技术领域
本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的试剂盒及方法。
背景技术
近年来，随着亚胺培南等碳青酶烯类抗生素在临床上的广泛应用，细菌产生了一类能广泛水解β-内酰胺类抗生素的金属β-内酰胺酶， 产该类酶的细菌对β-内酰胺类所有抗生素产生耐药性，给临床抗感染治疗造成极大困难，而且目前产金属β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌种类和数量在不断增加，已报道的主要有IMP 和VIM 两种类型。而在广东广州，2005～2007年多家医院曾出现产IMP金属酶铜绿假单胞菌的爆发流行，己成为临床医师面临的棘手问题。因此，及时有效的监控由IMP引起的耐亚胺培南铜绿假单胞菌医院感染势在必行。
而传统的微生物培养法和药敏试验法能在临床上提供较好的价值，但因耗时长、繁琐的操作过程、需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。而本研究针对IMP设计的特异性扩增引物不单可以有效特异地扩增IMP，从而建立起一种简便、快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的LAMP试剂盒、以及一种用环介导等温基因扩增技术（LAMP技术）快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的LAMP引物组，其包括一对内引物、一对外引物和一对环引物，核苷酸序列分别如下所示：
内引物1：5’- TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’- GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’- TTCCATAGCGACAGCACG -3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3’（SEQ ID No.4）；
环引物1：5’- GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’（SEQ ID No.5）；
环引物2：5’- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3’（SEQ ID No.6）。
一种用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的LAMP试剂盒，其包括上述用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的LAMP引物组。
作为优选的，所述引物组中，内引物、外引物、环引物的摩尔比为6-8：1：3-4。
作为优选的，所述试剂盒中还含有： DNA聚合酶，LAMP反应液，显色剂，阳性对照和阴性对照。
作为优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
作为优选的，所述LAMP反应液含有：10 mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150 mM MgSO4水溶液、5 mM 甜菜碱，四者的体积比为6-8：4-5：2-3：8-10。
作为优选的，所述显色剂为SYBR GREENⅠ。
作为优选的，所述阳性对照为含有细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP片段的质粒，所述细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP片段如SEQ ID NO.7所示；所述阴性对照为DEPC水。
一种快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的方法，包括如下步骤：
（1）提取待检样品DNA；
（2）利用上述用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP的LAMP引物组对待检样品DNA进行等温扩增；
（3）结果判断：在上述反应管中加入1-2μL显色剂10×SYBR GREENⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为IMP金属β-内酰胺酶耐药基因，橙色则为非IMP基因。
作为优选的，等温基因扩增反应的25μL反应体系含有：内引物各8pmol/μL，外引物各1 pmol/μL，环引物各4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检DNA 1-100 ng，用灭菌去离子水补齐到25μL；等温基因扩增反应的条件为：60-65℃反应55-65min。
本发明的有益效果是：发明针对细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP特异性设计了6条引物，与目的基因的6个区域结合，具有较高的特异性，能准确地将细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP与其他非细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP区分开来。另外，本发明的试剂盒方便快捷，能在较短的时间内鉴别细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP，不需要昂贵的仪器设备；灵敏度高；特异性好，适合现场检测。
附图说明
图1为本发明对细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 以及对非细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 的扩增结果（－：阴性样品，+：细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 样本）；
图2为实施例3的特异性验证结果（1:DEPC，2:CTX-M-1，3:PME，4: SME，5: CMY-2，6:TEM，7: IMP，8: VIM and CMY-2）；
图3为实施例4的LAMP灵敏度实验结果（a：:本发明LAMP扩增的电泳结果；b:本发明LAMP扩增的显色结果；其中，1为DEPC，2～9为含有细菌属β-内酰胺酶耐药基因IMP的pBCSK质粒，浓度依次为1.0×100 、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107拷贝/μL）。
图4为实施例4的常规PCR灵敏度实验结果（其中，1为DEPC，2～9含有细菌属β-内酰胺酶耐药基因IMP的pBCSK质粒，浓度依次为1.0×100 、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107拷贝/μL）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 的LAMP试剂盒的建立
用于快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 的LAMP试剂盒，包括以下成分：（1）特异性引物组；（2）DNA聚合酶；（3）LAMP反应液；（4）显色剂；（5）阳性对照和阴性对照。
（1）特异性引物的设计：
根据细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP（GenBank登录号为：（NF812058）的特异性设计6条特异性引物，序列分别如下：
内引物1：5’- TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3’（SEQ ID No.1）；
内引物2：5’- GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3’（SEQ ID No.2）；
外引物1：5’- TTCCATAGCGACAGCACG -3’（SEQ ID No.3）；
外引物2：5’- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3’（SEQ ID No.4）；
环引物1：5’- GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’（SEQ ID No.5）；
环引物2：5’- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3’（SEQ ID No.6）。
（2）DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；
（3）LAMP反应液含有：10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4、5mM 甜菜碱，四者的体积比为8：5：3：10。
（4）显示剂为SYBR GREENⅠ。
（5）阳性对照为含有细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP片段（SEQ ID NO.7）的pBCSK质粒（利用常规的质粒构建方法将SEQ ID NO.7插入pBCSK质粒中得到）；阴性对照为DEPC水。
实施例2细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 的快速检测方法
利用实施例1的试剂盒快速检测细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP，具体步骤如下：
（1）提取模板DNA：采用水煮法提取细菌基因组DNA；
（2）环介导等温基因扩增反应：25μL反应体系含有：内引物1、2终浓度各为8 pmol/μL，外引物1、2终浓度各为1 pmol/μL，环引物1、2终浓度各为4 pmol/μL，反应液 12.5μL，DNA聚合酶8U，待检DNA 50 ng，用灭菌去离子水补齐到25μL，然后加入20μL的密封液，将上述反应管于63℃反应60min；
（3）结果判断：在上述反应管中加入1μL显色剂1×SYBR GreenⅠ，混匀后观察反应液的颜色，若呈现绿色则为细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP，橙色则为非细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP（如图1）。
实施例3 特异性实验
利用实施例2的方法分别对经鉴定不含IMP基因的临床分离株进行检测，DEPC水为阴性对照。
检测结果见图2。仅细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP管为绿色，其余管为橙色。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地将IMP及其他非IMP区分开来。
实施例4 灵敏度实验
取阳性对照品（即构建好的含有细菌金属β-内酰胺酶耐药基因IMP 片段（SEQ ID NO.7）的pBCSK质粒），测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×100～1.0×107拷贝/μL的浓度作为样品进行实验。分别用本发明的检测方法和常规PCR方法进行检测。
常规PCR检测方法所用的引物序列如下所示：
blaIMP-F： CGCGGATCCATGAGCAAGTTATTTGTATT （SEQ ID NO.8）
blaIMP-R： CCGGAATTCTTAATGTGCAGTGGTACTT （SEQ ID NO.9）
本发明试剂盒的检测结果如图3所示，结果表明，本试剂盒对IMP基因的最低检出限为： 1.0×104 拷贝/μL。
常规PCR方法的检测结果如图4所示。其最低检出限为：1.0×105 拷贝/μL。
以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高的特点，且不需要昂贵的仪器设备，适合现场检测。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
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