技术领域
本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种用于准确定性检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的引物及其应用。
背景技术
肺癌危害性大且致死率高，目前是全世界癌症死因的第一名，1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织(WHO)公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年，肺癌中75％～80％为非小细胞肺癌。晚期肺癌病人采用放、化疗等治疗手段不仅降低了生存质量，且疗效不佳。易瑞沙(Iressa，即吉非替尼Gefitinib)是目前临床使用最为成功的晚期肺癌靶向治疗药物，为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase inhibitors，TKI)，临床试验证实对东方人(亚洲人为主)、女性、非吸烟者、肺泡细胞癌或腺癌患者的疗效较好。进一步的研究表明，非小细胞肺癌患者EGFR基因上携带20外显子上T790M突变型患者则对易瑞沙耐受，而对AZD9291靶向药物敏感。
目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量PCR，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。
Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代DNA序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，DNA片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。相比传统测序技术和荧光定量PCR检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1-5％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。但是针对临床上一些特殊标本，如血浆、胸腹水等来源的标本，5％的检测灵敏度远远不够。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变试剂盒，以解决现有技术中表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测结果准确率低的缺点。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的如下技术方案：
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的引物，包括：
SEQ ID NO：1～2所示的扩增引物、SEQ ID NO：3所示的测序引物、SEQ ID NO：4所示的扩增阻滞引物，所述扩增阻滞引物的5’末端最后两个碱基与扩增引物的上游引物3’末端前两个碱基序列相同；
其中，SEQ ID NO：2其5’端标记生物素；SEQ ID NO：4其3’端磷酸化处理；以上核酸序列在一次检测中共同使用。
其中，所述扩增阻滞引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明中，通过引入扩增阻滞引物，降低了野生型序列的扩增，相对增加了突变基因型的扩增，结合焦磷酸测序技术大大提高了检出灵敏度。相比于现在临床上普遍采用的ARMS检测EGFR T790M的方法(1％灵敏度)，检测灵敏度提高至0.1％，提高了临床标本的阳性检出率，可以为更多的患者提供了准确的用药参考。
一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变的试剂盒，包括权利要求1～4所示的引物以及如下试剂：
(1)DNA提取试剂；
(2)生物素标记亲和磁珠；
(2)反应液：PCR缓冲液，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，2U/μL Taq DNA聚合酶；
(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2M NaOH，10mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；
(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素和dNTP。
其中，所述PCR缓冲液包括：0.1％(v/v)NP-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mL BSA，0.1％(v/v)吐温-20，0.06M pH8.9Tricine。
其中，所述的缓冲液包括：10mM Tris-HCl，2M NaCl，1mM EDTA，0.1％(v/v)吐温-20。
其中，所述的退火缓冲液包括：20mM pH 7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐，2mM醋酸镁。
一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法，包括如下步骤：
(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组DNA；
(2)以步骤(1)中所得DNA为模板，PCR扩增EGFR T790M位点核酸序列片段；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)测序得到SNP突变频率。
上述检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变的方法，步骤(2)中，
PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO.：4 5uL，Template DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水补足至50μL；
PCR扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。
有益效果：本发明的一种检测表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变检测方法和试剂盒，应用焦磷酸测序技术可以准确检测突变该位点的突变，可用于临床启动EGFR-TKI用于治疗非小细胞肺癌前的靶标位点EGFR T790M突变检测，筛选药物敏感和耐药的患者。本发明方法操作简单，敏感性高，降低了样本取材要求，结果易于判读，大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率，为患者避免无效有害的治疗，节省宝贵的治疗时间。
本发明通过对EGFR基因型序列分析，设计了特异的生物素标记引物，利用PCR和焦磷酸测序技术，准确检测与肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M低频突变。该方法可快速准确的检测低至0.1％的EGFR T790M突变。其重要意义在于：(1)指导肺癌患者有针对性用药，避免无效用药；(2)改善预后；(3)避免获得耐药；(4)降低对样本组织的取材要求；(5)减少医疗费用。
附图说明
图示1为突变频率为20％的标准品，经本方法检测后突变频率变为82.5％。
图示2为突变频率为2％的标准品，经本方法检测后突变频率变为10.1％。
图示3为突变频率为0.2％的标准品，经本方法检测后，突变频率变为4.5％。
图示4为一例石蜡组织标本检测结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：试剂。
(1)DNA提取试剂：
购自QIAGEN公司。
(2)反应液：
PCR Buffer：购自美国Fermentas公司；
引物SEQ ID NO：1～4，由上海英俊生物科技有限公司合成；
MgCl2：购自美国Fermentas公司；
0.2mM dNTPs：购自美国Fermentas公司；
2U/μL Taq DNA聚合酶：购自美国Fermentas公司。
(3)单链纯化试剂：
75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；
0.2M NaOH：购于上海试四赫维化工有限公司；
10mM Tris-Acetate(pH 7.6)：Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；
结合缓冲液：由10mM Tris-HCl(Tris-base购于美国Sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司),2M NaCl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mM EDTA(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)Tween 20(购于美国Sigma公司)组成；
退火缓冲液：由20mM Tris-Acetate(pH 7.6)(Tris-base购于美国Sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mM醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；
亲和素标记的磁珠(购于GE healthcare Bioscience AB)。
(4)测序试剂：
DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于QIAGEN公司；
底物APS和荧光素：购于QIAGEN公司；
四种dNTP(dATP S，dTTP，dCTP，dGTP)：购于QIAGEN公司。
实施例2：检测方法。
仪器：Bio-Rad S1000PCR仪，Beckman Microfuge 22R台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，QIAGEN PyroMark Q96ID测序仪。
(1)提取石蜡标本组织DNA，具体步骤如下：将石蜡标本置于二甲苯中，去除石蜡；加入裂解缓冲液和蛋白酶K，在变性条件下消化组织，裂解细胞；置于90℃孵育，逆转福尔马林交联；将裂解液通过硅胶膜使DNA吸附到硅胶膜上，加入漂洗液洗涤杂质，最后将高纯、浓缩的DNA从硅胶膜上洗脱，得到基因组DNA收集液。
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用EGFR特异性引物进行PCR扩增；
其中，所述的PCR扩增体系为：10×PCR buffer 5μL，SEQ ID NO：1 0.5μL，SEQ ID NO：2 0.5μL，SEQ ID NO：4 5uL，Template DNA 3μl，0.2mΜ dNTPs，2mM MgCl2，Taq DNA聚合酶2U，加无菌水补足至50μL；PCR扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：
(a)在使用前，保证所有溶液都达到室温；
(b)在PSQ 96板中加入45μl annealing buffer，然后每孔加入SEQ ID NO：3测序引物(10uM)1uL；
(c)使用Vertex混匀Sepharose beads,将需要使用的sepharoe beads总量(每样本3μL)转移到一个Eppendorf管中，在sepharose bead中加入binding buffer，使得平均每个样品约有50μL的体积，将混合物混匀；
(d)将以上混合物加入PCR产物(50μL反应体积)中，每样本50μL，将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；
(e)在Vacuum prep workstation中，四个样品板中依次加入180mL高纯水、70％乙醇、washing buffer和120ml Denaturation buffer；
(f)打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒,然后将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取sepharose beads，将vacuum prep tool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuum prep tool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharose beads；
(g)使用高纯水清洗vacuum prep tool。
将放有样品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。
(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；
(5)读取测序结果。
标准品的检测结果如图1～3所示，图示1为突变频率为20％的标准品，经本方法检测后突变频率变为82.5％，图示2为突变频率为2％的标准品，经本方法检测后突变频率变为10.1％，图示3为突变频率为0.2％的标准品，经本方法检测后，突变频率变为4.5％。
将本发明方法用于1例临床石蜡组织标本的检测，测序结果如图4所示。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州迪安医学检验中心有限公司
<120> 一种检测表皮生长因子受体基因T790M低频突变引物及其应用
<130> SG20161208001
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游扩增引物
<400> 1
ctcacctcca ccgtgcagc 19
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
gtctttgtgt tcccggacat agtc 24
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 测序引物
<400> 3
accgtgcagc tcatca 16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 扩增阻滞引物
<400> 4
gctcatcatg cagctcatgc c 21