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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710051773.6 (22)申请日 2017.01.19 (71)申请人 广东省农业科学院动物卫生研究所 地址 510000 广东省广州市天河区五山路 白石岗 (72)发明人 戚南山林栩慧孙铭飞廖申权 吕敏娜吴彩艳李娟张健騑 谢明权 (74)专利代理机构 无锡市汇诚永信专利代理事 务所(普通合伙) 32260 代理人 张欢勇 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (5。
2、4)发明名称 一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方 法 (57)摘要 本发明涉及生物基因工程技术领域， 根据 Genbank上Is18SrRNA基因全序列(U97523.1) 及IsITS1基因序列(LC085519.1)设计引物， 以 Is基因组DNA(gDNA)为模板， PCR方法扩增获得 Is-18SrRNA基因序列； 根据所获得Is-18SrRNA 及Is-ITS1基因序列， 分别设计三条同向且退火 温度较高的特异性引物， 利用Genomewalking技 术克隆获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28SrRNA 基因全长序列， 从而为猪等孢球虫新一代检测方 法的建立打。
3、下基础。 权利要求书3页 说明书9页 附图2页 CN 106801052 A 2017.06.06 CN 106801052 A 1.一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 它包括Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S- ITS2-28S基因序列， 所述的基因序列为： GATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTTAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTTTTATACGGCG AAACTGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTTATTTGATGGTCTTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTAT GGCT。
4、AATACATGCGCACGTGCCTCTTCCTCAGGAAGGGCAGTGTTTATTAGATACAGAACCAACCCACCTTCTGGTG GTCCTCAGGTGATTCATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACC TATCAGCTTTCGACGGTACTGTATTGGACTACCGTGGCAGTGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGA GGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATTCAG。
5、GGAGGTA GTGACAAGAAATAACAACACTGGAAATTTCATTTCTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTTCAGAGTAA CAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTA AAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGCTGGAAGCAGCCAGTCCGCCCTTAGGGGTGTGTACGTGGTGAAATTCCGGCATC CTCCTGGTGGCGCTTCGCACTTAACTGGGTGGAGTGCTTTTCCAGGACTTTTACTTTG。
6、AGAAAATTAGAGTGTTTCA AGCAGGCTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCATGGAATAATAAGATAGGATTTCGGCCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGA CTGAAGTAATGATTAATAGGGACGGTTGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAA GACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAAGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGACCA GATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGG。
7、AAAACGTCATACTTGACTTCTCCTGCACCTT ATGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCA CCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGAAAGGATTGA CAGATTGATAGCCCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTT AATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAA。
8、ATAGGATCAGGAACCTCGTGTTCTTGTATCACTTCTTAGAGGG ACTTTGCGTGTCTAACGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCG CGCTACACTGATGCATCCAACGAGTTTATAACCTTGGCCGATAGGTCTAGGTAATCTTGTGAGTATGCATCGTGATG GGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCAGCAGCTTGCGCCGATTACG TCCCTGCCCTTTGTACACACCG。
9、CCCGTCGCTCCTACCGATTGAGTGTTCCGGTGAATTATTCGGACCGTTCTGTGGC GCGTTCGTGCCCGAGATGGAAAGTTTTGTGAACCTTAACACTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG GTGAACCTGCGGAAGGATCATTCACACGTGGCCCTTGAAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTG ATGGTCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCG CATAAAGGGC。
10、ATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCAAATTCCTCCCGACATACTCAGAC GGCTGAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCC GTGTGTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGG TAGGGGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGTGCTCTGTGGATTTGGACGTCGTCT。
11、C GCTTTTCCCACGCGGTAGAGGTGAAGTGTGTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGCCTGTTTGGTTCCCCTCTAAGAAACG TGGATGATGGGTTTTTGTCTCATTTCTTTTTCCTGTTTCTCGAGAGGTGGGACGAATGTACGTAGTCTGATTTCATT TAAACTTTCAGCAATGGATGTCTTGGTTCGCGCAACGATGAAGGACGCAGCGAAATGCGAAACGCAATGTGAATTGC AGAATTCAGTGAATCATTAGATTTCTGAACGCAAATGGCGCTGCGGGGACATTCCCTGCAGCAT。
12、GTCTGTTTCAGTG TCTCTGAAGTGTCAAGTTCTGTCCACGCGCTTCTGGGAGTGTTTCTGGAATATGCGTGTGGCAGTGTGATTGGATGT CTTGGGTGTTAAGAAGCAAGCTACTCGTGCTTCTAGAGAGCCGAACGTCATCAGAAATAGTCACAGCGGCGTGTACG CGATCAAACAGTGTTGAGTTGTATCCCGGACATCTTTGAGATACGGTGGTGGAATGCTATTAATTACATCAGAAGAT TTCATTGATGGCGGTGATCTACTCGGAGCACTGGTTGGTTGTAACTGAGTAT。
13、CGTCAGCTCTTAGCTTATGAGGGGG 权利要求书 1/3 页 2 CN 106801052 A 2 AGATCGGTAGCGGTACCCTTCATGCTCTTCTCTGCATCTCTCCCGTTTGTGTTCTGTGCGGGGACGCAGGTGGTTGA GGGCTGGGTTGTGCCGGAATTTCCTAATTTTAAGACCTGAAATCAGGCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATTA TTAAGCGGAGGAGAAGAAAATAACAATGATTCCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGATTAGCTCAAAGTGGAAATC GGAGGTTCT。
14、TGATTGAGCCTTTGACTTGTAGCCTCGAGAGGCGTTACCAGTGGAAGCGCAGGGATAAGTTTCTTGGA AAAGAACATCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCCTTGCTCTGCGTTTCTCGTTCCACGTACGGTACGCTTTTATAGAGT CGCGTTCATCGGGATTTGAGCGCAAAATGTGTGATAAGTTTCACATAAAGCTAATACTGGCGCGAGACCGATAGCAA ACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGTTCTTTGGAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGGAAAGGAAG。
15、CG ATTGGAACCTGTTTGATTCCGAAGAGTGAGGCTGGTCCGGCATTGATCCCTCTGCTTTATCCCACTCTTTTTACGGA TGGGAGGCAGGGGTTGGCACTAGATGTAGGACCTGTGGATCTCTTTGGAGAGGTCAGCATCAGTTACAAAGAAGAGA TTCCGGACGAAAAAGGTAGGTTTCCTGTGGACTGCTTTATAGTTTCGCCTGGCGGTTTTCTTTGTGACTGGAGCGTG TTTCCGAATTCGGGCCACACTTTCGAGTACTCGAATTCTGTGATGCTGACTATTATGGTTTCA。
16、ACCGACCCGTCTTG AAACACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCGAGTATGCGGGTGCCAATCCTGTATGCGTAATGAAAGTGAGAGTAG GGAGGTGCGCGGCGCTGCCGCTCTTCACACCTACGACCGACCACGATCTTAGAGAAAGGTTTGAGTTATAGCATATC TGTTAGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGTAGAATGAAGTCAGGGGAAACCCTGATGGAGGTTCGTAGCGA TACTGACGTGCAAATCGTTCGTCAAACTTGGGTA。 2.根据权利要求1所述的一种猪。
17、等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述的Is-HN 18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列由18S rRNA、 ITS1、 5.8S rRNA、 ITS2及28S rRNA组 成。 3.根据权利要求2所述的一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述的18S rRNA 位于rRNA基因序列中1-1804bp， 全长1804bp。 4.根据权利要求2所述的一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述的ITS1位于 rRNA基因序列中1805-2204bp， 全长400bp。 5.根据权利要求2所述的一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述。
18、的5.8SrRNA 位于rRNA基因序列中2205-2542bp， 全长338bp。 6.根据权利要求2所述的一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述的ITS2位于 rRNA基因序列中2543-2975bp， 全长433bp， 所述的ITS2基因为Is保守基因。 7.根据权利要求2所述的一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 其特征在于： 所述的28S rRNA 位于rRNA基因序列中2976-3957bp， 全长982bp。 8.一种猪等孢球虫rRNA基因序列获取方法， 其特征在于它包括： 步骤一， 取分离的猪等孢球虫(Is-HN)卵囊液， 提取Is-HN gDNA。 步骤二， 以步骤。
19、一步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-HN ITS1基因进行PCR扩增， 同 时以ddH2O为模板作为阴性对照， 配制50 L PCR反应体系(2Taq PCR MasterMix： 25 L； 上 游引物： 5 -AAACATCTTTCAAACCTTTAGCAAC-3,下游引物： 5 -ACATCTCTCTCATGATGCGAGTG-3 各0.5 L， 终浓度为1 M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至50 L)； 反应条件为： 94预变性5min， 94 变性30S， 55退火30S， 72延伸1min， 72延伸10min， 35个循环。 取PCR反应产物进行 3琼脂糖。
20、凝胶电泳， 阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收， 产物连接至pMD18-T载体， 再将连 接产物转化入E.coli DH5 感受态细胞。 挑取转化子进行菌落PCR鉴定， 再将阳性菌测序。 步 骤 三 ， 以 步 骤 二 扩 增 获 得 基 因 序 列 为 参 考 设 计 下 游 引 物 ：5 A C A T C T C T C T C A T G A T G C G AG T G - 3； 上 游 引物以已 知 序 列为 参 考 设 计 ： 5- 权利要求书 2/3 页 3 CN 106801052 A 3 GATCCTGCCAGTAGTCAT-3 ， 以2.1步骤所提取Is-HN gDNA为模板。
21、， 对Is-18S rRNA-ITS1基因 进行PCR扩增， 同时以ddH2O为模板作为阴性对照。 配制50 L PCR反应体系(2Taq PCR MasterMix： 25 L； 上游引物、 下游引物各0.5 L， 终浓度为1 M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至50 L)； 反应条件为： 94预变性5min， 94变性30S， 55退火30S， 72延伸3min， 72延伸 10min， 35个循环。 取PCR反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测 序同步骤二的方法。 步骤四， 以步骤三扩增获得基因序列为参考设计Genome walking特异性引物： P1。
22、： 5 - TTCCTCCCGACATACTCAGACG-3； P2： 5 -GAAGGTGAGGAAGCGGTTGTCC-3： P3： 5 - CACATTCATTGTCTACCGCTTGG-3 ， 进行Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的扩增， 取PCR反应产 物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测序同步骤二的方法。 步骤五， 以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-HN18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2- 28S全长基因进行PCR扩增， 同时以ddH2O为模板作为阴性对照。 配制50 L PCR反应体系(2 Taq PCR 。
23、MasterMix:25 L； 以Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)为参考设计扩增上游引 物： 5 -GATCCTGCCAGTAG TCAT-3 ， 以2.4扩增所获得基因序列为参考设计下游引物： 5 - TACCCAAGTTTG ACGAACGATTT-3 ， 各0.5 L， 终浓度为1 M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至50 L)； 反应条件为： 94预变性5min， 94变性30S， 55退火30S， 72延伸4min， 72延伸10min， 35个循环。 取PCR反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测序同步 骤二方法。 权利要求书 3。
24、/3 页 4 CN 106801052 A 4 一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方法 技术领域 0001 本发明涉及生物基因工程技术领域， 更具体的说， 涉及一种猪等孢球虫rRNA基因 序列及其获取方法。 背景技术 0002 猪等孢球虫病是一种由等孢属(Isospora)球虫引起的寄生性原虫病， 可引起仔猪 严重消化道疾病、 腹泻、 消瘦、 发育受阻甚至死亡， 其仔猪发病率可高达50-75， 死亡率 高达75， 呈世界性流行， 严重危害养猪业发展。 0003 核糖体RNA(rRNA)是细胞中含量最多的RNA， 约占RNA总量的82， 与多种蛋白质结 合组成核糖体， 是细胞内蛋白质合成的分。
25、子机器。 rRNA基因序列既含有高度保守的序列区 域， 又有中度保守和高度变化的序列区域， 但同种生物细胞完全一致或极少差异， 且在生物 进化的漫长经历中几乎保持不变， 因此rRNA基因序列的差异被广泛认为是各类生物亲缘关 系的 “分子尺” 。 目前尚未见猪等孢球虫(Isospora suis,Is)rRNA基因完整序列的研究报 道。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题在于提供一种猪等孢球虫rRNA基因序列及其获取方 法， 根据Genbank上Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)及Is ITS1基因序列(LC085519.1) 设计引物， 以Is基因组DNA(gDNA。
26、)为模板， PCR方法扩增获得Is-18S rRNA基因序列； 根据所 获得Is-18S rRNA及Is-ITS1基因序列， 分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物， 利用Ge nome walking技术克隆获得Is-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S rRNA基因全长序列， 从 而为猪等孢球虫新一代检测方法的建立打下基础。 0005 本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现。 0006 一种猪等孢球虫rRNA基因序列， 它包括Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基 因序列， 所述的基因序列为： 0007 GATCCTGCCAGTAGTCAT。
27、ATGCTTGTCTTAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCTTTTATACGGCGAAAC TGCGAATGGCTCATTAAAACAGTTATAGTTTATTTGATGGTCTTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTATGGCT AATACATGCGCACGTGCCTCTTCCTCAGGAAGGGCAGTGTTTATTAGATACAGAACCAACCCACCTTCTGGTGGTCC TCAGGTGATTCATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACCTATC AGCTTT。
28、CGACGGTACTGTATTGGACTACCGTGGCAGTGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGA GCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATTCAGGGAGGTAGTGA CAAGAAATAACAACACTGGAAATTTCATTTCTAGTGATTGGAATGATGGGAATCCAAACCCCTTTCAGAGTAACAAT TGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTT。
29、AAAAA GCTCGTAGTTGGATTTCTGCTGGAAGCAGCCAGTCCGCCCTTAGGGGTGTGTACGTGGTGAAATTCCGGCATCCTCC TGGTGGCGCTTCGCACTTAACTGGGTGGAGTGCTTTTCCAGGACTTTTACTTTGAGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCA 说明书 1/9 页 5 CN 106801052 A 5 GGCTTGTTGCCTTGAATACTGCAGCATGGAATAATAAGATAGGATTTCGGCCCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACTGA AGTAATGATTAATAGGGACGGTTGGGGGCAT。
30、TCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACG AACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAAGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGCTCGAAGACGACCAGATA CCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATAGGAAAACGTCATACTTGACTTCTCCTGCACCTTATGA GAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCAC CAGGCGTGGAGCCTGCGGC。
31、TTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAGAAAGGATTGACAGA TTGATAGCCCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATT CCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATCAGGAACCTCGTGTTCTTGTATCACTTCTTAGAGGGACTT TGCGTGTCTAACGCAAGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCTGCACGCGCGCT ACACTGA。
32、TGCATCCAACGAGTTTATAACCTTGGCCGATAGGTCTAGGTAATCTTGTGAGTATGCATCGTGATGGGGA TAGATTATTGCAATTATTAATCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAGGCGCAAGTCAGCAGCTTGCGCCGATTACGTCCC TGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAGTGTTCCGGTGAATTATTCGGACCGTTCTGTGGCGCGT TCGTGCCCGAGATGGAAAGTTTTGTGAACCTTAACACTTAGAGGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG。
33、GTGA ACCTGCGGAAGGATCATTCACACGTGGCCCTTGAAACATCTTTCAAACCTTTAGCAACTGAATCCCCATATTGATGG TCATAAGGAACAGCCTGCTGAGCGTTCGGGGGAAGCTGTGTTTCCCCGCGCCGCCGGCTGCTTCGAATGGCCGCATA AAGGGCATTAGCCGTTATTGCTGATGTGTTCGCCTACAGGGGACGCTGCAAATTCCTCCCGACATACTCAGACGGCT GAAACAGAATAGGGGTTGTTCTCTTCTCTTCTGTTTGCCCTCTGAGCTATGGAAGGTGAGG。
34、AAGCGGTTGTCCGTGT GTGGGGGAGTTTGGACTGCAGCGATGGCTTCCAAGTGCTCTGCTACACACATTCATTGTCTACCGCTTGGTGGTAGG GGCAGTCTGTATCCACTGGGGCCGTCACTCGCATCATGAGAGAGATGTGCTCTGTGGATTTGGACGTCGTCTCGCTT TTCCCACGCGGTAGAGGTGAAGTGTGTTTTTTTTTTTTTTCACTTCGCCTGTTTGGTTCCCCTCTAAGAAACGTGGA TGATGGGTTTTTGTCTCATTTCTTTTTCCTGTTTCTCGAGAGGTGGGAC。
35、GAATGTACGTAGTCTGATTTCATTTAAA CTTTCAGCAATGGATGTCTTGGTTCGCGCAACGATGAAGGACGCAGCGAAATGCGAAACGCAATGTGAATTGCAGAA TTCAGTGAATCATTAGATTTCTGAACGCAAATGGCGCTGCGGGGACATTCCCTGCAGCATGTCTGTTTCAGTGTCTC TGAAGTGTCAAGTTCTGTCCACGCGCTTCTGGGAGTGTTTCTGGAATATGCGTGTGGCAGTGTGATTGGATGTCTTG GGTGTTAAGAAGCAAGCTACTCGTGCTTCTAGAGAGC。
36、CGAACGTCATCAGAAATAGTCACAGCGGCGTGTACGCGAT CAAACAGTGTTGAGTTGTATCCCGGACATCTTTGAGATACGGTGGTGGAATGCTATTAATTACATCAGAAGATTTCA TTGATGGCGGTGATCTACTCGGAGCACTGGTTGGTTGTAACTGAGTATCGTCAGCTCTTAGCTTATGAGGGGGAGAT CGGTAGCGGTACCCTTCATGCTCTTCTCTGCATCTCTCCCGTTTGTGTTCTGTGCGGGGACGCAGGTGGTTGAGGGC TGGGTTGTGCCGGAATTTCCTAATT。
37、TTAAGACCTGAAATCAGGCGAGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATTATTAA GCGGAGGAGAAGAAAATAACAATGATTCCCCCAGTAACGGCGAGTGAAGAGGGATTAGCTCAAAGTGGAAATCGGAG GTTCTTGATTGAGCCTTTGACTTGTAGCCTCGAGAGGCGTTACCAGTGGAAGCGCAGGGATAAGTTTCTTGGAAAAG AACATCAGAGAGGGTGAGAATCCCGTCCTTGCTCTGCGTTTCTCGTTCCACGTACGGTACGCTTTTATAGAGTCGCG TTCATCGGGATTT。
38、GAGCGCAAAATGTGTGATAAGTTTCACATAAAGCTAATACTGGCGCGAGACCGATAGCAAACAA GTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGTTCTTTGGAAAGAGAGTTAAAAGTGCCTGAAATTGCTGGAAAGGAAGCGATTG GAACCTGTTTGATTCCGAAGAGTGAGGCTGGTCCGGCATTGATCCCTCTGCTTTATCCCACTCTTTTTACGGATGGG AGGCAGGGGTTGGCACTAGATGTAGGACCTGTGGATCTCTTTGGAGAGGTCAGCATCAGTTACAAAGAAGAGATTCC G。
39、GACGAAAAAGGTAGGTTTCCTGTGGACTGCTTTATAGTTTCGCCTGGCGGTTTTCTTTGTGACTGGAGCGTGTTTC CGAATTCGGGCCACACTTTCGAGTACTCGAATTCTGTGATGCTGACTATTATGGTTTCAACCGACCCGTCTTGAAAC ACGGACCAAGGAGTCTAACATATGTGCGAGTATGCGGGTGCCAATCCTGTATGCGTAATGAAAGTGAGAGTAGGGAG 说明书 2/9 页 6 CN 106801052 A 6 GTGCGCGGCGCTGCCGCTCTTCACACCTACGACCGACC。
40、ACGATCTTAGAGAAAGGTTTGAGTTATAGCATATCTGTT AGGACCCGAAAGATGGTGAACTATGCCTGGGTAGAATGAAGTCAGGGGAAACCCTGATGGAGGTTCGTAGCGATACT GACGTGCAAATCGTTCGTCAAACTTGGGTA。 0008 进一步， 所述的Is-HN 18SrRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列由18S rRNA、 ITS1、 5.8S rRNA、 ITS2及28S rRNA组成， 其中1-1804bp为18SrRNA基因， 全长1804bp； 1805-2204bp 为ITS1基因， 全长4。
41、00bp； 2205-2542bp为5.8SrRNA基因， 全长338bp； 2543-2975bp为ITS2基 因， 全长433bp； 2976-3957bp为28S rRNA基因， 全长982bp， 其中ITS2基因为Is保守基因。 0009 本发明还涉及一种猪等孢球虫rRNA基因序列获取方法， 它包括： 0010 步骤一， 取分离的猪等孢球虫(Is-HN)卵囊液， 提取Is-HN gDNA。 0011 步骤二， 以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-HN ITS1基因进行PCR扩 增， 同时以ddH2O为模板作为阴性对照， 配制50 L PCR反应体系(2Taq PCR。
42、 MasterMix： 25 L ； 上 游 引 物 ： 5- A A A C A T C T T T C A A A C C T T T A G C A A C - 3 ,下 游 引 物 ： 5- ACATCTCTCTCATGATGCGAGTG-3 各0.5 L， 终浓度为1 M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至50 L)； 反 应条件为： 94预变性5min， 94变性30S， 55退火30S， 72延伸1min， 72延伸10min， 35 个循环。 取PCR反应产物进行3琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物经胶回收试剂盒纯化回收， 产物 连接至pMD18-T载体， 再将连接产物转化入E.。
43、coli DH5 感受态细胞。 挑取转化子进行菌落 PCR鉴定， 再将阳性菌测序。 0012 步 骤三 ， 以 步 骤二扩 增获 得基因 序列为参考设 计下 游 引物 ： 5 AC AT CTCTCTCATGATGCGAGTG-3 ； 上游引物以已知序列为参考设计： 5 -GATCCTG CCAGTAGTCAT- 3 ， 以2.1步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-18S rRNA-ITS1基因进行PCR扩增， 同时以 ddH2O为模板作为阴性对照。 配制50 L PCR反应体系(2Taq PCR MasterMix： 25 L； 上游引 物、 下游引物各0.5 L， 终浓度为1 。
44、M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至50 L)； 反应条件为： 94预 变性5min， 94变性30S， 55退火30S， 72延伸3min， 72延伸10min， 35个循环。 取PCR反 应产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测序同步骤二的方法。 0013 步骤四， 以步骤三扩增获得基因序列为参考设计Genome walking特异性引物： P1： 5 -TTCCTCCCGACATACTCAGACG-3 ； P2： 5 -GAAGGTGAGGAAG CGGTTGTCC-3 ： P3： 5 - CACATTCATTGTCTACCGCTTGG-3 ， 进行Is-HN。
45、 ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的扩增， 取PCR反应产 物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测序同步骤二的方法。 0014 步骤五， 以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-HN18S rRNA-ITS1-5.8S- ITS2-28S全长基因进行PCR扩增， 同时以ddH2O为模板作为阴性对照。 配制50 L PCR反应体 系(2Taq PCR MasterMix:25 L； 以Is 18S rRNA基因全序列(U97523.1)为参考设计扩增 上游引物： 5 -GATC CTGCCAGTAG TCAT-3 ， 以2.4扩增所获得基因序列为参考设计。
46、下游引 物： 5 -TACCCAAGTTTG ACGAACGATTT-3 ， 各0.5 L， 终浓度为1 M； gDNA模板1 L； 添加ddH2O至 50 L)； 反应条件为： 94预变性5min， 94变性30S， 55退火30S， 72延伸4min， 72延伸 10min， 35个循环。 取PCR反应产物进行1琼脂糖凝胶电泳， 阳性产物的回收、 连接转化及测 序同步骤二方法。 0015 与已有技术相比， 本发明的有益效果体现在： 0016 1.本发明通过对猪等孢球虫核糖体RNA的生物信息学分析， 以临床所分离猪等孢 球虫为模型， 利用分子生物学方法首次成功扩增获得全长为3957bp的Is。
47、-HN 18S rRNA- 说明书 3/9 页 7 CN 106801052 A 7 ITS1-5.8S-ITS2-28S基因序列， 增进对猪等孢球虫rRNA的认识， 从而填补猪等孢球虫此方 面的空白； 0017 2 .本发明根据已知部分片段设计高效引物， 首次利用分段扩增及Geno me walking技术对猪等孢球虫rRNA进行成功扩增， 证明该方法适用于寄生虫病原重要未知基 因片段的扩增， 从而拓展了新一代分子生物学应用领域； 0018 3.本发明所获得的rRNA在各种生物体之间既存在高度保守区域， 也包含高度变化 区域， 同种生物此部分基因序列完全一致或极少差异， 且在生物进化的漫长经。
48、历中几乎保 持不变， 因此通过不同种或者同种球虫不同分离株在此部分基因序列的变化比较， 可以推 断其在进化过程中的亲缘关系， 即通过系统发生树的构建做物种鉴定， 对于正确认识及区 分球虫的生物学特性具有重要意义； 0019 4.本发明对所获得基因序列进行生物信息学分析发现全长为433bp的ITS2基因序 列为猪等孢球虫所特有的核糖体RNA基因序列， 从而为猪等孢球虫的特异性分子检测提供 模板， 为猪等孢球虫病的有效防控打下基础。 附图说明 0020 图1为本发明Is-HN ITS1基因的PCR扩增结果示意图； 0021 图2为本发明Is-HN 18S rRNA-ITS1基因的PCR扩增结果示意。
49、图； 0022 图3为本发明Is-HN ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的PCR扩增结果示意图； 0023 图4为本发明Is-HN 18S rRNA-ITS1-5.8S-ITS2-28S基因的PCR扩增结果示意图； 0024 图5为本发明Is-HN ITS2BLAST结果示意图。 具体实施方式 0025 为了使发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结合 具体图示， 进一步阐述本发明。 0026 如图1图5所示， 一种猪等孢球虫rRNA基因序列获取方法， 它包括： 0027 步骤一， 取分离的猪等孢球虫(Is-HN)卵囊液， 提取Is-HN gDNA。 0028 步骤二， 以步骤一步骤所提取Is-HN gDNA为模板， 对Is-HN ITS1基因进行PCR扩 增， 同时以ddH2O为模板作为阴性对照， 配制50 L PCR反应体系(2Taq PCR MasterMix： 25 L ； 上 游 引 物 ： 5- A A A C A T C T T T C A A A C C T T。