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一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用.pdf

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文档编号：8818931

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1、(10)申请公布号 CN 102101878 A (43)申请公布日 2011.06.22 CN 102101878 A *CN102101878A* (21)申请号 200910248445.0 (22)申请日 2009.12.16 C07J 19/00(2006.01) A61K 31/585(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人中国科学院大连化学物理研究所地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人梁鑫淼刘艳芳张秀莉丰加涛肖远胜薛兴亚 (74)专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 代理人马驰。

2、周秀梅 (54) 发明名称一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用 (57) 摘要本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用，通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体化合物，其主要制备步骤为将蟾皮剪碎，乙醇提取，总提物经大孔树脂分离得蟾蜍二烯内酯提取物，再经过二维制备色谱分离纯化得到该化合物。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 4 页 CN 102101881 A1/2 页 2 1. 一种沙。

3、蟾毒精空间异构体化合物，其特征在于：所述化合物具有如下所示三种结构式之一， 2. 一种权利要求 1 所述化合物的制备方法，其特征在于： 1)取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱， A ： 0.1 (v/v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度洗脱： 5 B 95 B， 60min。分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长 300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集 20 个馏分； 2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，。

4、A ：正己烷； B ：异丙醇，梯度洗脱： 5 B 30 B， 55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 I 的馏分；取 Fraction 6 回收溶剂，经 HPLC 分离，色谱条件为：环糊精色谱柱， A ： 0.1 (v/v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度条件： 95 B 60 B， 40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 II 的馏分；取Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱， A ：水； B ：甲醇，梯。

5、度洗脱： 5B50B， 35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 III 的馏分。 3. 根据权利要求 2 的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物的制备过程为：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔权利要求书 CN 102101878 A CN 102101881 A2/2 页 3 树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物。 4. 根据权利要求 3 的制备方法，其特征在于：低浓度乙醇是指 10 50的乙醇，高浓度乙醇是指 70 100的乙醇。。

6、5. 根据权利要求 3 的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为 60 90。 6. 一种权利要求 1 所述的化合物在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用。 7. 按照权利要求 6 所述的化合物在制备中的应用，其特征在于：所述治疗和预防实体瘤的药物为治疗和预防宫颈癌及乳腺癌的药物。权利要求书 CN 102101878 A CN 102101881 A1/4 页 4 一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用技术领域 0001 本发明涉及二烯内酯类化合物，具体地说是一种嚏根草配基空间异构体新化合物及其制备方法，其是一种通过大孔。

7、树脂处理和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备分离出来的新化合物。背景技术 0002 蟾蜍是中医临床应用较早的药物，在我国己有上千年的临床应用历史。其药用部位为：皮、蟾酥、干燥全体。蟾皮有清热解毒、利水消胀之功效，辛、凉、微毒，主治痈疽、肿毒，我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等，具有较好的临床效果(代丽萍等.药学学报， 2007， 42(8) ： 858-861)。 0003 二烯内酯类化合物是蟾皮中的主要的活性成分，现代药理学研究表明其具有强心、抗菌、抗肿瘤等作用 ( 贾彩云等 . 中草药， 2005， 36(2) ： 244 ； Enomo。

8、to A， et al.J Nat Prod， 2004， 67(12) ： 2070 ； Cunha Filho GA， et al.Toxicon， 2005， 45(6) ： 777 ； Usanova IV， et al.Eksp Klin Farmakol， 2002， 65(4) ： 23)。 0004 目前报道的该类化合物有 250 多种，但空间异构体的报道极少。然而空间异构体，尤其是手性异构体在生物活性上可能有较大差异，是制药领域的研究热点之一。发明内容 0005 鉴于此，本发明人经过深入研究，从中华大蟾蜍干燥皮中提取分离得到一种新的蟾蜍二烯内酯类化合物，经体外。

9、实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。 0006 本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体新化合物，所述化合物具有如下所示三种结构式之一， 0007 化合物 I 0008 化合物 II 说明书 CN 102101878 A CN 102101881 A2/4 页 5 0009 化合物 III 0010 本发明提供了蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物，蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为 60 90。 0011 其中所说的低浓度。

10、乙醇是指 5 50的乙醇，高浓度乙醇是指 70 100的乙醇。 0012 其中所说的大孔树脂可以选择非极性或极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选择 AB-8， D-101， XAD-4， X-5， HPD-100 ；所说的极性大孔树脂可以选择 HPD-400， S-8， NAK-9。 0013 本发明还提供了蟾蜍二烯内酯类化合物的制备方法：取蟾蜍二烯内酯提取物，采用二维 HPLC 制备色谱纯化后可获得高纯度单体，第一维采用反相色谱柱，第二维采用环糊精色谱柱。 0014 所述化合物具体制备方法为： 0015 1) 取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型 HPLC 分离，。

11、色谱条件为：反相 Xterra C18 色谱柱， A ： 0.1 (v/v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度洗脱： 5 B 95 B， 60min。分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长 300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集 20 个馏分； 0016 2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱， A ：正己烷； B ：异丙醇，梯度洗脱： 5 B 30 B， 55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 I 的馏分； 0017 取。

12、Fraction 6 回收溶剂，经 HPLC 分离，色谱条件为：环糊精色谱柱， A ： 0.1 (v/ v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度条件： 95 B 60 B， 40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 II 的馏分； 0018 取 Fraction 10 回收溶剂，经 HPLC 分离，色谱条件为：环糊精色谱柱， A ：水； B ：甲醇，梯度洗脱： 5 B 50 B， 35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 III 的馏分。 0019 所述的化合物可。

13、在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用，如：宫颈癌、乳腺癌等。 0020 本发明提供了一种通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体新化合物的方法。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。说明书 CN 102101878 A CN 102101881 A3/4 页 6 具体实施方案 0021 现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。 0022 实施例 1 ：蟾蜍二烯内酯提取物的制备 0023 取蟾皮5Kg用95乙醇提取3次，用醇量为10倍，每次提取时间为120分钟，合并滤液，滤液减。

14、压浓缩至5L，上大孔树脂，先用水洗脱，再用550乙醇洗脱，再用70 100的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物 62g。 0024 实施例 2 ：蟾蜍二烯内酯馏分制备 0025 取实施例 1 所得到的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型 HPLC 分离 (XterraC18， A ： 0.1 (v/v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度条件： 5 B 95 B， 60min ； )，分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm。按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集 20 个馏分 (Fraction。

15、1 20)。 0026 实施例 3 ：化合物 I 的制备 0027 Fraction 5 回收溶剂，经 HPLC 分离 ( 环糊精色谱柱， A ：正己烷； B ：异丙醇，梯度条件： 5 B 30 B， 55min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 I( 峰 3) 的馏分 3mg， HPLC 检测含量为 99，经理化测定，数据如下：白色粉末， HR-MS， M+H+(m/z) ： 417.2275， UV ： 298nm， 1HNMR(CD 3OD， 400MHz) ： 10.12(1H， s)， 8.01(1H， dd， J。

16、 9.6， 1.6)， 7.56(1H， s)， 6.43(1H， d， J 9.6)， 3.55(1H， m)， 2.17(1H， d， J 5.6)， 0.78(1H， s) 等； 13CNMR(CD 3OD， 100MHz) ： 210.2， 167.9， 155.4， 145.1， 133.2， 117.5， 86.2， 70.8， 69.3， 55.7， 51.2， 47.3， 43.2， 42.5， 35.7， 36.8， 31.2， 31.6， 26.3， 25.2， 23.9， 22.4， 19.7。 0028 实施例 4 ：化合物 II 的制备 0029 Fraction。

17、 6 回收溶剂，经 HPLC 分离 ( 环糊精色谱柱， A ： 0.1 (v/v) 甲酸水； B ： 0.1 (v/v) 甲酸乙腈，梯度条件： 95 B 60 B， 40min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 I( 峰 4) 的馏分 2mg， HPLC 检测含量为 98，经理化测定，数据如下：白色粉末， HR-MS， M+H+(m/z) ： 417.2281， UV ： 300nm， 1HNMR(CD 3OD， 400MHz) ： 9.92(1H， s)， 7.89(1H， dd， J 10， 2.4)， 7.34(1H， s)，。

18、 6.18(1H， d， J 10)， 3.83(1H， m)， 2.46(1H， dd， J 8.8， 6.4)， 0.58(1H， s) 等； 13CNMR(CD 3OD， 100MHz) ： 208.5， 163.4， 149.2， 147.9， 123.5， 114.1， 84.2， 74.4， 66.4， 53.8， 50.5， 42.2， 41.8， 40.1， 38.9， 37.0， 30.9， 30.5， 28.6， 28.2， 24.0， 21.0， 21.8。 0030 实施例 5 ：化合物 III 的制备 0031 Fraction 10 回收溶剂，经 HPLC 分。

19、离 ( 环糊精色谱柱， A ：水； B ：甲醇，梯度条件： 5B50B， 35min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物 I( 峰 1) 的馏分 5mg， HPLC 检测含量为 99，经理化测定，数据如下：白色粉末， HR-MS， M+H+(m/z) ： 417.2264， UV ： 299nm， 1HNMR(CD 3OD， 400MHz) ： 9.14(1H， s)， 8.67(1H， dd， J 9.7， 2.2)， 8.34(1H， s)， 7.18(1H， d， J 9.5)， 4.43(1H， d 4.2)， 3.78(1H。

20、， dd， J 7.3， 5.5)， 1.01(1H， s) 等； 13CNMR(CD 3OD， 100MHz) ： 211.4， 175.3， 151.2， 149.5， 128.3， 119.0， 90.8， 85.6， 68.3， 57.4， 56.2， 46.4， 45.2， 43.9， 39.2， 38.3， 34.2， 35.6， 27.3， 29.2， 25.9， 20.7， 20.3。说明书 CN 102101878 A CN 102101881 A4/4 页 7 0032 实施例 6 ：嚏根草配基空间异构体新化合物 I III 对 HeLa 细胞和 MCF 细胞毒活。

21、性 0033 材料：宫颈癌 HeLa 细胞和人乳腺癌 MCF 购自中国第二军医大学 0034 实施例 3 5 得到的化合物 I III 0035 华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司 0036 分别以宫颈癌 HeLa 细胞和人乳腺癌 MCF 为细胞模型，初筛了化合物 I V。实验设计如下： 0037 分别将对数生长期 HeLa 和 MCF 细胞以 10小牛血清 RPMI1640 培养基调整至 5104个 /ml，分设对照组、华蟾素注射液组和实验组，每组 3 个复孔，每孔 104个，接于 96 孔板中，置于 37、含 5 CO2 的培养箱中，待 24h 贴壁后，。

22、换 10小牛血清 RPMI-1640 培养基；实验组分别加入含 410-4mg/ml 各化合物 ( 化合物 I III) 的甲醇溶液 ( 折合干蟾皮浓度为610-3g/ml)，华蟾素注射液组加入相同折合浓度的华蟾素注射液，对照组加入相同量的甲醇溶液。48h 后取出，生理盐水洗一次细胞后，结晶紫染色半小时，洗去结晶紫，并用 100l 的甲醇溶解，用酶标仪测定 490nm 的吸收值。细胞死亡率 (A490对照 -A490样品 )/A490对照 100，结果见表 1。 0038 表 1 化合物 I III 对 HeLa 和 MCF 细胞的死亡率 ( ) 0039 0040 由表中数据可知，化合物 I III 对 HeLa 和 MCF 细胞死亡率明显高于相同干蟾皮浓度下的华蟾素注射液。说明书 CN 102101878 A 。

摘要
申请专利号：	CN200910248445.0	申请日：	20091216
公开号：	CN102101878A	公开日：	20110622
当前法律状态：		有效性：	失效
法律详情：
IPC分类号：	C07J19/00,A61K31/585,A61P35/00	主分类号：	C07J19/00,A61K31/585,A61P35/00
申请人：	中国科学院大连化学物理研究所
发明人：	梁鑫淼,刘艳芳,张秀莉,丰加涛,肖远胜,薛兴亚
地址：	116023 辽宁省大连市中山路457号
优先权：	CN200910248445A
专利代理机构：	沈阳科苑专利商标代理有限公司	代理人：	马驰;周秀梅
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内容摘要

本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体化合物及其制备和应用，通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体化合物，其主要制备步骤为将蟾皮剪碎，乙醇提取，总提物经大孔树脂分离得蟾蜍二烯内酯提取物，再经过二维制备色谱分离纯化得到该化合物。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。

权利要求书

1.一种沙蟾毒精空间异构体化合物，其特征在于：所述化合物具有如下所示三种结构式之一， 2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：1)取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min。分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集20个馏分；2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；取Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；取Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分。 3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物的制备过程为：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物。 4.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：低浓度乙醇是指10％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。 5.根据权利要求3的制备方法，其特征在于：所述蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。 6.一种权利要求1所述的化合物在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用。 7.按照权利要求6所述的化合物在制备中的应用，其特征在于：所述治疗和预防实体瘤的药物为治疗和预防宫颈癌及乳腺癌的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及二烯内酯类化合物，具体地说是一种嚏根草配基空间异构体新化合物及其制备方法，其是一种通过大孔树脂处理和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备分离出来的新化合物。

背景技术

蟾蜍是中医临床应用较早的药物，在我国己有上千年的临床应用历史。其药用部位为：皮、蟾酥、干燥全体。蟾皮有清热解毒、利水消胀之功效，辛、凉、微毒，主治痈疽、肿毒，我国民间多用来治疗原发性肝癌、肺癌等，具有较好的临床效果(代丽萍等.药学学报，2007，42(8)：858-861)。

二烯内酯类化合物是蟾皮中的主要的活性成分，现代药理学研究表明其具有强心、抗菌、抗肿瘤等作用(贾彩云等.中草药，2005，36(2)：244；Enomoto A，et al.J Nat Prod，2004，67(12)：2070；Cunha Filho GA，et al.Toxicon，2005，45(6)：777；Usanova IV，et al.Eksp Klin Farmakol，2002，65(4)：23)。

目前报道的该类化合物有250多种，但空间异构体的报道极少。然而空间异构体，尤其是手性异构体在生物活性上可能有较大差异，是制药领域的研究热点之一。

发明内容

鉴于此，本发明人经过深入研究，从中华大蟾蜍干燥皮中提取分离得到一种新的蟾蜍二烯内酯类化合物，经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。

本发明提供了一种嚏根草配基空间异构体新化合物，所述化合物具有如下所示三种结构式之一，

化合物I

化合物II

化合物III

本发明提供了蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法：蟾皮用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂，先用水及低浓度乙醇洗脱，再用高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂即得蟾蜍二烯内酯类提取物，蟾蜍二烯内酯提取物中蟾蜍二烯内酯的重量百分含量为60％～90％。

其中所说的低浓度乙醇是指5％～50％的乙醇，高浓度乙醇是指70％～100％的乙醇。

其中所说的大孔树脂可以选择非极性或极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选择AB-8，D-101，XAD-4，X-5，HPD-100；所说的极性大孔树脂可以选择HPD-400，S-8，NAK-9。

本发明还提供了蟾蜍二烯内酯类化合物的制备方法：取蟾蜍二烯内酯提取物，采用二维HPLC制备色谱纯化后可获得高纯度单体，第一维采用反相色谱柱，第二维采用环糊精色谱柱。

所述化合物具体制备方法为：

1)取蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离，色谱条件为：反相Xterra C18色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度洗脱：5％B～95％B，60min。分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm，按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分，共收集20个馏分；

2)取Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度洗脱：5％B～30％B，55min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I的馏分；

取Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物II的馏分；

取Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离，色谱条件为：环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度洗脱：5％B～50％B，35min，收集各个色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物III的馏分。

所述的化合物可在制备治疗和预防实体瘤的药物中的应用，如：宫颈癌、乳腺癌等。

本发明提供了一种通过大孔树脂和二维制备色谱分离技术从传统中药蟾皮中制备嚏根草配基空间异构体新化合物的方法。经体外实验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。

具体实施方案

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：蟾蜍二烯内酯提取物的制备

取蟾皮5Kg用95％乙醇提取3次，用醇量为10倍，每次提取时间为120分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至5L，上大孔树脂，先用水洗脱，再用5％～50％乙醇洗脱，再用70％～100％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物62g。

实施例2：蟾蜍二烯内酯馏分制备

取实施例1所得到的蟾蜍二烯内酯提取物，经制备型HPLC分离(XterraC18，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：5％B～95％B，60min；)，分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长300nm。按检测过程中不同样品峰的保留时间分别收集各馏分；共收集20个馏分(Fraction1～20)。

实施例3：化合物I的制备

Fraction 5回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：正己烷；B：异丙醇，梯度条件：5％B～30％B，55min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰3)的馏分3mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2275，UV：298nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：10.12(1H，s)，8.01(1H，dd，J＝9.6，1.6)，7.56(1H，s)，6.43(1H，d，J＝9.6)，3.55(1H，m)，2.17(1H，d，J＝5.6)，0.78(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：210.2，167.9，155.4，145.1，133.2，117.5，86.2，70.8，69.3，55.7，51.2，47.3，43.2，42.5，35.7，36.8，31.2，31.6，26.3，25.2，23.9，22.4，19.7。

实施例4：化合物II的制备

Fraction 6回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：0.1％(v/v)甲酸水；B：0.1％(v/v)甲酸乙腈，梯度条件：95％B～60％B，40min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰4)的馏分2mg，HPLC检测含量为98％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2281，UV：300nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：9.92(1H，s)，7.89(1H，dd，J＝10，2.4)，7.34(1H，s)，6.18(1H，d，J＝10)，3.83(1H，m)，2.46(1H，dd，J＝8.8，6.4)，0.58(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：208.5，163.4，149.2，147.9，123.5，114.1，84.2，74.4，66.4，53.8，50.5，42.2，41.8，40.1，38.9，37.0，30.9，30.5，28.6，28.2，24.0，21.0，21.8。

实施例5：化合物III的制备

Fraction 10回收溶剂，经HPLC分离(环糊精色谱柱，A：水；B：甲醇，梯度条件：5％B～50％B，35min)，收集其中主要的色谱峰，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得含化合物I(峰1)的馏分5mg，HPLC检测含量为99％，经理化测定，数据如下：白色粉末，HR-MS，[M+H]+(m/z)：417.2264，UV：299nm，1HNMR(CD3OD，400MHz)δ：9.14(1H，s)，8.67(1H，dd，J＝9.7，2.2)，8.34(1H，s)，7.18(1H，d，J＝9.5)，4.43(1H，d＝4.2)，3.78(1H，dd，J＝7.3，5.5)，1.01(1H，s)等；13CNMR(CD3OD，100MHz)δ：211.4，175.3，151.2，149.5，128.3，119.0，90.8，85.6，68.3，57.4，56.2，46.4，45.2，43.9，39.2，38.3，34.2，35.6，27.3，29.2，25.9，20.7，20.3。

实施例6：嚏根草配基空间异构体新化合物I～III对HeLa细胞和MCF细胞毒活性

材料：宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF购自中国第二军医大学

实施例3～5得到的化合物I～III

华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司

分别以宫颈癌HeLa细胞和人乳腺癌MCF为细胞模型，初筛了化合物I～V。实验设计如下：

分别将对数生长期HeLa和MCF细胞以10％小牛血清RPMI1640培养基调整至5×104个/ml，分设对照组、华蟾素注射液组和实验组，每组3个复孔，每孔104个，接于96孔板中，置于37℃、含5％CO2的培养箱中，待24h贴壁后，换10％小牛血清RPMI-1640培养基；实验组分别加入含4×10-4mg/ml各化合物(化合物I～III)的甲醇溶液(折合干蟾皮浓度为6×10-3g/ml)，华蟾素注射液组加入相同折合浓度的华蟾素注射液，对照组加入相同量的甲醇溶液。48h后取出，生理盐水洗一次细胞后，结晶紫染色半小时，洗去结晶紫，并用100μl的甲醇溶解，用酶标仪测定490nm的吸收值。细胞死亡率％＝(A490对照-A490样品)/A490对照×100％，结果见表1。

表1化合物I～III对HeLa和MCF细胞的死亡率(％)

由表中数据可知，化合物I～III对HeLa和MCF细胞死亡率明显高于相同干蟾皮浓度下的华蟾素注射液。