24bp的非编码短链核苷酸片段， 被证明在外周血中具有稳 定的表达谱， 且无性别差异， 而肿瘤患者的microRNAs表达谱则发生显著变化(参见文献 Chen X,Ba Y,et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel clas。
15、s of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res.2008Oct； 18 (10):997-1006.)由于microRNAs出细胞时被脂质微泡(Micro vesicle)保护， 因此能够保 持稳定， 易于检测， 在冰冻组织、 福尔马林固定组织、 石蜡组织， 体液如外周血、 痰液、 唾液、 胸膜积液中都能够进行检测， 且由于microRNA片段较短， 大大降低了检测成本， 因此， 其作 为无创性肿瘤早期诊断标记物的研究日益增多(参见文献Du M,Liu S et al.Clinical potential 。
16、role of circulating microRNAs in early diagnosis of colorectal cancer patients.Carcinogenesis.2014Sep 19.Jeong HC.Clinical Aspect of MicroRNA in Lung Cancer.Tuberc Respir Dis(Seoul).2014Aug； 77(2):60-4.) 0005 目前的研究尚未见以肿瘤特异性靶标所关联的microRNAs作为肿瘤(包括肺癌等) 早期诊断的标记物， 也尚未有用于检测这一系列microRNAs在血清中含量的试剂盒来针对 部分存在B。
17、rachyury过表达的肿瘤(包括肺癌等)患者进行筛查。 发明内容 0006 本发明的目的在于寻找到与Brachyury高表达相关的肿瘤的分子标记物(肿瘤靶 标、 靶标)， 本发明的另一目的在于提供microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿 瘤试剂或试剂盒中的应用。 0007 本发明的主要技术方案： 为了寻找被Brachyury调控的microRNAs， 本发明人在肺 癌细胞H1299和作为正常人体对照细胞293T中利用慢病毒感染转入外源性Brachyury的cds 序列使之过表达后再应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控后发生显著上调的若 干micro。
18、RNAs。 并对这一系列microRNAs进行了Real-Time PCR验证。 随后在对临床上肺癌患 者、 慢性阻塞性肺炎患者、 肺纤维化病变患者以及正常人群的血浆采集和检测中发现， microRNAs组中hsa-miR-4286、 hsa-miR-449c在肺癌患者中呈现显著高表达， 而在其它肺部 实质性病变患者和正常人群中则未见表达水平异常。 0008 在前期的microRNA芯片实验中同样发生显著上调的has-miR-22被报道在肺癌患 者外周血中发生上调， 可能为肺癌特异性诊断标记物( Franchina T ,Amodeo V , Circulating miR-22,miR-24。
19、and miR-34a as novel predictive biomarkers to pemetrexed-based chemotherapy in advanced non-small cell lung cancer.J Cell Physiol.2014Jan； 229(1):97-9.)。 以上研究结果显示， 被Brachyury所调控的microRNA能 够作为潜在的肺癌诊断标记物， 本发明中的一系列microRNAs经过分子水平的实验与临床 患者标本的验证， 在肺癌的诊断中具有很强的特异性， 并且以反转录联合聚合酶链式反应 (RT-PCR)作为检测基础， 通过对高危人群少量。
20、外周血的检测来早期筛查预测肿瘤的发生， 是完全可行的。 0009 本发明的第一个方面， 是提供了与Brachyury高表达相关的肿瘤的分子标记物， 所 说明书 2/8 页 4 CN 104498606 B 4 述的分子标记物为hsa-miR-4286或hsa-miR-449c。 0010 进一步地， 本发明提供了microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试 剂或试剂盒中的应用， 所述的microRNAs选自hsa-miR-4286、 hsa-miR-449c中的任一或两者 的组合。 0011 本发明所述的microRNAs的具体序列如表1所示： 0012 0013 所述的。
21、 “与Brachyury高表达相关的肿瘤” 即 “Brachyury阳性肿瘤” ， 是指该肿瘤中 Brachyury呈现出高水平的表达， 包括但不限于肺癌、 小肠癌、 胃癌、 肾癌、 膀胱癌、 子宫癌、 卵巢癌、 睾丸癌、 脑癌、 淋巴癌、 结肠癌、 前列腺癌等。 0014 在本发明的一个优选实施例中， 提供了所述的micoRNAs在制备肺癌早期筛查或诊 断试剂盒中的应用。 0015 本发明可用于对肺癌高危人群进行早期筛查和诊断， 本发明通过检测上述 micoRNAs对相应人群外周血中一系列microRNAs含量的检测， 早期筛查或诊断Brachyury阳 性肺癌患者， 以期及早进行干预或治疗。
22、， 预防转移， 最大限度地延长患者生存期降低死亡 率。 0016 本发明通过体外基因表达水平调控技术在肺癌细胞模型中筛选出一系列 microRNAs并进行了临床标本的采集和验证， 并发现microRNA： hsa-miR-4286、 hsa-miR- 449c在肺癌患者外周血中的含量相对其它肺实质病变和正常人群是发生显著升高的， 且具 有明显的统计学意义。 说明这一系列microRNAs在外周血中含量的改变， 可以作为肺癌诊断 的分子标记。 0017 本发明所述的microRNAs可以单一、 或者组合地作为Brachyury阳性肿瘤的分子标 志物。 0018 本发明的第二方面， 本发明提供了m。
23、icroRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳 性肿瘤试剂或试剂盒中的应用， 所述的试剂具体是指检测上述microRNAs表达量的寡聚核 苷酸； 所述的试剂盒具体是指包含检测上述microRNAs表达量的寡聚核苷酸。 0019 本发明提供了用于检测上述microRNAs的寡聚核苷酸， 所述的寡聚核苷酸包括： 反 转录引物、 PCR上游引物、 PCR下游引物。 0020 在本发明的一个优选实施例中， 检测上述microRNAs表达量的寡聚核苷酸的具体 序列如表2所示： 说明书 3/8 页 5 CN 104498606 B 5 0021 0022 本发明反转录引物、 PCR上游引物、 P。
24、CR下游引物是根据已知的microRNAs库 (http:/www.mirbase.org/)检索到的成熟体序列进行引物设计的。 0023 进一步地， 本发明还提供了检测microRNAs表达量的试剂盒， 所述试剂盒包含上述 寡聚核苷酸的一组或多组， 优选地， 包含如下A组、 B组， 或AB两组的组合： 0024 A组： SEQ ID NO:35； 0025 B组： SEQ ID NO:57； 0026 本发明的检测microRNAs表达量的试剂盒， 所述的试剂盒还包含： 0027 正常标准品： 所述的正常标准品由符合平均值含量的microRNAs混合物组成； 0028 在本发明的一个优选实施。
25、例中， 本发明的试剂盒， 包括以下组分： 0029 A.反转录引物， 1管 10uM浓度， 100uL； 0030 B.Real-Time PCR扩增上游引物， 1管10uM浓度， 100uL/管； 0031 C.Real-Time PCR扩增下游引物， 1管10uM浓度， 100uL/管； 0032 D.正常标准品， 1管， 10uM浓度， 100uL。 0033 本发明的第三方面， 提供了利用上述寡聚核苷酸检测所述microRNAs表达量的方 法， 也即microRNAs在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用的具 体检测方法， 包括如下步骤： 0034 取样本中。
26、的总RNA， 加入特异性反转录引物、 5PrimeScript Buffer(for Real Time)、 PrimeScript RT Enzyme Mix I、 RNase Free dH2O(TAKARA公司)反转录成cDNA， 应 用EASY Dilution稀释试剂盒中的正常标准品， 以所反转录的cDNA为模板向反应体系中加 入PCR上游引物、 PCR下游引物， 通过反转录联合聚合酶链式反应(RT-PCR)检测上述的 microRNAs的表达量。 0035 所述样本， 优选人的血液样本(不排除体液样本)， 即血清样本或血浆样本。 0036 使用本发明的试剂或试剂盒可以监测或于尚未发。
27、生明显影像学改变的早期高危 人群中的Brachyury阳性肿瘤(肺癌)。 0037 利用试剂盒中的标准品作为正常对照， 取任意受试人群的外周血进行总 microRNAs抽提、 反转录和PCR扩增， 与标准品结果进行比对， 确认受试者外周血的该组 microRNAs是否发生上调， 若发生上调， 即可初步确定该受试者为Brachyury阳性肿瘤(肺 癌)患者， 进一步可通过影像学进行监测， 便于对受试者进行早期治疗。 0038 本发明的试剂盒进行早期Brachyury阳性肿瘤(肺癌)检测方法， 具体步骤为： 0039 取受试者外周抗凝血4-5ml， 离心两次收集血浆， 取200ul血浆以Blood。
28、 miRNA kit 抽提总microRNAs， 利用试剂盒中的反转录引物反转录后， 与试剂盒中的标准品共同进行 说明书 4/8 页 6 CN 104498606 B 6 Real-Time PCR扩增， 测定受试者外周血中该组microRNAs的含量， 并与标准品的检测数据 进行比对， 鉴定是否发生上调。 0040 本发明中的miRNAs组合针对正常成人体内限制表达的特异性肿瘤靶点Brachyury 阳性的肿瘤患者进行肿瘤的早期筛查和诊断， 其特异性和灵敏度显著高于目前临床上使用 的各相关肿瘤诊断标记物， 可以在肿瘤发生的早期进行诊断， 不仅提高了诊断的准确性， 而 且为肿瘤的临床前发现提供。
29、了依据， 对于肿瘤的早期治疗和医疗成本的节约都具有重要意 义。 该miRNA组合物可在制备检测Brachyury阳性肿瘤的试剂或工具中应用。 可对于正常人 群进行肿瘤早期筛查和诊断。 附图说明 0041 图1： 在肺癌细胞系H1299中利用慢病毒转入外源性转录因子Brachyury后， 对对照 组细胞与过表达Brachyury组细胞进行microRNAs芯片分析(三次生物学重复)， 热图红色部 分提示即为过表达Brachyury后发生上调的microRNAs； 0042 图2： 在作为正常体细胞对照的293T细胞中利用慢病毒转入外源性转录因子 Brachyury后， 对对照组细胞与过表达Bra。
30、chyury组细胞进行microRNAs芯片分析(三次生物 学重复)， 热图红色部分提示即为过表达Brachyury后发生上调的microRNAs； 0043 图3： 试剂盒扩增引物检测Brachyury阳性的肺癌患者、 健康志愿者与慢性阻塞性 肺炎(COPD)患者外周血中已知一组microRNAs的含量检测CT值趋势； 0044 图4： 试剂盒扩增引物检测3个Brachyury阳性的肺癌患者、 3个健康志愿者与3个 COPD患者外周血的表达水平数值； 0045 图5： 试剂盒扩增检测hsa-miR-4286在Brachyury阳性的肺癌患者、 Brachyury阴性 肺癌患者， 并以试剂盒中。
31、标准品做为正常对照测定外周血的表达水平， 通过外参基因进行 校正， ； 0046 图6： 使用该试剂盒检测hsa-miR-4286在6个随机慢阻肺患者外周血的表达水平， 并以试剂盒中标准品做为正常对照， 以外参基因做校正。 0047 图7： 试剂盒扩增外周血总microRNAs中hsa-miR-449c在Brachyury阳性的肺癌患 者、 Brachyury阴性肺癌患者中的表达水平， 以试剂盒中标准品做为正常对照， 通过外参基 因进行校正； 0048 图8： 使用该试剂盒检测hsa-miR-449c在6个随机慢阻肺患者外周血的表达水平， 并以试剂盒中标准品做为正常对照， 以外参基因做校正。 。
32、具体实施方式 0049 现结合实施例和附图， 对本发明作进一步描述， 但本发明的实施并不仅限于此。 0050 实施例1： 被肿瘤特异性转录因子Brachyury调控的microRNAs 0051 为寻找被肿瘤特异性转录因子Brachyury调控的microRNAs， 本发明人在一株肺癌 细胞系H1299和作为正常人体对照细胞的293T中利用慢病毒感染转入外源性Brachyury的 cds序列使之过表达后再应用microRNA芯片技术筛选出被Brachyury调控后发生显著上调 的若干microRNAs(见图1、 图2)。 0052 经过Real-Time PCR验证这些microRNAs的表达。
33、改变与芯片结果一致。 随后在对临 说明书 5/8 页 7 CN 104498606 B 7 床上肺癌患者、 慢性阻塞性肺炎患者以及正常人群的血浆采集和检测中发现， microRNAs组 中hsa-miR-4286、 hsa-miR-449c、 在肺癌患者中呈现显著高表达， 而在其它肺部实质性病变 患者和正常人群中则未见表达水平的显著异常(见图3， 图4)。 0053 实施例2： 本发明试剂盒的制备 0054 本发明试剂盒组成成分为： 0055 A.特异性反转录引物2管10uM浓度， 200uL； 0056 B.Real-Time PCR扩增上游引物(见表格2)2管(A1、 A2)10uM浓度，。
34、 200uL/管； Real- Time PCR扩增下游引物(见表格2)1管10uM浓度2mL/管； 0057 C.含定量microRNAs的标准品1管； 0058 该组microRNAs特异性反转录引物为根据成熟microRNAs序列添加固定Loop(环结 构)片段， 再由美国invitrogen公司进行合成， 纯度为PAGE级， 合成后的引物用DEPC H2O溶 解， 终浓度为10 M。 0059 特异性的microRNAs上下游引物： 根据成熟microRNAs特异性序列添加经验序列并 通过软件调节GC含量使Tm值与下游引物一致。 下游引物为反转录引物上的固定序列， 引物 全部由美国in。
35、vitrogen公司合成， 纯度为PAGE级， 合成后的引物用DEPC H2O溶解， 终浓度为 10 M。 0060 标准品为经检测验证过的符合健康正常人外周血该组microRNAs表达水平的反转 录样品混合而成， 其中10个microRNAs的含量固定在健康人群平均水平。 进行每一批次的受 试人群检测时， 均需同时PCR扩增该标准品以进行结果比对。 0061 实施例3： 本试剂盒的检测方法 0062 (一)、 采集血浆样本、 抽提microRNAs与反转录： 0063 采集外周血进行检测具有无创伤、 采集方便等优点， 因此， 通过采集和检测外周血 中的一系列microRNAs分子标记物来进行。
36、肺癌早期的筛查不但容易普及， 而且具有准确性 高的优点， 能够及时发现早期的Brachyury阳性肺癌， 从而达到早发现早治疗、 提高患者生 存率的目的。 0064 验证用血浆样品从上海长征医院住院部与门诊采集， 30例原发性肺癌或肺癌骨转 移标本(选取其中经免疫组化验证为Brachyury阳性的患者3例)， 30例健康志愿者标本(随 机选取其中3例)以及30例慢性肺实质性炎症(COPD)患者标本(随机选取其中3例)作对照。 提取患者外周血总microRNAs后检测一系列芯片结果中提示上调的microRNAs， 其中， hsa- miR-4286与hsa-miR-449c显示出明显肺癌特异性趋。
37、势， 即在肺癌中的表达水平较正常人群 明显增高， 表现为肺癌患者中的CT值低于正常对照人群， 且在慢性阻塞性肺炎患者中较正 常人群却未见显著表达水平变化(图3)。 分别将每组三个患者的CT值分别呈现时， 可以看出 三组人群的表达分布一致性非常高， 均表现为正常人的CT值最高、 肺癌患者的CT值最低、 慢 阻肺患者表达水平介于两者之间并更接近正常人群。 没有出现假阳性或者假阴性的表达情 况(图4)。 提示这两个microRNAs作为肺癌特异性标记物具有进一步验证的价值。 0065 纳入标准： 0066 1、 2012年5月到2014年10月在上海长征医院诊断为原发性肺癌以及肺癌骨转移的 患者， 。
38、前提是从医疗记录中， 可获得所有与肿瘤相关的历史数据以及肿瘤组织免疫组化检 测为Brachyury阳性表达； 说明书 6/8 页 8 CN 104498606 B 8 0067 2、 在上海长征医院新诊断为原发性肺癌或肺癌骨转移的患者以及肿瘤组织免疫 组化检测为Brachyury阳性表达； 0068 3、 在上海长征医院或其它医疗机构诊断为原发性或转移性肺癌以及免疫组化检 测为Brachyury阴性表达作为对照组； 0069 4、 在上海长征医院或其它医疗机构新诊断的慢性阻塞性肺炎、 肺纤维化的肺实质 性病变的患者作为对照组； 0070 5、 正常人群作为对照组； 0071 排除标准： 007。
39、2 1、 排除其它组织系统肿瘤患者； 0073 2、 排除睾丸与结肠部位肿瘤或慢性疾病患者； 0074 3、 排除其它非肺实质性病变的肺部疾病患者。 0075 对符合上述标准的患者进行血样采集， 抽取外周血4-5mL， 置于EDTA抗凝管中， 两 次离心后取上清， 取400uL进行总microRNAs抽提。 0076 应用QIAGEN的Blood microRNA kit提供的标准实验步骤提取血浆中的总小片段 RNA。 0077 将抽提出的小片段RNA反转成cDNA： 10PrimeScriptTM Buffer(for Real Time) 1.5 L、 PrimeScriptTM RT E。
40、nzyme Mix 0.5 L(TaKaRa)、 反转录引物A/B2 L、 前述步骤中富 集的总小片段RNA 10uL、 DEPC H2O 1 L补足总体积达到15 L。 反转录步骤： 37 20min， 85 5min。 0078 (二)、 目的基因的Real-Time PCR扩增： 0079 采用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和Applied Biosystems的： 实时定量PCR 仪， 进行PCR反应： 0080 0081 0082 主要实验条件为： 退火温度56， 40个cycles(循环) 0083 本试剂盒采用正常人群中此两个microRNAs表达水平。
41、位于中位值的人群的总 microRNAs以hsa-miR-4286与hsa-miR-449c的特异性反转录引物扩增反转成的cDNA作为标 准品， 每一个反应进行时均同时对标准品进行PCR扩增， 并根据标准品的扩增CT值对检测样 品进行比较， 每一个样品均进行3复孔重复， 以内参5S或外参ce-miR-39进行校对， 通过2 - Ct法计算出检测样品中已知一组microRNAs表达水平的相对定量值。 并通过T检验的方法 计算该检测样品中的一组microRNAs是否存在异常表达。 0084 实施例4： 原发性肺癌或转移性肺癌患者外周血该组microRNAs表达水平检测 0085 根据前述实验方法，。
42、 选取6例原发性/转移性肺癌患者(经免疫组化检测明确出3个 说明书 7/8 页 9 CN 104498606 B 9 Brachyury阳性患者和3个Brachyury阴性患者)外周血血浆标本进行qPCR扩增， 与标准品 (设为1)进行比较后发现在Brachyury阳性的肺癌患者外周血中hsa-miR-4286与hsa-miR- 449c的表达水平发生了有统计学意义的上调， P0.05。 0086 Brachyury阳性患者hsa-miR-4286分别平均上调了64倍、 48.93倍、 81.7倍。 0087 而Brachyury阴性肺癌患者的hsa-miR-4286则分别平均上调了5.6倍、。
43、 7.06倍、 4.3 倍(图5)。 0088 同样， hsa-miR-449c也呈现出相同的表达趋势， 即在Brachyury阳性肺癌患者外周 血中hsa-miR-449c分别平均上调了24.1倍、 6.86倍、 31倍， 而Brachyury阴性肺癌患者与正 常对照组比则并没有出现明显差异， 反而发生了一定程度的下调(图6)。 0089 实施例5： 其它肺部慢性炎症患者外周血该组microRNAs表达水平检测 0090 同样根据前述实验方法， 选取6例慢性阻塞性肺炎(COPD)患者外周血血浆标本进 行qPCR扩增， 与标准品(设为1)进行比较后发现hsa-miR-4286与hsa-miR-。
44、449c在COPD患者 外周血中的表达水平并未发生有统计学意义的上调。 0091 在这些随机选取慢阻肺患者的外周血中hsa-miR-4286的上调倍数最多的一例6.8 倍的上调(图7)。 0092 在随机抽取的这6例慢阻肺患者的血浆中hsa-miR-449c的表达较正常对照也未见 显著差异， 最大的上调倍数为2.37倍， 较Brachyury阳性肺癌患者中上调倍数最低值降低近 3倍(图8)。 0093 据此推断， hsa-miR-4286与hsa-miR-449c作为肺癌特异性诊断标记以本试剂盒检 测， 通过以试剂盒中的正常对照样品， 即标准品最比较， 可以明确区分出Brachyury阳性的 。
45、肺癌患者， 并以此为临床提供诊断线索。 0094 以上显示和描述了本发明的基本原理、 主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。 说明书 8/8 页 10 CN 104498606 B 10 0001 序列表 1/3 页 11 CN 104498606 B 11 0002 序列表 2/3 页 12 CN 104498606 B 12 0003 序列表 3/3 页 13 CN 104498606 B 13 图1 说明书附图 1/5 页 14 CN 104498606 B 14 图2 说明书附图 2/5 页 15 CN 104498606 B 15 图3 图4 说明书附图 3/5 页 16 CN 104498606 B 16 图5 图6 说明书附图 4/5 页 17 CN 104498606 B 17 图7 图8 说明书附图 5/5 页 18 CN 104498606 B 18 。