技术领域
本发明属于体外细胞培养技术领域，具体涉及一种美容用表皮干细胞生长因子制备方法。
背景技术
表皮干细胞作为人体表皮基底部具有不断增殖和分化能力的干细胞，同时也是皮肤组织中的专能干细胞，其可增殖和分化为皮肤中的各种细胞成分，使得皮肤保持正常的表皮结构。
细胞保持活性、增殖和分化能力直接依赖细胞生存的微环境，因此直接将干细胞应用于美容领域所达到的效果并不理想。同时，细胞死亡破碎形成的细胞碎片还可能带来安全隐患。
由于表皮干细胞在培养过程中即分泌表皮干细胞生长因子并且扩散进入细胞培养基中，很难从培养基中有效提取表皮干细胞所分泌的生长因子。同时，因细胞培养基中含有大量营养成分，容易发生细菌滋生等问题。
因此，有必要提出一种旨在用于美容领域的表皮干细胞生长因子制备方法，将分泌的生长因子应用于皮肤再生、修复、去皱等美容途径。
发明内容
本发明针对现有技术的状况，提供一种美容用表皮干细胞生长因子制备方法。
本发明采用以下技术方案，所述美容用表皮干细胞生长因子制备方法包括步骤：
步骤A：将表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养；
步骤B：选择对数生长期的表皮干细胞，经1000rpm和5分钟离心处理以去除细胞培养基，获得经离心分离的表皮干细胞；
步骤C：将经离心分离的表皮干细胞使用生理盐水洗涤并稀释至1*107/ml；
步骤D：将经生理盐水稀释的表皮干细胞于37℃，5%CO2细胞培养箱中无营养条件培养6小时，提取表皮干细胞分泌的表皮干细胞生长因子。
根据上述技术方案，在上述步骤A中，所述表皮干细胞采用以下步骤制备：
步骤A.1：获取角朊细胞悬液；
步骤A.2：分离角朊细胞悬液获得表皮干细胞。
根据上述技术方案，在上述步骤A.1中，所述角朊细胞悬液采用以下步骤制备：
步骤A.1.1：分离包皮的表皮和真皮层，使用胰蛋白酶消化剪碎的表皮以形成混合物；
步骤A.1.2：过滤混合物获得细胞悬液，将细胞悬液重悬获得角朊细胞悬液。
根据上述技术方案，在上述步骤A.2中，将角朊细胞悬液置于预先包被IV型胶原蛋白的六孔板，以分离角朊细胞悬液并且获得贴壁的表皮干细胞。
根据上述技术方案，所述表皮干细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、血管内皮生长因子和表皮生长因子。
根据上述技术方案，在上述步骤D中，还可提取表皮干细胞分泌的胶原蛋白。
本发明公开的美容用表皮干细胞生长因子制备方法，旨在通过实验室培养表皮干细胞，提取和制备用于维持和促进表皮干细胞增殖和分化的各种细胞因子，继而应用于相应的美容产品。表皮干细胞生长因子具有纯度高、不含杂质等特点，包括：成纤维细胞生长因子（FGF）、干细胞生长因子（SCF）、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF）等，还可收集得到胶原蛋白。
具体实施方式
本发明公开了一种美容用表皮干细胞生长因子制备方法，下面结合优选实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。
优选地，所述美容用表皮干细胞生长因子制备方法包括以下步骤：
步骤A：将表皮干细胞置于细胞培养基进行传代培养；
步骤B：选择对数生长期的表皮干细胞，经1000rpm和5分钟离心处理以去处细胞培养基，获得经离心分离的表皮干细胞；
步骤C：将经离心分离的表皮干细胞使用生理盐水洗涤并稀释至1*107/ml；
步骤D：将经生理盐水稀释的表皮干细胞置于37℃，5%CO2细胞培养箱中无营养条件培养6小时，提取表皮干细胞分泌的表皮干细胞生长因子。
优选地，在上述步骤A中，所述表皮干细胞采用以下步骤制备：
步骤A.1：获取角朊细胞悬液；
步骤A.2：分离角朊细胞悬液获得表皮干细胞。
优选地，在上述步骤A.1中，所述角朊细胞悬液采用以下步骤制备：
步骤A.1.1：分离包皮的表皮和真皮层，使用胰蛋白酶消化剪碎的表皮以形成混合物；
步骤A.1.2：过滤混合物获得细胞悬液，将细胞悬液重悬获得角朊细胞悬液。
优选地，在上述步骤A.2中，将角朊细胞悬液置于预先包被IV型胶原蛋白的六孔板，以分离角朊细胞悬液并且获得贴壁的表皮干细胞。
优选地，所述美容用表皮干细胞生长因子制备方法用于制备表皮干细胞生长因子，上述表皮干细胞生长因子包括成纤维细胞生长因子（FGF）、干细胞生长因子（SCF）、血管内皮生长因子（VEGF）和表皮生长因子（EGF）。
优选地，在上述步骤D中，还可提取表皮干细胞分泌的胶原蛋白。
根据上述优选实施例，通过控制细胞生长状态和调节细胞数量来达到浓缩表皮干细胞生长因子的目的。本发明公开的美容用表皮干细胞生长因子制备方法，与现有技术相比，具有以下优势：
1：选择人源干细胞作为种子细胞，与其他物种来源的细胞相比，安全性更好。
2：与其他种类的人源干细胞相比，本发明选用表皮干细胞，表皮干细胞在皮肤的再生和修复中发挥着至关重要的作用，其分泌的各种细胞因子作用于皮肤再生，修复，去皱等，在抗衰老方面更有针对性。
3：本发明选用的表皮干细胞是通过组织分离原代培养而得，其细胞生长特性更接近于人体内的状况，细胞活性等方面更好，因此，选用原代培养的细胞所分泌的生长因子种类更丰富，浓度更高。
4：本发明选择对数生长期的表皮干细胞，不仅细胞数量能达到生产标准，大大减少细胞分泌的有害代谢产物的沉积。
5：本发明为了避免培养基因为丰富的营养而导致产品容易滋生细菌的问题，选用了无营养条件孵育的方法，大大提高了产品的纯度，同时使产品可以作为美容产品添加剂得到更广泛的应用从而带来更客观的经济效益。
6：本发明可以通过调节细胞生长状态和控制细胞数量来达到调控细胞因子浓度的目的，避免了使用蒸馏或其他的浓缩工艺带来的产品损失。此工艺不仅操作简单，同时避免后续工艺产品损失，大大提高了生产效益。
对于本领域的技术人员而言，依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。