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人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法.pdf

上传人：00062****4422

文档编号：8815902

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710071474.9 (22)申请日 2017.02.09 (71)申请人福建医科大学附属第一医院地址 350000 福建省福州市台江区茶中路 20号 (72)发明人陈万金王柠 (74)专利代理机构厦门龙格专利事务所(普通合伙) 35207 代理人钟毅虹 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法 (57)摘要本发明涉及人类特发性基底节钙化。

2、致病基因及其检测方法,人类特发性基底节钙化即IBGC 是一种神经系统变性遗传病。本发明提供了 SLC20A2、 PDGFRB、 PDGFB和XPR1这4个致病基因的 7种突变形式，其序列如SEQIDNO.1-7所示。本发明提供的致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。同时本发明构建了致病基因检测方法：首先利用多重PCR捕获致病基因外显子区域，再对其进行二代测序、通过信息分析找出突变，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQIDNO .1。

3、2-23， Sanger测序片段的扩增引物序列如SEQID NO.24-35所示。本发明检测方法覆盖了4个致病基因的全部外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。权利要求书1页说明书10页序列表27页附图3页 CN 106834299 A 2017.06.13 CN 106834299 A 1.人类特发性基底节钙化致病基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO.1-7中任一序列所示，共涉及SLC20A2、 PDGFRB、 PDGFB和XPR1这4个基因的7种突变形式。 2.根据权利要求1所述的人类特发性基底节钙化致病基因，其特征在于所述致病基因在制备人类特。

4、发性基底节钙化疾病诊断芯片、构建人类特发性基底节钙化疾病检测方法、研发人类特发性基底节钙化疾病治疗药物中的应用。 3.根据权利要求1所述的人类特发性基底节钙化致病基因,其特征在于致病基因检测方法的主要步骤如下: (1)4个致病基因的PCR捕获提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩增； (2)二代测序解析基因突变谱将(1)中的多重PCR扩增产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点； (3)突变位点的验证对于结果是所述SLC20A2、 PDGFRB、 PDGFB和XPR1这4个基因的7种突变形式之一的，则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序。

5、验证；对于结果是新发现突变的，将根据情况设计引物将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况进行验证。 4.根据权利要求3所述的人类特发性基底节钙化致病基因检测方法,其特征在于步骤 (1)中所述的PCR捕获引物组包含SEQ ID NO.12-23这12条序列。 5.根据权利要求3所述的人类特发性基底节钙化致病基因检测方法，其特征在于所述7 种突变形式对应的突变片段的扩增，具体是指对于SLC20A2基因的c.799GC突变，扩增引物对为SEQ ID NO.24-25；对于PDGFRB基因的c.3G。

6、A和c.2209GA突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.26-27和SEQ ID NO.28-29；对于PDGFB基因的c.220GT和c.232CT突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.28-29和SEQ ID NO.30-31；对于XPR1基因的c.490GT和c.1708CT突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.32-33和SEQ ID NO.34-35。权利要求书 1/1 页 2 CN 106834299 A 2 人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法技术领域 0001 本发明涉及基因及其检测方法，特别涉及人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法。。

7、背景技术 0002 人类特发性基底节钙化(Idiopathic Basal Gang1ia Calcification,IBGC)是一种以影像学上基底节及脑其它部位对称性钙化为特征的神经系统变性遗传病,也称Fahr 病。钙化最常见的部位为基底节区豆状核，尤其是苍白球，也常见于壳核、丘脑、尾状核及小脑齿状核等部位，甚至出现在大脑皮层及皮层下白质。 IBGC属罕见病，呈散发或家族性发病，家族性患者发病年龄逐代提前，进展缓慢、病程较长。该病无明显性别差异，表现为复杂多样的运动损害和行为症状的组合，同一家族中的不同成员之间临床症状往往存在差异。临床表现以神经、精神。

8、功能紊乱为主，轻者仅仅为轻度注意力或记忆力的下降，重者则会出现人格及行为改变，终致精神病或痴呆。 0003 IBGC有家族性发病的现象，常染色体显性遗传和隐性遗传的病例均有报道，以常染色体显性遗传居多。遗传性IBGC相关致病基因和发病机制长期以来并未得到解析，直到 2012年Liu等人在IBGC3基因位点中，通过连锁分析、单倍体分析、 Sanger测序等成功克隆特发性基底节钙化的致病基因SLC20A2，并且在不同种族中得到验证；此后， PDGFRB、 PDGFB和 XPR1这三个致病基因陆续被发现和得到验证。其中， SLC20A2基因编码的蛋白为钠-磷共转运体(。

9、PiT2)，参与机体的钙磷调节； PDGFRB基因编码血小板衍生生长因子受体PDGFR ，属于 III型受体酪氨酸激酶家族； PDGFB基因则编码血小板衍生生长因子PDGF-B，与PDGFB 结合可激活下游信号通路，参与细胞的增殖、分化、生存以及迁移； XPR1基因编码的蛋白含有SPX 结构域，主要参与磷稳态的维持，具有Pi输出功能。 0004 为了系统解析IBGC致病基因突变，本发明设计和合成了覆盖4个已知致病基因的 PCR捕获引物组，并结合二代测序技术对10个IBGC患者样本进行捕获测序，共分析得出了1 种SLC20A2基因突变、 2种PDGFRB基因突变、 2种P。

10、DGFB基因突变和2种XPR1基因突变，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对各自的致病基因突变，利用Sanger测序分析对应的家系中其它成员的样本，全部符合基因型-表型共分离规律从而致病基因突变得到了验证。进一步的，采用同样的方法在另外12个IBGC患者和200个正常人样本中进行了验证。本发明提供的IBGC致病基因突变尚未见报道，其对于该病的解析、筛查、检测和治疗具有潜在的重要价值。此外，本发明基于PCR捕获结合二代测序(简称PCR捕获测序)构建的IBGC致病基因检测方法，可以同时全面解析4种IBGC致病基因突变谱，具有通量高、灵敏度高、可解。

11、析未知突变的优点。目前，国内外均没有该方法在IBGC致病基因SLC20A2， PDGFRB， PDGFB， XPR1突变同时检测方面应用的报道。由于单次反应测序长度的限制(1000bp以内)，传统的基于 Sanger测序的方法进行的全面解析，费用高昂且费时费力。而基于实时荧光定量PCR的突变检测方法，则只能针对少量已知的突变。说明书 1/10 页 3 CN 106834299 A 3 发明内容 0005 本发明提供了IBGC相关的4个致病基因的7种突变基因形式，同时提供了基于PCR 捕获测序的检测方法；这些可以为IBGC致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测。

12、以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。 0006 本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下： 0007 本发明提供了IBGC的7种致病基因形式，包括1种SLC20A2突变基因，其序列如SEQ ID NO.1所示； 2种PDGFRB突变基因，其序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示； 2种PDGFB突变基因，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；和2种XPR1突变基因，其序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。 0008 所述涉及SLC20A2、 PDGFRB、 PDGFB和XPR1这4个基因共7种突变基因类型经检测和验。

13、证，均为IBGC致病基因。其中， SLC20A2突变基因的突变位点在Exon7中，具体是野生型基因第799位的G突变为C； PDGFRB突变基因的突变位点其一在Exon 2中，具体是野生型基因第 3位的G突变为A,其二在Exon16中，具体是野生型基因第2209位的G突变为A； PDGFB突变基因的突变位点其一在Exon3中，具体是野生型基因第220位的G突变为T，其二也在Exon3中，具体是野生型基因第232位的C突变为T； XPR1突变基因的突变位点其一在Exon 5中，具体是野生型基因第490位的G突变为T，其二在Exon13中，具体是野生型基因第1708位。

14、的C突变为T。由于突变发生在外显子区，因此本发明提供的SEQ ID NO.1-7为编码区序列。另外，提供的 SEQ ID NO.8-11分别是SLC20A2， PDGFRB， PDGFB， XPR1的野生型基因的编码区序列，供参比。 0009 本发明提供的基于PCR捕获测序的IBGC致病基因检测方法(参见图1)包括如下主要步骤： 0010 (1)4个致病基因的PCR捕获 0011 提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩增； 0012 (2)二代测序解析基因突变谱 0013 将(1)中的多重PCR扩增产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点； 0014。

15、 (3)突变位点的验证 0015 对于结果是已知突变的，则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现突变的，则根据情况设计引物将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger 测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况进行验证。 0016 其中， (1)中所述PCR捕获引物组是利用美国Thermo Fisher公司的在线软件Ion AmpliSeq Designer进行设计的，至少应该捕获所述所有7种突变形式其突变位点所在区域，结果显示至少需要SEQ ID NO.12-23这12条序列。优选地，可以针对SLC20A。

16、2、 PDGFRB、 PDGFB和XPR1这4个基因所有外显子及其侧翼序列，使得目标基因覆盖率达100，结果共获得了69对引物，其序列如表1所示。 0017 表1 PCR捕获扩增引物组说明书 2/10 页 4 CN 106834299 A 4 0018 说明书 3/10 页 5 CN 106834299 A 5 0019 说明书 4/10 页 6 CN 106834299 A 6 0020 说明书 5/10 页 7 CN 106834299 A 7 0021 0022 其中， (1)中进行的多重PCR扩增体系(20ul)如表2所示。 5X Ion AmpliSeqTMHiFi Mix。

17、、 2X Ion AmpliSeqTM引物组和20X Ion AmpliSeqTMSample ID Panel均购置于美国 Thermo Fisher公司。 0023 表2 PCR捕获扩增体系 0024 成分添加量(ul) 5X Ion AmpliSeqTMHiFi Mix4 2X Ion AmpliSeqTM引物组10 20X Ion AmpliSeqTMSample ID Panel1 浓度20ng/ul的样本基因组DNA0.5 灭菌的Nuclease-free Water4.5 0025 其中， (1)中所述的多重PCR扩增阶段和条件如表3所示： 0026 表3 PCR捕获扩增阶段和条。

18、件 0027 0028 其中， (2)中所述的PCR扩增捕获产物进行的二代测序和信息分析，有二代测序仪和配套分析软件则按照规范操作和分析进行，或可由商业化的高通量测序公司完成，最终需得到所检测样本的致病基因突变信息。 0029 其中， (3)中所述的已知突变指的是前述的7种突变形式(可详见表4)，所述新发现突变指的是这7种已发现突变外的其它突变形式。所述的原样本是指(1)中提取的待测样本基因组，除用于PCR捕获测序模板外剩余的部分；或者原检测样本再次提取的基因组DNA。所述突变包括点突变、插入或缺失，但不限于此。 0030 其中， (3)中所述对于已知突变则将原样。

19、本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证，是指利用特定的引物对扩增突变片段并进行Sanger测序，验证是否同二代测序检出的突变结果一致；有Sanger测序仪则按规范操作进行测序或可送商业化测序公司完成，最终需得到对应的扩增子序列。所述原样本突变片段扩增是指，对于SLC20A2基因的c.799GC 突变，扩增引物对为SEQ ID NO.24-25；对于PDGFRB基因的c.3GA和c.2209GA突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.26-27和SEQ ID NO.28-29；对于PDGFB基因的c.220GT和c.232CT 突变，扩增引物对分别为SEQ 。

20、ID NO.28-29和SEQ ID NO.30-31；对于XPR1基因的c.490GT 和c.1708CT突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.32-33和SEQ ID NO.34-35。说明书 6/10 页 8 CN 106834299 A 8 0031 其中， (3)中所述的患者家系相关成员必须包括IBGC患者和非IBGC患者。所述基因型-表型共分离是指基因型决定表型，由此两者符合共同对应的遗传学传递现象和规律。 0032 本发明提供的IBGC相关4个致病基因的7种突变基因类型，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定。

21、基础；此外本发明提供的基于PCR捕获测序的致病基因检测方法，覆盖了4个致病基因的全部外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。附图说明 0033 图1是本发明IBGC致病基因检测方法流程图。 0034 图2-8是各种基因突变形式的Sanger测序验证图谱突变位点局部。其中图2对应于实施例1中的1号患者，为SLC20A2基因的c.799GC突变， 2号、 3号和4号患者的图谱与其类似；图3、图4、图5、图6、图7、和图8分别对应于实施例1中的5、 6、 7、 8、 9和10号患者，分别为 PDGFRB的c.3GA、 PDGFRB的c.2209GA、 PDGF。

22、B的c.220GT、 PDGFB的c.232CT、 XPR1的c.490G T和XPR1的c.1708CT；各图中的序列位点数字只代表对应扩增子，并不代表突变位点在实际基因中的位置。 0035 图9是实施例1中1号IBGC患者颅脑CT平扫影像。 0036 图10是实施例1中1号IBGC患者所在家系的遗传图谱。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；箭头表示先证者，带斜线表示死亡，带问号表示未行颅脑CT检查个体；实心表示IBGC患病个体，空心表示正常个体；“+” 表示SLC20A2基因检出c.799GC突变，“-” 表示 SLC20A2基因未检出c.799GC突变； I、 I。

23、I和III分别代表第1、 2和3代，数字为成员编号。具体实施方式 0037 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。 0038 实施例1 0039 根据详细的病史和家族史调查情况以及规范的神经系统体格检查和相关辅助检查信息，选择所在医院10名IBGC患者在其签署了知情同意书的情况下，进行致病基因检测和分析。 0040 (1)4个致病基因的PCR捕获 0041 取患者肘静脉血10ml(EDTA抗凝)，用QIAamp DNA Blood Mini Ki t(德国Qiagen 公司)提取基因组DNA，以其为模板采用表1的PCR捕获引物组按照表2配制扩增体系，并在常规PCR仪上按照。

24、表3条件进行反应。 0042 (2)二代测序解析基因突变谱 0043 将(1)中的多重PCR扩增产物送上海晶能生物技术有限公司进行二代测序，采用的是Ion PGM Template OT2 200试剂盒进行乳液PCR， Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠进行阳性模板富集；以上两步反应均在Ion One Touch系统上进行。建库后采用Ion PGM Sequencing kit及Ion Torrent 316v2芯片，在PGM测序仪上进行测序反应。采用PGM服务器自带分析软件对测序结果初步分析，再用千人基因组数据库、 SNP数据库和COSMIC。

25、(version 64)数据库等进行突变位点解析，结果如表4所示，共计有7种突变。 0044 表4 10例IBGC患者致病基因检测及验证结果说明书 7/10 页 9 CN 106834299 A 9 0045 0046 0047 (3)突变位点的验证 0048 根据所检出的突变，利用前述特定引物对将原样本突变片段扩增后直接进行 Sanger测序验证。采用Takara的rTaq聚合酶扩增，其扩增体系详见表5，扩增引物对详见表 6， PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。 Sanger测序结果发现均与二代测序结果一致(表4)。 0049 表5扩增体系 005。

26、0 编号组份添加量 110X PCR buffer(Mg+)2.5ul 2dNTP Mix0.5ul 3Primer(50uM)F0.25ul 4Primer(50uM)R0.25ul 5rTaq0.25ul 6Template DNA(30ng/ul)1ul 7灭菌ddH2O20ul 0051 表6扩增引物对说明书 8/10 页 10 CN 106834299 A 10 0052 0053 0054 扩增条件为： 94预变性3min； 30个循环： 94变性30s， 60/65退火30s， 72 延伸30s； 72终延伸5min。 0055 由于这7种突变均未被报道，因此收集这10例IB。

27、GC患者家系相关成员样本，再通过 Sanger测序突变片段。以S1号患者为例，如图9所示其为家系先证者III4，无明显症状，颅脑 CT平扫示双侧苍白球及小脑齿状核对称性大面积钙化。根据PGM数据可知，其SLC20A2基因第799位的G突变为C；利用引物对SEQ ID NO.24-25扩增SLC20A2基因c.799GC突变片段，其直接Sanger测序结果(如图2所示)，与二代测序结果一致。收集该家系中的其他成员资料，能获得该家系6个阳性成员， 4个阴性成员的影像资料(如图10中所示)：即先证者III4、 II1、 II3、 II8、 III2及III7的颅脑CT平。

28、扫均显示双侧基底节区及小脑存在大片钙化灶， II2、 III1、 III5、 III6颅内均无钙化灶。采集这10个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO.24-25扩增SLC20A2基因c.799GC突变片段， Sanger测序显示6个阳性患者均存在该突变位点，而4个阴性成员均无该位点突变，即出现了基因型-表型的家系共分离现象，由此证明了SLC20A2基因的c.799GC突变是该家系的致病性突变。表4中其余9例患者，经过同样的分析均出现家系共分离现象(表4)。因此，通过本实施例获得了7种IBGC的致病基因，其序列对应信息详见表4。 005。

29、6 (4)致病基因制备和获取 0057 基于本发明新鉴定的IBGC的7种致病基因，为了开展致病机理机制、筛查检测方法和试剂盒开发、治疗药物研发等科研生产工作需要，申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，置于-80冰箱中保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。 0058 实施例2 0059 另取与实施例1中不同的IBGC患者12例以及200例正常人血样进行分析，方法同实施例2，其结果如表7所示。 0060 表7 12例IBGC患。

30、者致病基因检测及验证结果说明书 9/10 页 11 CN 106834299 A 11 0061 0062 对于表5中IBGC患者的突变均经过Sanger测序验证了，所有突变基因均属于所述7 种基因突变形式；而在200例正常人中，均不存在所述的突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的IBGC致病基因，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。 0063 虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明。

31、书 10/10 页 12 CN 106834299 A 12 SEQUENCE LISTING 申请人福建医科大学附属第一医院发明名称人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法 35 PatentIn version 3.3 1 3702 DNA 智人（Homo sapiens） 1 cgcttccgga agcgggcgac tcgcagctcc acgcgacgcc gaggggctcc gcgccgggac 60 cgggcgggtg ctcggagttt cggggaccgc acgggaccga gggcaggagg agacatcaca 120 gctttcccag atcg。

32、ggagga aaaatatgga atgtgtttta ccgctgactg aacacaacca 180 aatgaactgt cctgacagta gtttgcaaac cagcagctag cagtttgtcc agcctctaac 240 attgtccagc actttccaga gcaaactcac tgtttacaag aactcttggc cttacgaagt 300 ttataacctc aagctttgtt tatttaaaat attcctgcaa aagaaaagta cccggcaccc 360 actttccaaa atggccatgg atgagtattt gt。

33、ggatggtc attttgggtt tcatcatagc 420 tttcatcttg gccttttctg ttggtgcaaa cgatgttgcc aactcctttg gtacagccgt 480 gggctctggt gtggtgacct tgaggcaggc atgcatttta gcttcaatat ttgaaaccac 540 cggctccgtg ttactaggcg ccaaagtagg agaaaccatt cgcaaaggta tcattgacgt 600 gaacctgtac aacgagacgg tggagactct catggctggg gaagttagtg 。

34、ccatggttgg 660 ttccgctgtg tggcagctga ttgcttcctt cctgaggctt ccaatctcag gaacgcactg 720 cattgtgggt tctactatag gattctcact ggtcgcaatc ggtaccaaag gtgtgcagtg 780 gatggagctt gtcaagattg ttgcttcttg gtttatatct ccactgttgt ctggtttcat 840 gtctggcctg ctgtttgtac tcatcagaat tttcatctta aaaaaggaag accctgttcc 900 caatg。

35、gcctc cgggcactcc cagtattcta tgctgctacc atagcaatca atgtcttttc 960 catcatgtac acaggagcac cagtgctcgg ccttgttctc cccatgtggg ccatagccct 1020 catttccttt ggtgtcgccc tcctgttcgc tttttttgtg tggctcttcg tgtgtccgtg 1080 gatgcggagg aaaataacag gcaaattaca aaaagaaggt gctttatcac gagtatctga 1140 cgaaagcctc agtaaggttc 。

36、aggaagcaca gtccccagta tttaaagagc taccaggtgc 1200 caaggctaat gatgacagca ccatcccgct cacgggagca gcaggggaga cactggggac 1260 ctcggaaggc acttctgcgg gcagccaccc tcgggctgca tacggaagag cactgtccat 1320 gacccatggc tctgtgaaat cgcccatctc caacggcacc ttcggcttcg acggccacac 1380 caggagcgac ggtcatgtgt accacaccgt gcaca。

37、aagac tcggggctct acaaagatct 1440 gctgcacaaa atccacatcg acaggggccc cgaggagaag ccagcccagg aaagcaacta 1500 ccggctgctg cgccgaaaca acagttacac ctgctacacc gcagccattt gtgggctgcc 1560 agtgcacgcc acctttcgag ctgcggactc atcggcccca gaggacagtg agaagctggt 1620 gggcgacacc gtgtcctact ccaagaagag gctgcgctac gacagctact。

38、 cgagctactg 1680 序列表 1/27 页 13 CN 106834299 A 13 taacgcggtg gcagaggcgg agatcgaggc ggaggagggc ggcgtggaga tgaagctggc 1740 gtcggagctg gccgaccctg accagccgcg agaggaccct gcagaggagg agaaggagga 1800 gaaggacgca cccgaggttc acctcctgtt ccatttcctg caggtcctca ccgcctgttt 1860 cgggtccttt gctcacggcg gcaatgacgt gagta。

39、atgcc atcggtcccc tggtagcctt 1920 gtggctgatt tacaaacaag gcggggtaac gcaagaagca gctacacccg tctggctgct 1980 gttttatgga ggagttggaa tctgcacagg cctctgggtc tgggggagaa gagtgatcca 2040 gaccatgggg aaggacctca ctcccatcac gccgtccagc ggcttcacga tcgagctggc 2100 ctcagccttc acagtggtga tcgcctccaa catcgggctt ccagtcagca。

40、 ccacgcactg 2160 taaggtgggc tcggtggtgg ccgtgggctg gatccgctcc cgcaaggctg tggactggcg 2220 cctctttcgg aacatcttcg tggcctggtt cgtgaccgtc cctgtggctg ggctgttcag 2280 cgctgctgtc atggctcttc tcatgtatgg gatccttcca tatgtgtgag ctgtcatggc 2340 tcttctcatg tatgggatcc ttccatatgt gtgatttgtc ttcttccagc tgcaaacagc 2400。

41、 taaagggatg gtctggtgtt ggcgtgtggg agacatgtgt gctcgtgccg cacatacaca 2460 tcctggccgt gcacggctct ctcatgacca gctctctgcc tcccttccag gaggctccat 2520 cccacactgt tcacccaggc tgcggagact caccttcccg agctaactta actactgtac 2580 ataataatat gtattaaact ggtatcgtgg tgatataatg tggtgcagtt acttatatat 2640 taaatatcta ttgt。

42、atccat agaataggca gcattatttc aaacatattc aagttgggag 2700 tggagatcat tgcctagaag tcaatattca ataaatcttg tacataacta tttcgatggc 2760 aaatgttaag ccttctaaaa ggaaagtgta gattggaaaa tgattttttt tccaaatgat 2820 gtttttgcct tctaatatac tgtaaggtaa tgagcttcag aacaggcaac ctgaccctgc 2880 agaggtcgcg tgctgtggga tgacagcgg。

43、g acgggagctc acaagtgctt tcactgaaga 2940 tttgttcata tactgtgtat tgattgttgt gtaatatatc atcattgctt ttgtaaatac 3000 gtaaaactgt aattttttaa tggtgtgctt cccttatact tttttgatca gagaattttg 3060 gaaagtacca aagaagcagg ggaatcattg gccagtgtta cgttttcaca ttgtctgtct 3120 cccaccctca ctgatcacgc ctgccccaga gcagtgtgtg gcg。

44、gtgacac cgtcacccag 3180 catgcgccac gccgtggctc ccaccagcag tgccaccgcc accacacccc agatcccacc 3240 caccttgcag tggcctttcc ttgtcatcag agtagagaat gcacaggtgt tggtgagggc 3300 gtgtggctga gcactacatg tcaagtccag agtcagtttc tatcccaatt ctccctgcag 3360 cctgaagaac ggatccttgt ctccaatgtc agcacaaagg aggctttttc tgtgcttt。

45、ga 3420 cattctagca cttcagggat gagagggagg gagaatcctg gatgctggat ggagtatttc 3480 tctgaggccc acacaaagct ggacaccccc aggctctact ccatcccatt ggagtctctt 3540 ctttttttga tagcgggagg gaggaagtac gactaatgtt ggagcctgaa actatggaaa 3600 tgctgctaaa atttttatat tgacaaacat tttcttggta cttcattgtc atttttcatt 3660 aatcaacc。

46、at attaaattta taataaaaaa tgcccctcag aa 3702 2 3791 DNA 智人（Homo sapiens） 2 序列表 2/27 页 14 CN 106834299 A 14 gctcctgagg ctgccagcag ccagcagtga ctgcccgccc tatctgggac ccaggatcgc 60 tctgtgagca acttggagcc agagaggaga tcaacaagga ggaggagaga gccggcccct 120 cagccctgct gcccagcagc agcctgtgct cgccctgccc aacgcagaca。

47、 gccagaccca 180 gggcggcccc tctggcggct ctgctcctcc cgaaggatgc ttggggagtg aggcgaagct 240 gggccgctcc tctcccctac agcagccccc ttcctccatc cctctgttct cctgagcctt 300 caggagcctg caccagtcct gcctgtcctt ctactcagct gttacccact ctgggaccag 360 cagtctttct gataactggg agagggcagt aaggaggact tcctggaggg ggtgactgtc 420 cagagcctgg aactgtgccc acaccagaag ccatcagcag caaggacacc atacggcttc 480 cgggtgcgat gccagctctg gccctcaaag gcgagctgct gttgctgtct ctcctgttac 540 ttctggaacc acagatctct cagggcctgg tcgtcacacc cccggggcca gagcttgtcc 600 tcaatgtctc cagcaccttc gttctgacct gctcgggttc agctccggtg gtgtgggaac 660 ggatgtccca ggagccccca 。

摘要
申请专利号：	CN201710071474.9	申请日：	20170209
公开号：	CN106834299A	公开日：	20170613
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12N15/12,C12Q1/68	主分类号：	C12N15/12,C12Q1/68
申请人：	福建医科大学附属第一医院
发明人：	陈万金,王柠
地址：	350000 福建省福州市台江区茶中路20号
优先权：	CN201710071474A
专利代理机构：	厦门龙格专利事务所(普通合伙)	代理人：	钟毅虹
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内容摘要

本发明涉及人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法,人类特发性基底节钙化即IBGC是一种神经系统变性遗传病。本发明提供了SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个致病基因的7种突变形式，其序列如SEQ ID NO.1‑7所示。本发明提供的致病基因形式尚未被报道，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。同时本发明构建了致病基因检测方法：首先利用多重PCR捕获致病基因外显子区域，再对其进行二代测序、通过信息分析找出突变，最后利用Sanger测序对突变进行验证；其中PCR捕获引物组包含扩增引物序列SEQ ID NO.12‑23，Sanger测序片段的扩增引物序列如SEQ ID NO.24‑35所示。本发明检测方法覆盖了4个致病基因的全部外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。

权利要求书

1.人类特发性基底节钙化致病基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQIDNO.1-7中任一序列所示，共涉及SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因的7种突变形式。 2.根据权利要求1所述的人类特发性基底节钙化致病基因，其特征在于所述致病基因在制备人类特发性基底节钙化疾病诊断芯片、构建人类特发性基底节钙化疾病检测方法、研发人类特发性基底节钙化疾病治疗药物中的应用。 3.根据权利要求1所述的人类特发性基底节钙化致病基因,其特征在于致病基因检测方法的主要步骤如下:(1)4个致病基因的PCR捕获提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩增；(2)二代测序解析基因突变谱将(1)中的多重PCR扩增产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点；(3)突变位点的验证对于结果是所述SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因的7种突变形式之一的，则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现突变的，将根据情况设计引物将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况进行验证。 4.根据权利要求3所述的人类特发性基底节钙化致病基因检测方法,其特征在于步骤(1)中所述的PCR捕获引物组包含SEQIDNO.12-23这12条序列。 5.根据权利要求3所述的人类特发性基底节钙化致病基因检测方法，其特征在于所述7种突变形式对应的突变片段的扩增，具体是指对于SLC20A2基因的c.799G>C突变，扩增引物对为SEQIDNO.24-25；对于PDGFRB基因的c.3G>A和c.2209G>A突变，扩增引物对分别为SEQIDNO.26-27和SEQIDNO.28-29；对于PDGFB基因的c.220G>T和c.232C>T突变，扩增引物对分别为SEQIDNO.28-29和SEQIDNO.30-31；对于XPR1基因的c.490G>T和c.1708C>T突变，扩增引物对分别为SEQIDNO.32-33和SEQIDNO.34-35。

说明书

技术领域

本发明涉及基因及其检测方法，特别涉及人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法。

背景技术

人类特发性基底节钙化(Idiopathic Basal Gang1ia Calcification,IBGC)是一种以影像学上基底节及脑其它部位对称性钙化为特征的神经系统变性遗传病,也称Fahr病。钙化最常见的部位为基底节区豆状核，尤其是苍白球，也常见于壳核、丘脑、尾状核及小脑齿状核等部位，甚至出现在大脑皮层及皮层下白质。IBGC属罕见病，呈散发或家族性发病，家族性患者发病年龄逐代提前，进展缓慢、病程较长。该病无明显性别差异，表现为复杂多样的运动损害和行为症状的组合，同一家族中的不同成员之间临床症状往往存在差异。临床表现以神经、精神功能紊乱为主，轻者仅仅为轻度注意力或记忆力的下降，重者则会出现人格及行为改变，终致精神病或痴呆。

IBGC有家族性发病的现象，常染色体显性遗传和隐性遗传的病例均有报道，以常染色体显性遗传居多。遗传性IBGC相关致病基因和发病机制长期以来并未得到解析，直到2012年Liu等人在IBGC3基因位点中，通过连锁分析、单倍体分析、Sanger测序等成功克隆特发性基底节钙化的致病基因SLC20A2，并且在不同种族中得到验证；此后，PDGFRB、PDGFB和XPR1这三个致病基因陆续被发现和得到验证。其中，SLC20A2基因编码的蛋白为钠-磷共转运体(PiT2)，参与机体的钙磷调节；PDGFRB基因编码血小板衍生生长因子受体PDGFRβ，属于III型受体酪氨酸激酶家族；PDGFB基因则编码血小板衍生生长因子PDGF-B，与PDGFBβ结合可激活下游信号通路，参与细胞的增殖、分化、生存以及迁移；XPR1基因编码的蛋白含有SPX结构域，主要参与磷稳态的维持，具有Pi输出功能。

为了系统解析IBGC致病基因突变，本发明设计和合成了覆盖4个已知致病基因的PCR捕获引物组，并结合二代测序技术对10个IBGC患者样本进行捕获测序，共分析得出了1种SLC20A2基因突变、2种PDGFRB基因突变、2种PDGFB基因突变和2种XPR1基因突变，所发现的突变均经Sanger测序确证；之后针对各自的致病基因突变，利用Sanger测序分析对应的家系中其它成员的样本，全部符合基因型-表型共分离规律从而致病基因突变得到了验证。进一步的，采用同样的方法在另外12个IBGC患者和200个正常人样本中进行了验证。本发明提供的IBGC致病基因突变尚未见报道，其对于该病的解析、筛查、检测和治疗具有潜在的重要价值。此外，本发明基于PCR捕获结合二代测序(简称PCR捕获测序)构建的IBGC致病基因检测方法，可以同时全面解析4种IBGC致病基因突变谱，具有通量高、灵敏度高、可解析未知突变的优点。目前，国内外均没有该方法在IBGC致病基因SLC20A2，PDGFRB，PDGFB，XPR1突变同时检测方面应用的报道。由于单次反应测序长度的限制(1000bp以内)，传统的基于Sanger测序的方法进行的全面解析，费用高昂且费时费力。而基于实时荧光定量PCR的突变检测方法，则只能针对少量已知的突变。

发明内容

本发明提供了IBGC相关的4个致病基因的7种突变基因形式，同时提供了基于PCR捕获测序的检测方法；这些可以为IBGC致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供了IBGC的7种致病基因形式，包括1种SLC20A2突变基因，其序列如SEQ ID NO.1所示；2种PDGFRB突变基因，其序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；2种PDGFB突变基因，其序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；和2种XPR1突变基因，其序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

所述涉及SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因共7种突变基因类型经检测和验证，均为IBGC致病基因。其中，SLC20A2突变基因的突变位点在Exon7中，具体是野生型基因第799位的G突变为C；PDGFRB突变基因的突变位点其一在Exon 2中，具体是野生型基因第3位的G突变为A,其二在Exon16中，具体是野生型基因第2209位的G突变为A；PDGFB突变基因的突变位点其一在Exon3中，具体是野生型基因第220位的G突变为T，其二也在Exon3中，具体是野生型基因第232位的C突变为T；XPR1突变基因的突变位点其一在Exon 5中，具体是野生型基因第490位的G突变为T，其二在Exon13中，具体是野生型基因第1708位的C突变为T。由于突变发生在外显子区，因此本发明提供的SEQ ID NO.1-7为编码区序列。另外，提供的SEQ ID NO.8-11分别是SLC20A2，PDGFRB，PDGFB，XPR1的野生型基因的编码区序列，供参比。

本发明提供的基于PCR捕获测序的IBGC致病基因检测方法(参见图1)包括如下主要步骤：

(1)4个致病基因的PCR捕获

提取待测样本基因组DNA，利用设计合成的PCR捕获引物组进行扩增；

(2)二代测序解析基因突变谱

将(1)中的多重PCR扩增产物进行二代测序，并通过信息分析找出突变位点；

(3)突变位点的验证

对于结果是已知突变的，则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证；对于结果是新发现突变的，则根据情况设计引物将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证后，再通过Sanger测序分析患者家系相关成员样本的基因型-表型共分离情况进行验证。

其中，(1)中所述PCR捕获引物组是利用美国Thermo Fisher公司的在线软件Ion AmpliSeq Designer进行设计的，至少应该捕获所述所有7种突变形式其突变位点所在区域，结果显示至少需要SEQ ID NO.12-23这12条序列。优选地，可以针对SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1这4个基因所有外显子及其侧翼序列，使得目标基因覆盖率达100％，结果共获得了69对引物，其序列如表1所示。

表1 PCR捕获扩增引物组

其中，(1)中进行的多重PCR扩增体系(20ul)如表2所示。5X Ion AmpliSeqTMHiFi Mix、2X Ion AmpliSeqTM引物组和20X Ion AmpliSeqTMSample ID Panel均购置于美国Thermo Fisher公司。

表2 PCR捕获扩增体系

成分添加量(ul) 5X Ion AmpliSeqTMHiFi Mix 4 2X Ion AmpliSeqTM引物组 10 20X Ion AmpliSeqTMSample ID Panel 1 浓度>20ng/ul的样本基因组DNA 0.5 灭菌的Nuclease-free Water 4.5

其中，(1)中所述的多重PCR扩增阶段和条件如表3所示：

表3 PCR捕获扩增阶段和条件

其中，(2)中所述的PCR扩增捕获产物进行的二代测序和信息分析，有二代测序仪和配套分析软件则按照规范操作和分析进行，或可由商业化的高通量测序公司完成，最终需得到所检测样本的致病基因突变信息。

其中，(3)中所述的已知突变指的是前述的7种突变形式(可详见表4)，所述新发现突变指的是这7种已发现突变外的其它突变形式。所述的原样本是指(1)中提取的待测样本基因组，除用于PCR捕获测序模板外剩余的部分；或者原检测样本再次提取的基因组DNA。所述突变包括点突变、插入或缺失，但不限于此。

其中，(3)中所述对于已知突变则将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证，是指利用特定的引物对扩增突变片段并进行Sanger测序，验证是否同二代测序检出的突变结果一致；有Sanger测序仪则按规范操作进行测序或可送商业化测序公司完成，最终需得到对应的扩增子序列。所述原样本突变片段扩增是指，对于SLC20A2基因的c.799G>C突变，扩增引物对为SEQ ID NO.24-25；对于PDGFRB基因的c.3G>A和c.2209G>A突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.26-27和SEQ ID NO.28-29；对于PDGFB基因的c.220G>T和c.232C>T突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.28-29和SEQ ID NO.30-31；对于XPR1基因的c.490G>T和c.1708C>T突变，扩增引物对分别为SEQ ID NO.32-33和SEQ ID NO.34-35。

其中，(3)中所述的患者家系相关成员必须包括IBGC患者和非IBGC患者。所述基因型-表型共分离是指基因型决定表型，由此两者符合共同对应的遗传学传递现象和规律。

本发明提供的IBGC相关4个致病基因的7种突变基因类型，可以为该病致病机理的解析和药物开发、致病基因筛查和检测以及治疗方案的制定等提供依据和奠定基础；此外本发明提供的基于PCR捕获测序的致病基因检测方法，覆盖了4个致病基因的全部外显子，可以高效全面、快速准确地获取突变信息。

附图说明

图1是本发明IBGC致病基因检测方法流程图。

图2-8是各种基因突变形式的Sanger测序验证图谱突变位点局部。其中图2对应于实施例1中的1号患者，为SLC20A2基因的c.799G>C突变，2号、3号和4号患者的图谱与其类似；图3、图4、图5、图6、图7、和图8分别对应于实施例1中的5、6、7、8、9和10号患者，分别为PDGFRB的c.3G>A、PDGFRB的c.2209G>A、PDGFB的c.220G>T、PDGFB的c.232C>T、XPR1的c.490G>T和XPR1的c.1708C>T；各图中的序列位点数字只代表对应扩增子，并不代表突变位点在实际基因中的位置。

图9是实施例1中1号IBGC患者颅脑CT平扫影像。

图10是实施例1中1号IBGC患者所在家系的遗传图谱。此图中正方形表示男性，圆形表示女性；箭头表示先证者，带斜线表示死亡，带问号表示未行颅脑CT检查个体；实心表示IBGC患病个体，空心表示正常个体；“+”表示SLC20A2基因检出c.799G>C突变，“-”表示SLC20A2基因未检出c.799G>C突变；I、II和III分别代表第1、2和3代，数字为成员编号。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

根据详细的病史和家族史调查情况以及规范的神经系统体格检查和相关辅助检查信息，选择所在医院10名IBGC患者在其签署了知情同意书的情况下，进行致病基因检测和分析。

(1)4个致病基因的PCR捕获

取患者肘静脉血10ml(EDTA抗凝)，用QIAamp DNA Blood Mini Ki t(德国Qiagen公司)提取基因组DNA，以其为模板采用表1的PCR捕获引物组按照表2配制扩增体系，并在常规PCR仪上按照表3条件进行反应。

(2)二代测序解析基因突变谱

将(1)中的多重PCR扩增产物送上海晶能生物技术有限公司进行二代测序，采用的是Ion PGM Template OT2 200试剂盒进行乳液PCR，Dynabeads MyOne Streptavidin C1磁珠进行阳性模板富集；以上两步反应均在Ion One Touch系统上进行。建库后采用Ion PGM Sequencing kit及Ion Torrent 316v2芯片，在PGM测序仪上进行测序反应。采用PGM服务器自带分析软件对测序结果初步分析，再用千人基因组数据库、SNP数据库和COSMIC(version 64)数据库等进行突变位点解析，结果如表4所示，共计有7种突变。

表4 10例IBGC患者致病基因检测及验证结果

(3)突变位点的验证

根据所检出的突变，利用前述特定引物对将原样本突变片段扩增后直接进行Sanger测序验证。采用Takara的rTaq聚合酶扩增，其扩增体系详见表5，扩增引物对详见表6，PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序。Sanger测序结果发现均与二代测序结果一致(表4)。

表5扩增体系

编号组份添加量 1 10X PCR buffer(Mg+) 2.5ul 2 dNTP Mix 0.5ul 3 Primer(50uM)F 0.25ul 4 Primer(50uM)R 0.25ul 5 rTaq 0.25ul 6 Template DNA(30ng/ul) 1ul 7 灭菌ddH2O 20ul

表6扩增引物对

扩增条件为：94℃预变性3min；30个循环：94℃变性30s，60℃/65℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终延伸5min。

由于这7种突变均未被报道，因此收集这10例IBGC患者家系相关成员样本，再通过Sanger测序突变片段。以S1号患者为例，如图9所示其为家系先证者III4，无明显症状，颅脑CT平扫示双侧苍白球及小脑齿状核对称性大面积钙化。根据PGM数据可知，其SLC20A2基因第799位的G突变为C；利用引物对SEQ ID NO.24-25扩增SLC20A2基因c.799G>C突变片段，其直接Sanger测序结果(如图2所示)，与二代测序结果一致。收集该家系中的其他成员资料，能获得该家系6个阳性成员，4个阴性成员的影像资料(如图10中所示)：即先证者III4、II1、II3、II8、III2及III7的颅脑CT平扫均显示双侧基底节区及小脑存在大片钙化灶，II2、III1、III5、III6颅内均无钙化灶。采集这10个家系成员的血液样本提取基因组DNA，利用引物对SEQ ID NO.24-25扩增SLC20A2基因c.799G>C突变片段，Sanger测序显示6个阳性患者均存在该突变位点，而4个阴性成员均无该位点突变，即出现了基因型-表型的家系共分离现象，由此证明了SLC20A2基因的c.799G>C突变是该家系的致病性突变。表4中其余9例患者，经过同样的分析均出现家系共分离现象(表4)。因此，通过本实施例获得了7种IBGC的致病基因，其序列对应信息详见表4。

(4)致病基因制备和获取

基于本发明新鉴定的IBGC的7种致病基因，为了开展致病机理机制、筛查检测方法和试剂盒开发、治疗药物研发等科研生产工作需要，申请人将突变所在的扩增子进行纯化，将其克隆到商业化质粒等载体中，之后将其导入大肠杆菌等宿主菌中，置于-80℃冰箱中保存。另一方面，由于本发明对于致病基因序列的公布，可以采用定点突变的方式由野生型基因制备得到，或通过序列合成的方式获取。

实施例2

另取与实施例1中不同的IBGC患者12例以及200例正常人血样进行分析，方法同实施例2，其结果如表7所示。

表7 12例IBGC患者致病基因检测及验证结果

对于表5中IBGC患者的突变均经过Sanger测序验证了，所有突变基因均属于所述7种基因突变形式；而在200例正常人中，均不存在所述的突变，从而从正反两方面再次验证了本发明提供的IBGC致病基因，以及本发明提供的检测方法具有良好的可靠性和准确性。

虽然本发明是通过优选的具体实施例进行说明，但是对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人福建医科大学附属第一医院

<120> 发明名称人类特发性基底节钙化致病基因及其检测方法

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3702

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

cgcttccgga agcgggcgac tcgcagctcc acgcgacgcc gaggggctcc gcgccgggac 60

cgggcgggtg ctcggagttt cggggaccgc acgggaccga gggcaggagg agacatcaca 120

gctttcccag atcgggagga aaaatatgga atgtgtttta ccgctgactg aacacaacca 180

aatgaactgt cctgacagta gtttgcaaac cagcagctag cagtttgtcc agcctctaac 240

attgtccagc actttccaga gcaaactcac tgtttacaag aactcttggc cttacgaagt 300

ttataacctc aagctttgtt tatttaaaat attcctgcaa aagaaaagta cccggcaccc 360

actttccaaa atggccatgg atgagtattt gtggatggtc attttgggtt tcatcatagc 420

tttcatcttg gccttttctg ttggtgcaaa cgatgttgcc aactcctttg gtacagccgt 480

gggctctggt gtggtgacct tgaggcaggc atgcatttta gcttcaatat ttgaaaccac 540

cggctccgtg ttactaggcg ccaaagtagg agaaaccatt cgcaaaggta tcattgacgt 600

gaacctgtac aacgagacgg tggagactct catggctggg gaagttagtg ccatggttgg 660

ttccgctgtg tggcagctga ttgcttcctt cctgaggctt ccaatctcag gaacgcactg 720

cattgtgggt tctactatag gattctcact ggtcgcaatc ggtaccaaag gtgtgcagtg 780

gatggagctt gtcaagattg ttgcttcttg gtttatatct ccactgttgt ctggtttcat 840

gtctggcctg ctgtttgtac tcatcagaat tttcatctta aaaaaggaag accctgttcc 900

caatggcctc cgggcactcc cagtattcta tgctgctacc atagcaatca atgtcttttc 960

catcatgtac acaggagcac cagtgctcgg ccttgttctc cccatgtggg ccatagccct 1020

catttccttt ggtgtcgccc tcctgttcgc tttttttgtg tggctcttcg tgtgtccgtg 1080

gatgcggagg aaaataacag gcaaattaca aaaagaaggt gctttatcac gagtatctga 1140

cgaaagcctc agtaaggttc aggaagcaca gtccccagta tttaaagagc taccaggtgc 1200

caaggctaat gatgacagca ccatcccgct cacgggagca gcaggggaga cactggggac 1260

ctcggaaggc acttctgcgg gcagccaccc tcgggctgca tacggaagag cactgtccat 1320

gacccatggc tctgtgaaat cgcccatctc caacggcacc ttcggcttcg acggccacac 1380

caggagcgac ggtcatgtgt accacaccgt gcacaaagac tcggggctct acaaagatct 1440

gctgcacaaa atccacatcg acaggggccc cgaggagaag ccagcccagg aaagcaacta 1500

ccggctgctg cgccgaaaca acagttacac ctgctacacc gcagccattt gtgggctgcc 1560

agtgcacgcc acctttcgag ctgcggactc atcggcccca gaggacagtg agaagctggt 1620

gggcgacacc gtgtcctact ccaagaagag gctgcgctac gacagctact cgagctactg 1680

taacgcggtg gcagaggcgg agatcgaggc ggaggagggc ggcgtggaga tgaagctggc 1740

gtcggagctg gccgaccctg accagccgcg agaggaccct gcagaggagg agaaggagga 1800

gaaggacgca cccgaggttc acctcctgtt ccatttcctg caggtcctca ccgcctgttt 1860

cgggtccttt gctcacggcg gcaatgacgt gagtaatgcc atcggtcccc tggtagcctt 1920

gtggctgatt tacaaacaag gcggggtaac gcaagaagca gctacacccg tctggctgct 1980

gttttatgga ggagttggaa tctgcacagg cctctgggtc tgggggagaa gagtgatcca 2040

gaccatgggg aaggacctca ctcccatcac gccgtccagc ggcttcacga tcgagctggc 2100

ctcagccttc acagtggtga tcgcctccaa catcgggctt ccagtcagca ccacgcactg 2160

taaggtgggc tcggtggtgg ccgtgggctg gatccgctcc cgcaaggctg tggactggcg 2220

cctctttcgg aacatcttcg tggcctggtt cgtgaccgtc cctgtggctg ggctgttcag 2280

cgctgctgtc atggctcttc tcatgtatgg gatccttcca tatgtgtgag ctgtcatggc 2340

tcttctcatg tatgggatcc ttccatatgt gtgatttgtc ttcttccagc tgcaaacagc 2400

taaagggatg gtctggtgtt ggcgtgtggg agacatgtgt gctcgtgccg cacatacaca 2460

tcctggccgt gcacggctct ctcatgacca gctctctgcc tcccttccag gaggctccat 2520

cccacactgt tcacccaggc tgcggagact caccttcccg agctaactta actactgtac 2580

ataataatat gtattaaact ggtatcgtgg tgatataatg tggtgcagtt acttatatat 2640

taaatatcta ttgtatccat agaataggca gcattatttc aaacatattc aagttgggag 2700

tggagatcat tgcctagaag tcaatattca ataaatcttg tacataacta tttcgatggc 2760

aaatgttaag ccttctaaaa ggaaagtgta gattggaaaa tgattttttt tccaaatgat 2820

gtttttgcct tctaatatac tgtaaggtaa tgagcttcag aacaggcaac ctgaccctgc 2880

agaggtcgcg tgctgtggga tgacagcggg acgggagctc acaagtgctt tcactgaaga 2940

tttgttcata tactgtgtat tgattgttgt gtaatatatc atcattgctt ttgtaaatac 3000

gtaaaactgt aattttttaa tggtgtgctt cccttatact tttttgatca gagaattttg 3060

gaaagtacca aagaagcagg ggaatcattg gccagtgtta cgttttcaca ttgtctgtct 3120

cccaccctca ctgatcacgc ctgccccaga gcagtgtgtg gcggtgacac cgtcacccag 3180

catgcgccac gccgtggctc ccaccagcag tgccaccgcc accacacccc agatcccacc 3240

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gtgtggctga gcactacatg tcaagtccag agtcagtttc tatcccaatt ctccctgcag 3360

cctgaagaac ggatccttgt ctccaatgtc agcacaaagg aggctttttc tgtgctttga 3420

cattctagca cttcagggat gagagggagg gagaatcctg gatgctggat ggagtatttc 3480

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ctttttttga tagcgggagg gaggaagtac gactaatgtt ggagcctgaa actatggaaa 3600

tgctgctaaa atttttatat tgacaaacat tttcttggta cttcattgtc atttttcatt 3660

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<210> 2

<211> 3791

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

gctcctgagg ctgccagcag ccagcagtga ctgcccgccc tatctgggac ccaggatcgc 60

tctgtgagca acttggagcc agagaggaga tcaacaagga ggaggagaga gccggcccct 120

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gggcggcccc tctggcggct ctgctcctcc cgaaggatgc ttggggagtg aggcgaagct 240

gggccgctcc tctcccctac agcagccccc ttcctccatc cctctgttct cctgagcctt 300

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cagtctttct gataactggg agagggcagt aaggaggact tcctggaggg ggtgactgtc 420

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cgggtgcgat gccagctctg gccctcaaag gcgagctgct gttgctgtct ctcctgttac 540

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actatgtcta cagactccag gtgtcatcca tcaacgtctc tgtgaacgca gtgcagactg 1140

tggtccgcca gggtgagaac atcaccctca tgtgcattgt gatcgggaat gaggtggtca 1200

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tcctcttgga tatgccttac cacatccgct ccatcctgca catccccagt gccgagttag 1320

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aaatcgccct gtccacgcgc aacgtgtcgg agacccggta tgtgtcagag ctgacactgg 1620

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tgtcggtgcg ctgcacgctg cgcaacgctg tgggccagga cacgcaggag gtcatcgtgg 2040

tgccacactc cttgcccttt aaggtggtgg tgatctcagc catcctggcc ctggtggtgc 2100

tcaccatcat ctcccttatc atcctcatca tgctttggca gaagaagcca cgttacgaga 2160

tccgatggaa ggtgattgag tctgtgagct ctgacggcca tgagtacatc tacgtggacc 2220

ccatgcagct gccctatgac tccacgtggg agctgccgcg ggaccagctt gtgctgggac 2280

gcaccctcgg ctctggggcc tttgggcagg tggtggaggc cacggctcat ggcctgagcc 2340

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agaagcaagc ccttatgtcg gagctgaaga tcatgagtca ccttgggccc cacctgaacg 2460

tggtcaacct gttgggggcc tgcaccaaag gaggacccat ctatatcatc actgagtact 2520

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actccgacaa gcgccgcccg cccagcgcgg agctctacag caatgctctg cccgttgggc 2640

tccccctgcc cagccatgtg tccttgaccg gggagagcga cggtggctac atggacatga 2700

gcaaggacga gtcggtggac tatgtgccca tgctggacat gaaaggagac gtcaaatatg 2760

cagacatcga gtcctccaac tacatggccc cttacgataa ctacgttccc tctgcccctg 2820

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acccagagct gcccatgaac gagcagttct acaatgccat caaacggggt taccgcatgg 3240

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ccagctccgt cctctatact gccgtgcagc ccaatgaggg tgacaacgac tatatcatcc 3540

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cagccctgct gcccagcagc agcctgtgct cgccctgccc aacgcagaca gccagaccca 180

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gggccgctcc tctcccctac agcagccccc ttcctccatc cctctgttct cctgagcctt 300

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cagagcctgg aactgtgccc acaccagaag ccatcagcag caaggacacc atgcggcttc 480