技术领域
本发明涉及一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。
背景技术
N-乙酰神经氨酸是生物体内的一种糖类物质，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸是细胞信息传递关键物质，参与细胞识别、信号转导、受精等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于抗炎，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育，维持老年人大脑健康。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品容易引起过敏反应，或是通过严苛条件的化学法合成，高温、高压工艺复杂，中间产物等难以分离，而且对环境污染严重。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌合成代谢流通量不足，影响N-乙酰神经氨酸代谢合成。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加前体供给以提高N-乙酰神经氨酸产量，是一个值得深入探讨的问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明构建了一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌。
本发明的高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌，通过敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG得到。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB为宿主构建得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB宿主是通过氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因重组于Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72(Liu Y,Zhu Y,Li J,Shin H-D,Chen RR,Du G,Liu L,Chen J.Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production.Metabolic engineering,2014.23:42-52)基因组上整合表达，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于质粒pP43NMK(Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression and secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Applied and environmental microbiology.2005；71(7):4101-3.)上游离表达得到。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
1)构建重组敲除片段
克隆磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG两侧同源臂基因，克隆Spectinomycin抗性基因，3段基因通过融合PCR组装。
2)构建高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌
将上述重组敲除片段转化枯草芽孢杆菌，得到高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。
本发明还提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。
本发明的有益效果
本发明的宿主细胞中构建了利用N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE以及N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB合成N-乙酰神经氨酸的新途径，利用枯草芽孢杆菌自有的代谢途径，从底物葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖仅需要强化氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸转氨酶(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶(GNA1)两个酶的作用即可，有助于强化合成代谢流。
本发明进一步通过改造PTS系统不仅可以提高葡萄糖利用率，并且可以调整枯草芽孢杆菌合成代谢途径中的底物浓度，使N-乙酰神经氨酸产量提高。
本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现N-乙酰神经氨酸在胞外积累，其含量可达到660mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
具体实施方式
重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：
种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
培养条件：将37℃、200rpm下培养16h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。
乙酰氨基葡萄糖的测定方法：
高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：5mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱温60℃，进样体积为10μL。
实施例1宿主细胞构建
1)构建重组片段
通过融合PCR，将氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因GNA1克隆片段，与重组同源臂以及zeocin抗性基因融合；
2)构建重组质粒
克隆氨基酸序列为SEQ ID NO.3的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的编码基因AGE，以及氨基酸序列为SEQ ID NO.4的N-乙酰神经氨酸合酶的编码基因NeuB，连接到重组表达质粒pP43NMK上；
3)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌
将上述步骤1)中重组片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72)，重组到基因组上，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B6C；而后将上述步骤2)中重组质粒转化到B6C菌株中，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB。
实施例2重组质粒的构建
根据NCBI上公布的磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，设计其上游914bp同源臂序列，设计序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物：ptsG-1F:5’-TAAAAGACGAGAAGGAACAAAAGCAG-3’，ptsG-1R:5’-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAAGAATTGACCTCCTCTTTTTACTAGTCTG-3’；设计其下游927bp同源臂序列，设计序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物：ptsG-2F:5’-CGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGGGTGTTAGTACGCCGTGCTTGT-3’，ptsG-2R:5’-AGATGTGCGTCCGCCGATAT-3’；根据P7S6质粒(Yan,X.,Yu,H.J.,Hong,Q.&Li,S.P.Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis.Applied andEnvironmental Microbiology 74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008))序列信息扩增Spectinomycin抗性基因，设计序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物：Spc-F:5’-TAGTAAAAAGAGGAGGTCAATTCTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，Spc-R:5’-TGACAAGCACGGCGTACTAACACCCCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。通过融合PCR，将以上3段基因融合成重组敲除片段。
实施例3重组枯草芽孢杆菌的构建
将构建好的重组敲除片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB)。采用Spc-F及Spc-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1264bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
实施例4宿主菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸
将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h。最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到190mg/L。过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB，实现了N-乙酰神经氨酸在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。
实施例5重组菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸
将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h，最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到660mg/L。敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，实现了构建高产N-乙酰神经氨酸重组工程菌，较出发菌株产量190mg/L，有了较大提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 699
<212> PRT
<213> 磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG氨基酸序列
<400> 1
Met Phe Lys Ala Leu Phe Gly Val Leu Gln Lys Ile Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Met Leu Pro Val Ala Ile Leu Pro Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ala Ile
20 25 30
Gly Asn Ala Met Gln Asn Lys Asp Met Ile Gln Val Leu His Phe Leu
35 40 45
Ser Asn Asp Asn Val Gln Leu Val Ala Gly Val Met Glu Ser Ala Gly
50 55 60
Gln Ile Val Phe Asp Asn Leu Pro Leu Leu Phe Ala Val Gly Val Ala
65 70 75 80
Ile Gly Leu Ala Asn Gly Asp Gly Val Ala Gly Ile Ala Ala Ile Ile
85 90 95
Gly Tyr Leu Val Met Asn Val Ser Met Ser Ala Val Leu Leu Ala Asn
100 105 110
Gly Thr Ile Pro Ser Asp Ser Val Glu Arg Ala Lys Phe Phe Thr Glu
115 120 125
Asn His Pro Ala Tyr Val Asn Met Leu Gly Ile Pro Thr Leu Ala Thr
130 135 140
Gly Val Phe Gly Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Ala Ala Leu Leu Phe
145 150 155 160
Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Gly Phe Phe Ala
165 170 175
Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Val Thr Ser Ile Ser Ala Leu Ile Leu
180 185 190
Gly Leu Ile Met Leu Val Ile Trp Pro Pro Ile Gln His Gly Leu Asn
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Ile Phe Gly Val Ile Glu Arg Ser Leu Ile Pro Phe Gly Leu His His
225 230 235 240
Ile Phe Tyr Ser Pro Phe Trp Tyr Glu Phe Phe Ser Tyr Lys Ser Ala
245 250 255
Ala Gly Glu Ile Ile Arg Gly Asp Gln Arg Ile Phe Met Ala Gln Ile
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Ala Ala Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Leu Glu Phe
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340 345 350
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355 360 365
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Lys Gln Leu Gly Ala Ser Gly Val Leu Glu Val Gly Asn Asn Ile Gln
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<210> 2
<211> 159
<212> PRT
<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C）
<400> 2
Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp
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Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr
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Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys
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<210> 3
<211> 388
<212> PRT
<213> 念珠藻（Anabaena sp.CH1）
<400> 3
Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu
1 5 10 15
Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu
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385
<210> 4
<211> 346
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli K1）
<400> 4
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1 5 10 15
Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly
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130 135 140
Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile
145 150 155 160
Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys
165 170 175
Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile
180 185 190
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195 200 205
His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile
210 215 220
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225 230 235 240
Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile
245 250 255
Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val
260 265 270
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275 280 285
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340 345
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
taaaagacga gaaggaacaa aagcag 26
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<211> 55
<212> DNA
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tcctgtgtga aattgttatc cgctcaagaa ttgacctcct ctttttacta gtctg 55
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<211> 48
<212> DNA
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<400> 7
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<210> 8
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<210> 10
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<400> 10
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