技术领域
本发明涉及细胞分离培养领域，尤其是一种绵羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法。
背景技术
目前许多瘤胃上皮细胞体外培养试验中遇到了细胞贴壁所需时间长、生长缓慢等问题，说明这些方法用于瘤胃上皮分离培养的效果不佳，改进和优化瘤胃上皮细胞体外培养技术有助于深入了解瘤胃上皮代谢在营养调控和上皮屏障受损方面的作用。
发明内容
本发明的目的在于优化瘤胃上皮细胞分离培养技术，从而获得活性高、易贴壁、形态好、增殖迅速的瘤胃上皮细胞。
本发明的技术方案为：一种绵羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，其步骤：
A 获取瘤胃组织，将瘤胃内容物冲洗干净；B 钝性分离并清洗瘤胃上皮组织；
C 将上皮组织剪碎，用I型胶原酶和胰蛋白酶进行处理；D 机械分离法辅助性吹散细胞，收集细胞悬液；E 重复胰蛋白酶消化处理直至组织块消失，收集细胞悬液；F 细胞悬液进行过滤，离心收集细胞；G 去除上层液体，用完全培养基重悬细胞后，接种于培养瓶中培养；H 换瓶培养以去除大部分成纤维细胞；I 24 h后换培养基，2～3 d后完成铺层，即培养所得细胞为瘤胃上皮细胞；J 铺层至80%～90%时，用胰蛋白酶消化后可进行传代或者液氮冻存。
步骤A中先用生理盐水将内容物冲洗干净，然后用含6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液冲洗7～8次；
步骤B中钝性分离用分离工具小心地剔除血管及粘附的肌层细胞，再用含6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液冲洗2～3次；
步骤C中将上皮组织剪碎至约1 mm3大小，使组织块可通过玻璃弯头滴管，用0.2 mg/ml I型胶原酶消化30 min，再用2.5 mg/ml胰蛋白酶+0.5 mg/ml 乙二胺四乙酸进行消化5 min；
步骤D中操作需在液面下进行， 收集完悬液需用Hank’s缓冲液漂洗剩余组织沉淀一次；
步骤E中胰蛋白酶消化5 min/次，按照步骤D的方法收集悬液；
步骤F中用无菌纱布过滤或直接沉淀取上清悬液，离心条件转速为800～1000 rpm，时间为4～5 min；
步骤G培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中培养；
步骤H中换瓶时间为接种后30 min，换瓶后30 min再次换瓶培养；
步骤I中细胞传代培养使用2.5 mg/ml胰蛋白酶消化时间为5～8 min。
所得的瘤胃上皮细胞可应用于瘤胃上皮细胞在代谢中作用或瘤胃保护方面的研究。
本发明的优点在于：本发明对瘤胃上皮细胞分离培养进行改进，通过此方法能有效获得活力高、贴壁早、生长快的瘤胃上皮细胞。普通消化分离方法所得的细胞接种后3～6 d开始贴壁，8～10 d完成铺层，而通过所述的消化分离方法所得的细胞在12～24 h开始贴壁，2～3 d完成铺层。
附图说明
图1为普通分离方法培养的绵羊瘤胃上皮细胞；
图2为所述分离方法培养的绵羊瘤胃上皮细胞。
具体实施方式
绵羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法：
（1）组织获取：无菌条件下，将绵羊颈动脉放血处死，迅速解剖后剪取瘤胃组织。
（2）清洗：先用生理盐水多次冲洗，去除瘤胃内容物，再用6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液冲洗7～8次，能有效去除残留的细菌和真菌。
（3）分离：用剪刀、镊子、手术刀等分离，分离过程在Hank’s液中进行，分离得到的上皮组织用6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液冲洗2～3次，再用Hank’s液清洗2～3次。
（4）消化：将瘤胃上皮组织转移至青霉素瓶中，剪碎至1 mm3大小，Hank’s液漂洗1次，沉淀约60 s，去上清后加入约5倍体积的0.2 mg/ml的I型胶原酶在37 ℃水浴锅中进行温浴处理30 min，若中途胶原酶溶液颜色变黄，可进行更换，水浴时需不定时轻微摇晃。30 min后弃I型胶原酶溶液，加入约3倍体积的2.5 mg/ml的胰蛋白酶在37 ℃水浴锅中进行温浴处理5 min，并轻微摇晃。5 min后用弯头玻璃滴管在液面下反复吹打，充分分散细胞，然后将细胞悬液转移到完全培养基中。剩余的组织沉淀用Hank’s液漂洗1次，重复胰蛋白酶消化步骤，每5 min/次收集细胞悬液，并转移至完全培养基中，重复消化处理可直至组织块完全消化。
（5）过滤：将消化获得的细胞悬液用无菌纱布过滤或直接沉淀取上层细胞悬液，收集滤液于离心机中800～1000 rpm离心4～5min。
（6）接种：用完全培养基重悬细胞，调整密度接种于5%CO2、37 ℃的培养箱中培养，原代培养的接种密度应高于传代培养的细胞接种密度。
（6）换瓶：培养30 min后，轻轻吸取上层悬液于另一培养瓶中继续培养，换瓶培养重复2～3次可有效清除成纤维细胞。
（7）换液：换瓶培养24 h后，更换新的完全培养基继续培养。
在光学显微镜下观察细胞生长情况，普通方法处理和所述方法处理的瘤胃上皮细胞生长情况见图1和图2。
普通瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞3～6 d开始贴壁，所述瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞12～24 h开始贴壁，说明所述方法能有效缩短细胞接种后生长调整期；普通瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞铺层时间较长，8～10 d完成铺层，或出现生长停滞，且细胞形态不均一，呈多角状、扁平状或长梭型，所述瘤胃上皮细胞分离方法所得的细胞2～3 d完成铺层，形态均一，呈铺路石样，说明所述方法能有效降低消化处理对细胞的损伤，保证细胞后期能迅速增殖。
一种绵羊瘤胃上皮细胞的分离培养方法，具体步骤如下：
（1）将一月龄内绵羊颈动脉放血处死，迅速解剖后剪取瘤胃组织。
（2）先用生理盐水将内容物冲洗干净，再用含6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液冲洗7～8次，用4 ℃预冷的完全培养将瘤胃组织带回超净工作台中。
（3）在Hank’s缓冲液中用分离工具钝性分离瘤胃上皮，小心地剔除血管及粘附的肌层细胞，收集上皮组织块，用6倍青链霉素+两性霉素的PBS缓冲液洗涤2～3次后，再用Hank’s缓冲液液清洗2～3次。
（4）将上皮组织转移至青霉素瓶中，剪碎至约1 mm3大小，加Hank’s缓冲液漂洗后沉淀30～60 s，弃上清。
（5）加入约5倍体积的0.2 mg/ml I型胶原酶在37 ℃水浴锅中进行温浴处理30 min，水浴时需不定时轻微摇晃。
（6）弃I型胶原酶溶液，加入约3倍体积的2.5 mg/ml胰蛋白酶（含有0.5 mg/ml 乙二胺四乙酸，EDTA）在37 ℃水浴锅中进行温浴处理5 min，并轻微摇晃。
（7）用吹管在液面下充分吹打组织团块，然后将悬液转移至完全培养基中终止消化，然后将剩余的组织用Hank’s液漂洗一次。
（8）重复胰蛋白酶消化步骤，5 min/次收集细胞悬液然后终止消化，直至组织块全部消化。
（9）将消化获得的细胞悬液用无菌纱布过滤或直接沉淀取上清悬液，收集滤液于离心机中800～1000 rpm离心4～5 min。
（10）将离心得到的细胞用完全培养基重悬后接种于培养瓶中培养，30 min后换瓶继续培养，30 min后再次换瓶培养。
（11）24 h后更换新的完全培养基，2～3 d后铺层，即绵羊瘤胃上皮细胞。
（12）若想用于细胞冻存储备，可在细胞铺层至80～90%时，PBS清洗2次，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化5～8分钟，终止消化后离心处理，重悬于冻存液（胎牛血清/DMEM为9:1进行配置）中，按照冻存步骤储存于液氮中。