一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710176481.5 (22)申请日 2017.03.23 (71)申请人 伍亭亦 地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡 塘区大学东路100号广西大学西校园 北区28栋1单元601室 (72)发明人 伍亭亦 (74)专利代理机构 广西南宁汇博专利代理有限 公司 45114 代理人 黄南概 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养 基及其制备方法 (57。

2、)摘要 本发明属于微生物培养技术领域， 提供了一 种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 由包 括以下原料组分制备而得： 马铃薯、 藜麦、 葡萄 糖、 琼脂、 蒸馏水。 本发明同时提供了该培养基的 制备方法。 从试验结果得知， 本发明培养基分离 到的沉香内生真菌数量明显增多， 在液体摇菌培 养中沉香内生真菌在短时间内能达到最大生长 量， 从而大大缩短了摇菌时间。 而且这种培养基 营养成分全部来自天然食材食材 （马铃薯、 藜麦） 加葡萄糖， 没有任何其他添加剂， 对做为入口治 病药材的沉香结香菌的培养尤为重要， 绿色环 保， 且制备简便经济实用。 权利要求书1页 说明书5页 CN 1069676。

3、17 A 2017.07.21 CN 106967617 A 1.一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 其特征在于， 由包括以下重量份数比 的原料组分制备而得： 马铃薯100-200份、 藜麦15-40份、 葡萄糖15-25份、 琼脂0-20份、 蒸馏 水700-900份。 2.如权利要求1所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 将马铃薯削皮、 切片后与水混合， 打浆， 浆渣分离， 得马铃薯汁； 或将马铃薯削皮、 切 块后加水煮沸， 浆渣分离， 得马铃薯汁； （2） 将藜麦用水浸泡过夜， 打浆， 浆渣分离， 得藜麦汁； （3） 将马铃薯汁和。

4、藜麦汁混合， 加入葡糖糖、 琼脂和蒸馏水， 混匀， 调节pH为5.8-6.0, 121灭菌20min， 即得。 3.根据权利要求2所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 其特征在 于， 所述马铃薯与水的重量比为1:3-8。 4.根据权利要求2所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 其特征在 于， 所述马铃薯削皮、 切块后加水煮沸时间为25-35min。 5.根据权利要求2所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 其特征在 于， 所述藜麦用水浸泡时间为8-24h。 6.根据权利要求2所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 其特征在 于， 所述藜麦与水。

5、的重量比为1:3-8。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106967617 A 2 一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于微生物培养技术领域， 具体涉及一种用于分离沉香结香内生真菌并实 现快速繁殖的培养基， 是一种适用于沉香结香菌产业化生产的绿色环保培养基， 同时涉及 所述培养基的制备方法。 背景技术 0002 沉香为瑞香科植物沉香属的白木香树Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg含有树脂 的木材。 自古以来， 沉香被视作一种名贵香料和中药材， 在宋代已经有 “一两沉香一两金” 的 说法， 具有很高的药用价值和商业价值。 沉香具。

6、有行气止痛、 温中止呕、 纳气平喘之功效。 其 分布于广东、 海南、 广西、 福建等地， 喜生于低海拔的山地、 丘陵以及路边阳处疏林中。 近年 来， 由于沉香树自然繁殖率低、 人为掠夺式砍伐等原因， 国产沉香产量严重不足， 而市场需 求不断扩大， 供需矛盾突出。 沉香已被列入国家二级保护濒危树种。 0003 普遍观点认为自然界的白木香树中一般不会自然产生沉香树脂， 只有在受物理化 学的损伤或某些生物的刺激， 白木香树出于自身的免疫修复机制， 细胞会分泌出特殊的树 脂来保护自己， 与内生菌次级代谢产物一起形成了沉香， 其自然积累过程需要漫长的数十 年， 且品质不可控。 随着研究的深入， 目前已有。

7、不少研究证实沉香的形成与其内生菌的感染 有关， 这些沉香内生菌可促进白木香树结香。 我们从野生沉香树结香木材组织、 健康白木组 织和叶片组织中提取和分离出沉香内生真菌， 为下一步研究沉香结香机理提供真菌菌群供 试材料。 目前已经公布的真菌培养基大多数添加的成分很多， 其中添加的一些成分来自于 化学合成， 而沉香其中一个重要用途是做为名贵中药， 这些经过化学提取加工得到的成分 是否会对人体健康产生不良影响尚未可知。 如中国专利(CN105331560A)公开了一种用于诱 导沉香结香的内生菌液体培养基， 配方为： 马铃薯70， 木屑17、 麸皮5、 玉米粉4、 黄 豆粉1、 蛋白胨0.5、 葡萄糖。

8、1、 磷酸二轻钾0.2、 硫酸镁0.2、 维生素0.1。 0004 微生物生长繁殖速率跟菌种、 菌龄、 接种量及培养条件有关， 如果培养基的营养成 分能满足菌种生长的需要， 则菌种很易适应， 会起到缩短延滞期的作用， 其生长速率会加 快， 进入对数生长期(生长速率达到最高的时期， 菌数以几何级数增加)的时间会大大缩短。 微生物的代时虽然因种而异， 可是同一个种也受培养基成分的影响。 在自然环境中， 很多菌 种的生长速率并不能以几何级数增加， 而以算术级数增加， 这是因为这些菌种需要某种必 需的生长因子， 如维生素等， 这些生长因子能影响生长速率。 而在自然环境中， 生长因子的 浓度极低， 一旦。

9、被细菌繁殖用去一部分后， 就会影响下一步的细菌生长率， 因而造成算术级 数生长现象。 0005 藜麦， 原产于南美洲安第斯山区， 是印加土著居民的主要传统食物， 有5000-7000 多年的食用和种植历史， 由于其具有独特的丰富、 全面的营养价值， 养育了印加民族， 古代 印加人称之为 “粮食之母” 。 藜麦在1980年代被美国宇航局用于宇航员的太空食品。 联合国 粮农组织认为藜麦是唯一一种单体植物即可基本满足人体基本营养需求的食物， 正式推荐 藜麦为最适宜人类的完美的全营养食品。 近几年很多国家都在大力发展藜麦种植， 中国的 说明书 1/5 页 3 CN 106967617 A 3 专业农业。

10、公司也与南美洲一些藜麦专业公司合作， 在国内类似南美洲藜麦生长气候的区域 开始了大规模种植藜。 藜麦胚芽占种子的30， 且具有营养活性， 藜麦的蛋白质含量高达 16-22(牛肉20)， 品质与奶粉及肉类相当， 富含多种氨基酸， 其中有人体必需的全部9 种必需氨基酸， 比例适当且易于吸收， 尤其富含植物中缺乏的赖氨酸， 钙、 镁、 磷、 钾、 铁、 锌、 硒、 锰、 铜等矿物质营养含量高， 富含不饱和脂肪酸、 类黄酮、 B族维生素和E族维生素、 胆碱、 甜菜碱、 叶酸、 -亚麻酸、 -葡聚糖等多种有益化合物。 藜麦的特性为其能够应用于微生物 培养基中奠定了基础， 由于藜麦营养丰富全面， 能够替代。

11、传统培养基中多种常规组分满足 微生物快速繁殖的需要。 如中国专利(CN104718987A)公开了一种以藜麦膨化料和藜麦粉碎 料为培养基， 接种冬虫夏草和蛹虫草种子液进行发酵生产的方法， 膨化藜麦与机械粉碎藜 麦混合后进行发酵， 一方面使得菌体可以快速利用膨化过程所产生的营养物质， 另一方面 机械粉碎藜麦相当于是固态发酵载体使发酵基质保持疏松有利菌体生长， 当菌体生长旺盛 时菌体产生大量胞外酶又可以进一步分解利用机械粉碎藜麦。 该过程无需添加其它物质， 保证发酵产品的质量高度可控。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种绿色环保、 健康对人无害的、 适用于沉香结香内生真 菌分离和快繁的培。

12、养基， 该培养基主要由天然原料马铃薯、 藜麦配备其他辅料制备而成， 制 备简便、 经济实用。 0007 具体的， 本发明所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 由包括以下重量份 数比的原料组分制备而得： 马铃薯100-200份、 藜麦15-40份、 葡萄糖15-25份、 琼脂0-20份、 蒸馏水700-900份。 0008 本发明同时提供了所述沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法， 包括 以下步骤： 0009 (1)将马铃薯削皮、 切片后与水混合， 打浆， 浆渣分离， 得马铃薯汁； 或将马铃薯削 皮、 切块后加水煮沸， 浆渣分离， 得马铃薯汁； 0010 (2)将藜麦用水浸泡过夜， 。

13、打浆， 浆渣分离， 得藜麦汁； 0011 (3)将马铃薯汁和藜麦汁混合， 加入葡糖糖、 琼脂(制备固体培养基时加入)和蒸馏 水， 混匀， 调节pH为5.8-6.0,121灭菌20min， 即得。 0012 作为本发明沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基的制备方法的进一步说明， 所 述马铃薯与水的重量比为1:3-8； 所述马铃薯削皮、 切块后加水煮沸时间为25-35min； 所述 藜麦用水浸泡时间为8-24h； 所述藜麦与水的重量比为1:3-8。 0013 本发明培养基中添加的藜麦， 营养丰富全面， 富含四十多种营养物质， 包括多种氨 基酸、 矿物质、 维生素及多种有益的化合物， 能够全面提供沉香。

14、内生真菌生长和快速繁殖的 需要。 从试验结果得知， 本发明培养基分离到的沉香内生真菌数量明显增多， 在液体摇菌培 养中沉香内生真菌在短时间内能达到最大生长量， 从而大大缩短了摇菌时间。 而且这种培 养基营养成分全部来自天然食材食材(马铃薯、 藜麦)加葡萄糖， 没有任何其他添加剂， 对做 为入口治病药材的沉香结香菌的培养尤为重要， 绿色环保， 且制备简便经济实用。 具体实施方式 说明书 2/5 页 4 CN 106967617 A 4 0014 以下结合实施例对本发明作进一步详细说明， 本实施例仅是对本发明作更清楚的 说明， 而不是对本发明的限制。 应当指出， 对于本领域的普通技术人员来说， 在。

15、不脱离本发 明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些均落在本发明的保护范围之内。 0015 实施例中的沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 由包括以下重量份数比的原 料组分制备而得： 马铃薯100-200份、 藜麦15-40份、 葡萄糖15-25份、 琼脂0-20份、 蒸馏水 700-900份。 制备方法包括以下步骤： 0016 (1)将马铃薯削皮、 切片后与水按重量比为1:3-8混合， 打浆， 浆渣分离， 得马铃薯 汁； 或将马铃薯削皮、 切块后加3-8倍重量的水煮沸25-35min， 浆渣分离， 得马铃薯汁； 0017 (2)将藜麦用3-8倍重量的水浸泡8-24h， 打浆， 浆渣。

16、分离， 得藜麦汁； 0018 (3)将马铃薯汁和藜麦汁混合， 加入葡糖糖、 琼脂(制备固体培养基时加入)和蒸馏 水， 混匀， 调节pH为5.8-6.0,121灭菌20min， 即得。 0019 下面通过更具体实施例对本发明进行说明。 0020 实施例1 0021 一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 制备方法包括以下步骤： 0022 (1)将马铃薯削皮、 切片， 称取200g与水按重量比为1:6混合， 用细胞破壁机打浆， 过滤分离浆渣， 得马铃薯汁； 0023 (2)称取10g藜麦用6倍重量的水浸泡12h， 再用细胞破壁机打浆， 过滤分离浆渣， 得 藜麦汁； 0024 (3)将马铃薯汁和藜。

17、麦汁混合， 加入葡糖糖20g、 琼脂15g， 充分溶解后用蒸馏水定 容至1000ml， 混匀， 调节pH为5.8,121灭菌20min， 即得。 0025 实施例2 0026 一种沉香结香内生真菌分离与快繁用培养基， 制备方法包括以下步骤： 0027 (1)将马铃薯削皮、 切块， 称取200g加8倍水煮沸30min， 然后用细胞破壁机打浆， 过 滤分离浆渣， 得马铃薯汁； 0028 (2)称取20g藜麦用5倍重量的水浸泡16h， 再用细胞破壁机打浆， 过滤分离浆渣， 得 藜麦汁； 0029 (3)将马铃薯汁和藜麦汁混合， 加入葡糖糖20g、 琼脂10g， 充分溶解后用蒸馏水定 容至1000ml。

18、， 混匀， 调节pH为6.0,121灭菌20min， 即得。 0030 以下实施例3-8与上述实施例1、 2的制备过程基本一致， 不同之处仅在于原料组分 用量的不同， 因此， 制备过程不再累述。 0031 实施例3： 马铃薯200g、 藜麦30g、 琼脂15g、 葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0032 实施例4： 马铃薯150g、 藜麦15g、 琼脂15g、 葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0033 实施例5： 马铃薯150g、 藜麦25g、 琼脂20g、 葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0034 实施例6： 马铃薯150g、 藜麦35g、 琼脂15g、 。

19、葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0035 实施例7： 马铃薯100g、 藜麦30g、 琼脂15g、 葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0036 实施例8： 马铃薯100g、 藜麦40g、 琼脂20g、 葡萄糖20g， 蒸馏水补足至1000ml。 0037 实施例1-8所制得的固体培养基作为分离培养基， 以加琼脂的固体PDA培养基和 SDA琼脂培养基作为对照培养基， 采用组织分离法对沉香结香木材组织、 健康白木组织和叶 片的内生真菌进行分离， 将表面消毒过的木材组织在超净工作台上用无菌刀片去除外周表 说明书 3/5 页 5 CN 106967617 A 5 层木材组织， 切。

20、成长宽为3cm2cm的薄片状， 叶片消毒后切成长宽为2cm2cm大小， 放入上 述培养基平板上， 28避光培养， 设置3个重复。 对所分离的内生真菌进行反复纯化， 对得到 单一菌落进行统计， 统计分离得到的内生真菌数量， 结果见表1。 0038 表1实施例1-8培养基对沉香内生真菌的分离效果 0039 0040 按实施例1-8制备过程、 原料组分用量(除了不添加琼脂)制得的液体培养基作为 快繁培养基， 对应实施例9-16。 0041 随机选取野生沉香树结香木材组织内分离到的内生真菌3个作为供试菌种， 每个 菌种单独平板划线后挑取单菌落分别接种到实施例9-16培养基和两个对照培养基中(液体 PD。

21、A培养基和SDA培养基)， 50ml带盖离心管装20ml培养基(每份做两个平行)， 200转28摇 菌培养7天。 用干重法测定其各自的生物量， 具体做法： 培养液用滤纸过滤后， 留在纸上的菌 丝体先用适量清水洗涤， 80烘干称重。 本实验进行三次重复， 取平均值。 结果见表2。 0042 表2实施例9-16培养基对不同菌种的生长量比较 0043 0044 从表1可见实施例1-8培养基通过对3个不同部位内生真菌分离纯化培养， 所测得 的分离菌株总数明显高于对照培养基， 提高60以上。 从表2可见实施例9-16培养基通过3 说明书 4/5 页 6 CN 106967617 A 6 种不同真菌进行7天摇菌培养， 所测得的菌体生长量明显高于对照培养基， 提高大约20- 40左右。 说明书 5/5 页 7 CN 106967617 A 7 。