猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710200348.9 (22)申请日 2017.03.30 (71)申请人 河南省农业科学院 地址 450002 河南省郑州市金水区花园路 116号 申请人 河南中泽生物工程有限公司 (72)发明人 张改平王爱萍苏运芳刘运超 邓瑞广邢广旭陈玉梅郝慧芳 王娟杨聪聪 (74)专利代理机构 郑州大通专利商标代理有限 公司 41111 代理人 陈勇 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.。

2、01) (54)发明名称 猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探 针 (57)摘要 本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒 (PEDV)经典株和变异株荧光定量PCR鉴别检测方 法， 该方法基于PEDV经典毒株和变异毒株的S1基 因， 设计了两条特异性探针， 并在探针的外围设 计了一对特异性引物。 分别以PEDV经典毒株和变 异毒株的代表毒株CV777和CH/HNLY的cDNA为模 板扩增目的片段， 构建重组质粒作为标准品， 用 于建立标准曲线， 并根据两个探针的不同报告基 团来鉴别检测不同毒株。 该方法具有较好的特异 性、 灵敏性和可重复性， 可用于临床样本PEDV的 鉴别检测。 权利要求书2页 。

3、说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 106947832 A 2017.07.14 CN 106947832 A 1.一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 其特征在于， 所述引物的核苷酸 序列为： 上游引物： 5 -GCTAGTGGCGTTCATGG-3 ， 下游引物： 5 -TGTAAATAAAGCTGGTAACCAC-3 ； 所述探针的核苷酸序列为： 探针1： 5 -TACATCGATTCTGGTCAGGGCTTTGAG-3 ， 探针2： 5 -CCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAG-3 ； 其中， 探针1核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有。

4、荧光淬灭基团； 探针2 核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 其特征在于， 所 述探针1的荧光报告基团为CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2。 3.根据权利要求1所述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 其特征在于， 所 述探针2的荧光报告基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ1。 4.权利要求1-3任一所述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针在制备检测猪 流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的试剂中的应用。 5.一种包含权利要求1-3任一所述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针的试 剂。

5、盒。 6.权利要求5所述的试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。 7.一种猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株荧光定量PCR鉴别检测方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： (1)分别以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777和变异毒株CH/HNLY的RNA为模板， 反转录 合成cDNA， 然后以cDNA为模板采用权利要求1所述的上、 下游引物进行PCR反应， 扩增目的片 段， 将获得的目的片段分别连接克隆载体， 转化宿主菌进而构建重组质粒； (2)提取鉴定为阳性的重组质粒， 测定其浓度， 根据重组质粒的浓度计算拷贝数， 并将 重组质粒做10倍系列梯度稀释， 然后分别以每一稀释浓度的重组质粒作为质粒标准。

6、品； (3)收集临床样品， 提取样品的RNA， 反转录合成cDNA， 以样品的cDNA为模板， 同时以质 粒标准品作为标准模板， 进行荧光定量PCR， 根据质粒标准品的Ct值和与之相对应的标准模 板的质粒拷贝数， 分别生成猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的质粒拷贝数-Ct值的 标准工作曲线； 将待测样品的Ct值带入标准工作曲线中， 即可判断临床样品中猪流行性腹 泻病毒经典毒株和变异毒株的病毒含量； 其中， 步骤(3)中所述荧光定量PCR反应的反应体系为： 模板1 l， Premix ExTaqTM(Probe qPCR， 2*Conc.)10 l， 10pmol/L的上、 下游引物各0.4 。

7、l， 10pmol/L的探针1和探针2各0.1 l， ROX Reference Dye II(50*Conc.)0.4 l， 去离子水补至20 l； 所述上游引物的核苷酸序列为： 5 -GCTAGTGGCGTTCATGG-3 ， 所述下游引物的核苷酸序列为： 5 -TGTAAATAAAGCTGGTAACCAC-3 ； 所述探针1的核苷酸序列为： 5 -TACATCGATTCTGGTCAGGGCTTTGAG-3 ， 所述探针2的核苷酸序列为： 5 -CCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAG-3 ； 探针1核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团； 探针2。

8、核苷 酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团。 权利要求书 1/2 页 2 CN 106947832 A 2 8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株荧光定量PCR鉴别检 测方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR反应的反应程序是： 95预变性20s， 1个循环； 95 变性3s， 60延伸30s， 40个循环。 9.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株荧光定量PCR鉴别检 测方法， 其特征在于， 所述探针1的荧光报告基团为CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2。 10.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株荧光定量PCR鉴别。

9、检 测方法， 其特征在于， 所述探针2的荧光报告基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ1。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106947832 A 3 猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针 技术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 具体涉及一种可以鉴别检测猪流行性腹泻经典株和 变异株的荧光定量PCR引物和探针。 背景技术 0002 猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea， PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)引起的一种急性的， 高度传染性的， 以严重水 样呕吐和腹泻及脱水为特征的肠道病。

10、毒性疾病， 主要危害新生仔猪， 死亡率高达100。 PEDV属于冠状病毒科， 冠状病毒属1群， 为单股正链不分节段RNA病毒， 基因组全长28-kb包 含7个开放阅读框， 其中编码的四个结构蛋白基因分别为： S基因、 E基因、 M基因和N基因。 PED 最早发现于英国， 随后在许多国家陆续报道， 如比利时、 日本、 韩国、 意大利、 泰国和美国等。 自20世纪80年代开始， 我国陆续有PED的报道， 至2010年， 我国爆发了更加严重的PED， 给养 猪业带来了巨大的经济损失。 0003 随着对PEDV分子流行病学的不断研究， 基于PEDV S基因的变异情况， PEDV分为了 两个基因型， 即。

11、G1型和G2型， 分别代表了PEDV经典毒株和变异毒株。 PEDV G1型和G2型在抗 原性和基因遗传水平均表现出一定差异。 目前， 针对PEDV的实验室检测方法有ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)、 IC(immunochromatography)、 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)、 nanoparticle-assisted PCR、 reverse transcription-PCR(RT-PCR)等。 尽管这些方法对于检测PEDV有。

12、较好的特异 性、 灵敏性和可重复性， 但却不能够区分不同的PEDV毒株类型。 荧光定量PCR有特异性强、 灵 敏度高、 重复性好和准确定量及快速的优点， 广泛用于实验室疫病检测。 0004 S基因为区分PEDV不同毒株的特征基因， 目前， 已报道有基于S基因的Taqman探针 荧光定量PCR方法来鉴别检测PEDV不同毒株(中国专利号CN103509882A)， 但由于近年来 PEDV变异株S基因的不断变异， 发现该方法所述的变异株探针序列中有碱基的突变， 由于 Taqman探针的高度特异性， 新的突变株有不被检出的可能。 所以， 同样基于S基因， 我们设计 了分别针对不同毒株更加保守的特异性探。

13、针序列， 建立Taqman荧光定量PCR方法， 并评估其 特异性、 灵敏性和可重复性， 用于临床PEDV毒株的鉴别检测。 发明内容 0005 本发明的目的在于针对现有技术存在的问题， 通过对PEDV S1基因的序列分析， 设 计引物和Taqman探针， 并建立了荧光定量PCR方法， 该方法可以实现对PEDV经典毒株和变异 毒株进行快速鉴别检测。 0006 为实现发明目的， 本发明采用的技术方案如下： 0007 本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 其中， 所述引物 的核苷酸序列为： 0008 上游引物： 5 -GCTAGTGGCGTTCATGG-3 (SEQ ID NO。

14、.1)， 说明书 1/6 页 4 CN 106947832 A 4 0009 下游引物： 5 -TGTAAATAAAGCTGGTAACCAC-3 (SEQ ID NO.2)； 0010 所述探针的核苷酸序列为： 0011 探针1(PEDV经典毒株)： 5 -TACATCGATTCTGGTCAGGGCTTTGAG-3 (SEQ ID NO.3)， 0012 探针2(PEDV变异毒株)： 5 -CCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAG-3 (SEQ ID NO.4)； 0013 探针1核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团； 探针2 核苷酸序列的5 端结合。

15、有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团。 0014 根据上述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 优选地， 所述探针1的荧 光报告基团为CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2。 0015 根据上述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 优选地， 所述探针2的荧 光报告基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ1。 0016 本发明所述的引物和探针是通过DNAMAN8软件对GenBank中公布的猪流行性腹泻 病毒的经典毒株和变异毒株的基因进行序列比对， 在序列差异区设计两条特异探针， 并在 探针位置的外围设计共用引物， 然后用MFEprimer-2.0评估探针和引物的可行性。 所有的引 物。

16、和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司。 0017 本发明还提供了一种上述猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针在制备检 测猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的试剂中的应用。 0018 本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒， 所述试剂盒包括猪流行性 腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针， 其中， 0019 所述引物的核苷酸序列为： 0020 上游引物： 5 -GCTAGTGGCGTTCATGG-3 (SEQ ID NO.1)， 0021 下游引物： 5 -TGTAAATAAAGCTGGTAACCAC-3 (SEQ ID NO.2)； 0022 所述探针的核苷酸序列为： 0023。

17、 探针1： 5 -TACATCGATTCTGGTCAGGGCTTTGAG-3 (SEQ ID NO.3)， 探针2： 5 - CCATATTAGAGGTGGTCATGGCTTTGAG-3 (SEQ ID NO.4)； 0024 优选地， 探针1核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基 团； 探针2核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有荧光淬灭基团； 更优选地， 所 述探针1的荧光报告基团为CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2， 所述探针2的荧光报告基团为FAM， 荧 光淬灭基团为BHQ1。 0025 本发明还提供了上述试剂盒在检测猪流行性腹泻病毒中的应用。 00。

18、26 本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株荧光定量PCR鉴别检 测方法， 包括以下步骤： 0027 (1)分别以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777和变异毒株CH/HNLY的RNA为模板， 反 转录合成cDNA， 然后以cDNA为模板采用权利要求1所述的上、 下游引物进行PCR反应， 扩增目 的片段， 将获得的目的片段分别连接克隆载体， 转化宿主菌进而构建重组质粒； 0028 (2)提取鉴定为阳性的重组质粒， 测定其浓度， 根据重组质粒的浓度计算拷贝数， 并将重组质粒做10倍系列梯度稀释， 然后分别以每一稀释浓度的重组质粒作为质粒标准 品； 0029 (3)收集临床样品， 提取样。

19、品的RNA， 反转录合成cDNA， 以样品的cDNA为模板， 同时 以质粒标准品作为标准模板， 进行荧光定量PCR， 根据质粒标准品的Ct值和与之相对应的标 说明书 2/6 页 5 CN 106947832 A 5 准模板的质粒拷贝数， 分别生成猪流行性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的质粒拷贝数-Ct 值的标准工作曲线； 将待测样品的Ct值带入标准工作曲线中， 即可判断临床样品中猪流行 性腹泻病毒经典毒株和变异毒株的病毒含量； 0030 其中， 步骤(3)中所述荧光定量PCR反应的反应体系为： 模板1 l， Premix Ex TaqTM (Probe qPCR， 2*Conc.)10 l， 10。

20、pmol/L的上、 下游引物各0.4 l， 10pmol/L的探针1和探针2 各0.1 l， ROX Reference Dye II(50*Conc.)0.4 l， 去离子水补至20 l； 0031 所述上游引物的核苷酸序列为： 5 -GCTAGTGGCGTTCATGG-3 ， 所述下游引物的核苷 酸序列为： 5 -TGTAAATAAAGCTGGTAACCAC-3； 所述探针1的核苷酸序列为： 5 - T A C A T C G A T T C T G G T C A G G G C T T T G A G - 3， 所 述 探 针 2的 核 苷 酸 序 列为 ： 5- CCATATTAGA。

21、GGTGGTCATGGCTTTGAG-3 ； 优选地， 探针1核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基 团， 3 端结合有荧光淬灭基团； 探针2核苷酸序列的5 端结合有荧光报告基团， 3 端结合有 荧光淬灭基团； 更优选地， 所述探针1的荧光报告基团为CY5， 荧光淬灭基团为BHQ2， 所述探 针2的荧光报告基团为FAM， 荧光淬灭基团为BHQ1。 0032 所述荧光定量PCR反应的反应程序是95预变性20s， 然后进行以下40个循环： 95 变性3s， 60延伸30s。 0033 本发明每次检测样品时须设立阴性对照和阳性对照， 在检测中两种对照为有效扩 增时， 样本结果判断标准如下： 0034 扩。

22、增曲线Ct值35时样品结果为阳性； 0035 扩增曲线Ct值40时样品结果为阴性； 0036 扩增曲线Ct值在3540之间时， 样品需要重复， 重复试验如Ct值依然Ct值仍在这 个范围的判断为阳性。 0037 本发明的积极有益效果： 0038 (1)本发明基于PEDV S基因， 设计了分别对PEDV经典毒株和变异毒株特异的探针 序列， 在探针的外围设计了共用的引物序列， 该引物和探针序列特异性和灵敏性都较高， 其 检测样本的最低拷贝数达到了4.8102， 能够鉴别检测PEDV经典毒株和变异毒株， 因此， 可 以实现对临床样本的精确鉴别检测。 0039 (2)本发明提供的猪流行性腹泻病毒经典毒株。

23、和变异毒株荧光定量PCR鉴别检测 方法操作简单， 准确性高， 检测速度快， 可以实现对样品中PEDV的定量检测。 附图说明 0040 图1为本发明PEDV经典毒株的标准曲线； 0041 图2为本发明PEDV变异毒株的标准曲线； 0042 图3为本发明的特异性试验， 1： PEDV经典毒株的重组质粒； 2： PEDV变异毒株的重组 质粒； 3： PEDV经典毒株重组质粒和PEDV变异毒株重组质粒的混合物； 4： RV； 5： TGEV； 6： PRV； 7： PRRS； 8： PCV2； 9： PPV； 10： CSFV； 11： 阴性对照； 0043 图4为荧光定量PCR方法检测临床样品中PE。

24、DV的核酸拷贝数。 具体实施方式 0044 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容， 但不应该理解为对本发明的限 说明书 3/6 页 6 CN 106947832 A 6 制。 在不背离本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范畴。 0045 除非特别说明， 本发明采用的除引物、 探针之外的试剂、 方法和设备均为本领域常 规试剂、 方法和设备。 除非特别说明， 本发明使用的样品、 试剂和试剂盒均为市购。 0046 实施例1： 探针和引物的设计与合成 0047 引物和探针是通过DNAMAN8软件对GenBank中近年来公布的猪流行性腹泻病毒的 经。

25、典毒株(经典毒株代表毒株的登录号为： AF353511 .1， JN547228.1， KT323979 .1， EF185992.1， JN601050.1， JX560761.1)和变异毒株(变异毒株代表毒株的登录号为： KC210145.1， JX112709.1， KU133250.1， KJ646584.1， KP698764.2， KT428879.1， KX073609.1， KU133236.1， KU133259.1， KU237226.1， KU710232.1， KR233257.1， KJ646580.1， KU237230.1， KU237229.1， KU97751。

26、2.1， KU710235.1， KU133269.1， KU710245.1， KU710234.1， KU710229.1， KU710242.1， KR296683.1， KT989356.1， KU237217.1)的S1基因进行序列比对， 在序列差异区 设计两条特异探针， 并在探针位置的外围设计共用引物， 然后用MFEprimer-2.0评估探针和 引物的可行性。 所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 0048 实施例2： RNA提取及cDNA合成 0049 取300 l感染猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777(该毒株已鉴定为猪流行性腹泻经 典毒株， 也可以使用其。

27、它经典毒株替代)的细胞培养液、 300 l感染猪流行性腹泻病毒变异 毒株CH/HNLY(该毒株已鉴定为猪流行性腹泻变异毒株， 也可以使用其它变异毒株替代)的 临床样本处理上清液(取感染猪流行性腹泻病毒变异毒株CH/HNLY的猪肠道组织， 用剪刀剪 碎， 加入适量生理盐水， 冻融3次， 3000rpm/min离心5min取上清)， 分别加入800 l Trizol， 充分混匀， 室温静置10min； 再加入200 l氯仿， 充分混匀， 室温静置10min， 12000rpm离心 10min， 取上清分别加入等倍体积的异丙醇， 混匀后-20过夜； 取出后4条件下12000rpm 离心10min， 。

28、弃上清， 沉淀用75DEPC水配制乙醇洗涤两遍， RNA用适量RNAase-free水溶解， 即为RNA模板， -80保存备用。 0050 取1 g RNA(用RNAase-free水补足体积为13 l)进行反转录， 首先向1 g RNA(用 RNAase-free水补足体积为13 l)中加入1 l 10pmolOligo(dT)， 70孵育10min然后冰上放 置1min， 向混合液中加入4 l 5RT buffer， 1 LdNTP(2.5mM)， 0.5 l of RNA酶抑制剂 (40U/ l)和0.5 l反转录酶(200U/ l)， 42孵育1h， 得到cDNA模板， -20保存备用。

29、。 0051 实施例3： 基因克隆 0052 以反转录得到的cDNA为模板， 用本发明上、 下游引物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2) 分别扩增目的片段， 其中， PCR扩增反应体系为： 模板1 l， 2Ex Taq10 l， 上、 下游引物 (10pmol)各1 l， 补去离子水至20 l； PCR反应程序为： 95预变性5min， 然后进行以下30个 循环： 95变性30s， 55退火30s， 72延伸30s， 循环结束后进行72延伸5min。 PCR扩增产 物用1琼脂糖电泳鉴定， 并用胶回收试剂盒(TaKaRa)回收目的片段， 将目的片段克隆至 Peasy-Blunt载体。

30、并转化到DH5 感受态细胞， 蓝白斑筛选挑取阳性克隆， 测序鉴定阳性重组 质粒。 0053 实施例4： 标准曲线的建立 0054 采用质粒提取试剂盒提取测序鉴定为阳性的重组质粒， 用分光光度计测定重组质 粒的浓度， 根据重组质粒的浓度计算每 L重组质粒的拷贝数， 并将重组质粒做10倍系列梯 说明书 4/6 页 7 CN 106947832 A 7 度稀释(稀释后重组质粒的浓度范围为4.81010-4.8100拷贝数/ l)， 然后分别以每一稀 释梯度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。 其中， 荧光定量PCR反应体系为： 模板1 l， Premix Ex TaqTM(Probe qPCR，。

31、 2*Conc.)(10 l， 10pmol/L的上、 下游引物各0.4 l， 10pmol/L 的探针1和探针2各0.1 l， ROX Reference Dye II(50*Conc.)0.4 l， 去离子水补至20 l。 荧 光定量PCR反应程序为： 95预变性20s， 再进行以下40个循环： 95变性3s， 60延伸30s。 荧光定量PCR反应结束后根据质粒拷贝数和与之对应的Ct值建立标准曲线， 其中， 以猪流行 性腹泻病毒经典毒株重组质粒10倍系列稀释为模板生成的标准曲线为PEDV经典毒株标准 曲线， 斜率： -3.213， R20.999， 直线方程为： Y-3.213lgX+45。

32、.14(图1)； 以猪流行性腹泻 病毒变异毒株重组质粒10倍系列稀释为模板生成的标准曲线为PEDV变异毒株标准曲线， 斜 率： -3.119， R20.999， 直线方程为： Y-3.119lgX+45.75(图2)。 0055 实施例5： 特异性检验 0056 利用本发明建立的荧光定量PCR方法， 以实验室收集保存的7种猪源病毒(分别为： 轮状病毒(RV)、 猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)、 伪狂犬病毒(PRV)、 蓝耳病病毒(PRRS)、 圆环病 毒(PCV2)、 细小病毒(PPV)和猪瘟病毒(CSFV)的DNA或cDNA为模板， 利用本发明的荧光定量 PCR引物和探针进行荧光定量PCR扩。

33、增反应， 同时设立阴性对照(去离子水为模板)和3个阳 性对照(PEDV经典毒株重组质粒、 PEDV变异毒株重组质粒、 PEDV经典毒株重组质粒和变异毒 株重组质粒的混合物)； 其中， 荧光定量PCR的反应体系、 反应程序同实施例4。 结果显示只有 阳性对照出现报告荧光信号， 其他均未出现， 表明本发明的荧光定量PCR引物和探针具有较 好的特异性(图3)。 0057 实施例6： 敏感性试验和重复性检验 0058 分别以浓度为4.81010拷贝数/ l、 4.8109拷贝数/ l、 4.8108拷贝数/ l、 4.8 107拷贝数/ l、 4.8106拷贝数/ l、 4.8105拷贝数/ l、 4。

34、.8104拷贝数/ l、 4.8103拷 贝数/ l、 4.8102拷贝数/ l、 4.8101拷贝数/ l、 4.8100拷贝数/ l的重组质粒为模板 做批间重复， 每个浓度做三个重复， 以出现阳性曲线所用模板的最高稀释度为其敏感度， 结 果见表1。 由表1可知， 本发明的荧光定量PCR方法最低检出浓度为4.8102拷贝数/ l， 批间 重复的变异系数均小于5， 由此可以说明本发明所建立的荧光定量PCR反应体系具有较好 的敏感性和可重复性。 0059 表1为本发明荧光定量PCR检测方法的敏感性和重复性试验结果 说明书 5/6 页 8 CN 106947832 A 8 0060 0061 实施。

35、例7： 临床样品检测 0062 (1)临床样品和采集和处理 0063 收集79份来自临床的粪便和肠道组织样品， 向肠道组织(用剪刀适当剪碎)或粪便 样本中加入适量生理盐水， 冻融3次， 取上清提取RNA并反转录成cDNA(RNA提取及cDNA合成 的方法同实施例2)， -20保存备用。 0064 (2)PCR体系和程序 0065 以反转录合成的样品的cDNA为模板， 以本发明的荧光定量PCR引物和探针进行荧 光定量PCR扩增反应， 其中， 荧光定量PCR的反应体系、 反应程序同实施例4。 0066 (3)结果判定 0067 荧光报告基团CY5有扩增曲线出现说明检测样品感染了PEDV经典毒株， 。

36、荧光报告 基团FAM有扩增曲线出现说明检测样品感染了PEDV变异毒株； 若是均无扩增曲线产生， 则说 明样品没有感染PEDV； 若荧光报告基团CY5和FAM均有扩增曲线产生， 说明检测样品为经典 株和变异株PEDV共感染样品。 其中扩增曲线Ct值小于35的判断为阳性， Ct值大于35而小于 40的判断为可疑， 需重复试验， 重复试验Ct值仍在这个范围的判断为阳性。 由图4可以看出， 79份临床样本中， 有63份样品感染PEDV变异毒株， 3份样品为经典株和变异株PEDV共感染样 品， 1份样品感染PEDV经典毒株。 说明书 6/6 页 9 CN 106947832 A 9 SEQUENCE L。

37、ISTING 河南省农业科学院 河南中泽生物工程有限公司 猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR的引物和探针 1 4 PatentIn version 3.5 1 17 DNA Artificial Sequence 上游引物 1 gctagtggcg ttcatgg 17 2 22 DNA Artificial Sequence 下游引物 2 tgtaaataaa gctggtaacc ac 22 3 27 DNA Artificial Sequence 探针1 3 tacatcgatt ctggtcaggg ctttgag 27 4 28 DNA Artificial Sequence 探针2 4 序列表 1/2 页 10 CN 106947832 A 10 ccatattaga ggtggtcatg gctttgag 28 序列表 2/2 页 11 CN 106947832 A 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 106947832 A 12 图3 图4 说明书附图 2/2 页 13 CN 106947832 A 13 。