一种对香豆酸3羟化酶及其编码基因与应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710098484.1 (22)申请日 2017.02.21 (71)申请人 江苏省中国科学院植物研究所 地址 211225 江苏省南京市溧水县白马镇 国家农业科技园江苏省中国科学院植 物研究所基地 (72)发明人 汪仁李宜奎钱彬彬徐晟 李晓丹程丽夏冰 (51)Int.Cl. C12N 9/02(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12P 7/42(2006.01) (54)发明名称 一种对香豆酸3羟化酶及其编码基因与 应用 (57)摘要 本发明涉及。

2、对香豆酸-3-羟化酶及其编码基 因与应用。 本发明首次揭示了石蒜属植物忽地笑 的对香豆酸-3-羟化酶， 其具有良好的底物专一 性和区域选择性， 可以催化对香豆酸的3位C的羟 基化生成咖啡酸。 本发明还揭示了编码所述对香 豆酸-3-羟化酶的多核苷酸， 表达所述对香豆酸- 3-羟化酶的载体与宿主细胞， 以及生产咖啡酸的 方法。 权利要求书1页 说明书7页 序列表7页 附图4页 CN 106906189 A 2017.06.30 CN 106906189 A 1.一种对香豆酸-3-羟化酶， 其特征在于， 所述的对香豆酸-3-羟化酶选自： (a)氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示的蛋白质； 或 。

3、(b)将SEQ ID NO： 1氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加而形成的， 与SEQ ID NO： 1氨基酸序列有至少75序列相同性， 且具有对香豆酸-3-羟化 酶活性的由(a)衍生的蛋白质。 2.编码权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶的多核苷酸。 所述的多核苷酸包括分离的多核苷酸， 其特征在于， 该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示。 3.一种载体， 其特征在于， 它含有权利要求2所述的多核苷酸。 4.权利要求3所述的载体的用途， 其特征在于： (a)表达权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶； 或 (b)抑制权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶。

4、的表达； 或 (c)抑制权利要求2所述的多核苷酸的表达。 5.一种宿主细胞， 其特征在于， 它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要 求2所述的多核苷酸。 6.权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶的用途， 其特征在于， 催化对香豆酸合成咖啡 酸。 7.一种表达构建物， 其特征在于， 所述表达构建物包括以下酶的基因表达盒： (a)权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶； 和 (b)细胞色素P450还原酶。 8.一种宿主细胞， 其特征在于， 所述的宿主细胞中包括权利要求7所述的表达构建物。 所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞； 所述的原核宿主细胞包括大肠杆菌、 枯草杆 菌、 运动假单胞菌和乳。

5、酸菌等， 所述的真核宿主细胞包括真菌细胞、 植物细胞、 昆虫细胞和 哺乳动物细胞等， 所述的真菌细胞包括酵母细胞； 较佳地， 所述的宿主细胞是包含有对香豆 酸-3-羟化酶的底物的细胞； 更佳地， 所述的宿主细胞是内源存在对香豆酸或其前体的细 胞。 9.权利要求7所述的表达构建物或权利要求8所述的宿主细胞的用途， 其特征在于， 催 化对香豆酸合成咖啡酸。 10.一种生产咖啡酸的方法， 其特征在于， 利用权利要求1所述的对香豆酸-3-羟化酶生 产咖啡酸。 所述的方法包括： 以权利要求3所述的载体或权利要求7所述的表达构建物转化宿主细 胞， 培养转化的宿主细胞， 合成咖啡酸； 所述的宿主细胞是原核细。

6、胞或真核细胞； 所述的原 核宿主细胞包括大肠杆菌、 枯草杆菌、 运动假单胞菌和乳酸菌等； 所述的真核宿主细胞包括 真菌细胞、 植物细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细胞等； 所述的真菌细胞包括酵母细胞； 较佳地， 该宿主细胞是包含有对香豆酸-3-羟化酶的底物的细胞； 更佳地， 该宿主细胞是内源存在对 香豆酸或其前体的细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106906189 A 2 一种对香豆酸-3-羟化酶及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术和植物生物学领域； 更具体地， 本发明涉及一种来源于石蒜 科植物的对香豆酸-3-羟化酶及其编码基因与应用。 背景技术 0002 植物细胞色。

7、素P450酶(Cytochrome P450 enzymes， CYPs)参与大量植物天然产物 的生物合成， 是天然产物生物合成的关键酶之一， 属于亚铁血红素单加氧酶超大家族， 催化 多种类型的氧化还原反应， 具有结构选择性、 区域选择性和立体选择性。 CYPs的催化活性依 赖于细胞色素P450还原酶。 细胞色素P450还原酶可以将电子供体(还原力)中的电子传递给 CYPs， 协助CYPs进行一系列的结构专一性、 区域专一性和立体专一性生物反应。 0003 对香豆酸-3-羟化酶是植物细胞色素P450酶， 属于CYP98亚家族， 催化对香豆酸3位 C的羟基化生成咖啡酸。 作为一种苯酚衍生物， 咖。

8、啡酸是植物苯丙素类天然产物， 具有抗氧 化、 抗病毒、 抗癌及抗炎等多种生物医药活性， 用于临床及医药、 食品和化妆品等行业。 在临 床上， 咖啡酸用于预防手术时出血以及出血性疾病的止血。 在医药上， 咖啡酸是一种止血升 白细胞药， 具有收缩微血管、 提高凝血因子以及升高白细胞和血小板的作用， 用于白细胞减 少症和血小板减少症等。 在化妆品中， 低浓度的咖啡酸具有抑制皮肤黑色素生成的效用。 作 为一个多功能的药效基团和平台化合物， 咖啡酸还可以衍生出大量具有医药活性的化合 物。 例如， 咖啡酸是蜂胶主要活性成分之一咖啡酸苯乙酯和金银花主要抗菌、 抗病毒有 效药理成分之一绿原酸等物质合成的前体物。

9、质， 还可以用于临床上治疗轻、 中度老年 痴呆症的药物加兰他敏的合成。 咖啡酸具有广泛的应用和需求。 0004 忽地笑(Lycoris aurea)是多年生草本球根药用植物， 属于石蒜科石蒜属， 能够合 成咖啡酸等具有重要生物活性和应用价值的大量植物天然产物。 但是， 石蒜属植物对香豆 酸-3-羟化酶及其编码基因尚未被分离与克隆。 因此， 本领域有必要开发石蒜属植物忽地笑 的对香豆酸-3-羟化酶。 该蛋白及其编码基因可通过植物转基因和异源表达的方式进行咖 啡酸的生物转化与生物合成。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种石蒜科植物的对香豆酸-3-羟化酶， 所述的对香豆酸- 3-羟化酶选自。

10、： 0006 (a)氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示的蛋白质； 或 0007 (b)将SEQ ID NO： 1氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个)氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加而形成的， 且具有对香豆酸-3-羟化酶活性的由(a)衍生的蛋白质； 或 0008 (c)与SEQ ID NO： 1氨基酸序列有至少75序列相同性， 且具有对香豆酸-3-羟化 酶活性的由(a)衍生的蛋白质。 0009 本发明SEQ ID NO： 1所示的蛋白质是从忽地笑(Lycoris aurea)中分离得到的一 种新的对香豆酸-3-羟化酶(p-Coumaric acid-3-Hydroxylase)。。

11、 为便于表述， 将SEQ ID 说明书 1/7 页 3 CN 106906189 A 3 NO： 1所示的蛋白质命名为LaC3H。 0010 在一个优选例中， 所述的对香豆酸-3-羟化酶活性是指以对香豆酸为底物合成咖 啡酸。 0011 在另一个优选例中， 所述的序列(c)还包括： 由(a)或(b)添加了标签序列、 信号序 列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。 0012 本发明的另一目的在于提供分离的多核苷酸， 该多核苷酸是编码所述对香豆酸- 3-羟化酶的多核苷酸。 0013 在一个优选例中， 该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示。 0014 应理解， 考虑到密码子的简并性以及不。

12、同物种密码子的偏好性， 本领域技术人员 可以根据需要使用合适特定物种表达的密码子。 因而， 本发明对香豆酸-3-羟化酶的多核苷 酸还包括由SEQ ID NO： 2所示核苷酸序列经取代和/或缺失和/或增加一个或几个核苷酸， 得到的编码具有对香豆酸-3-羟化酶活性的核苷酸序列。 0015 本发明的又一目的是提供一种载体， 它含有所述的多核苷酸。 所述的载体是将本 发明的编码所述对香豆酸-3-羟化酶的多核苷酸与表达载体可操作地连接， 得到能够表达 本发明所述对香豆酸-3-羟化酶的重组表达载体或抑制本发明所述对香豆酸-3-羟化酶编 码多核苷酸表达的基因沉默载体。 0016 在一个优选例中， 该载体是含。

13、有编码所述对香豆酸-3-羟化酶的SEQ ID NO： 2所示 序列的重组表达载体pET28a-LaC3H。 0017 在另一个优选例中， 该载体是含有编码所述对香豆酸-3-羟化酶的SEQ ID NO： 2所 示序列中第88-1518位多核苷酸的重组表达载体pET28a-LaC3H(N29)。 0018 本发明的又一目的是提供一种宿主细胞， 它含有所述的载体或基因组中整合有所 述的多核苷酸。 所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。 常用的原核宿主细胞包括大肠杆 菌、 枯草杆菌、 运动假单胞菌和乳酸菌等； 常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、 植物细胞、 昆 虫细胞和哺乳动物细胞等。 所述的真菌细胞包括。

14、酵母细胞。 将所述的重组表达载体或者基 因沉默载体导入所述的适当宿主细胞中， 获得表达本发明所述对香豆酸-3-羟化酶的基因 工程菌株、 转基因细胞系、 转基因愈伤、 转基因组织、 转基因植株或者基因工程植株。 0019 本发明的又一目的是提供所述的对香豆酸-3-羟化酶的用途， 用于合成咖啡酸。 0020 在一个优选例中， 所述的底物是对香豆酸。 0021 本发明的又一目的是提供一种表达构建物。 所述表达构建物包括以下酶的编码基 因和/或基因表达盒： 0022 (a)所述的对香豆酸-3-羟化酶； 和 0023 (b)细胞色素P450还原酶； 和/或 0024 (c)对香豆酸-3-羟化酶底物的生物。

15、合成酶。 0025 所述基因表达盒是酶在宿主细胞中表达与调控所需要的生物学元件， 包括启动 子、 增强子、 衰减子、 核糖体结合位点、 Kozak序列、 内含子和/或转录终止子等； 此外， 还可包 括标签编码序列和/或信号(肽)编码序列等。 0026 在一个优选例中， 所述的表达构建物还包括： 细胞色素P450还原酶(CPR)的编码基 因。 0027 在另一个优选例中， 所述的表达构建物还包括： 细胞色素P450还原酶(CPR)的编码 说明书 2/7 页 4 CN 106906189 A 4 基因、 反式肉桂酸-4-羟化酶的编码基因和苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)的编码基因。 0028 在另一个。

16、优选例中， 当转化大肠杆菌细胞时， 所述的表达构建物中， 还包含大肠杆 菌启动子、 大肠杆菌核糖体结合位点和/或大肠杆菌转录终止子等基因表达盒。 0029 本发明的又一目的是提供一种宿主细胞。 所述的宿主细胞中包括所述的表达构建 物。 所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。 常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、 枯草杆 菌、 运动假单胞菌和乳酸菌等； 常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、 植物细胞、 昆虫细胞和 哺乳动物细胞等。 较佳地， 所述的宿主细胞是内源存在对香豆酸-3-羟化酶的底物或其底物 前体的细胞。 0030 本发明的又一目的是提供所述的表达构建物的用途， 用于合成咖啡酸。 0031 本发明。

17、的又一目的是提供一种生产咖啡酸的方法。 0032 在一个优选例中， 所述方法包括： 以所述的表达构建物转化宿主细胞， 利用转化的 宿主细胞催化对香豆酸合成咖啡酸； 所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞。 常用的原核 宿主细胞包括大肠杆菌、 枯草杆菌、 运动假单胞菌和乳酸菌等； 常用的真核宿主细胞包括真 菌细胞、 植物细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细胞等。 所述的真菌细胞包括酵母细胞。 0033 在另一个优选例中， 所述方法包括： 以所述的表达构建物转化宿主细胞， 培养转化 的大肠杆菌细胞， 利用简单的碳水化合物(葡萄糖)合成咖啡酸。 该宿主细胞是包含有对香 豆酸-3-羟化酶的底物的细胞； 较佳地， 。

18、该宿主细胞是内源存在对香豆酸或其前体的细胞。 0034 本发明首次揭示了石蒜科植物忽地笑来源的对香豆酸-3-羟化酶LaC3H， 其具有良 好的底物专一性和区域选择性。 本发明还揭示了编码所述对香豆酸-3-羟化酶的多核苷酸、 表达所述对香豆酸-3-羟化酶的表达载体及宿主细胞。 本发明应用石蒜科植物来源的对香 豆酸-3-羟化酶， 可以进行植物天然产物咖啡酸的生物转化以及生物合成。 附图说明 0035 图1是引物对SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO： 4的聚合酶链式反应(PCR)扩增产物的琼 脂糖凝胶电泳检测结果。 0036 图2是重组表达载体pET28a-LaC3H的菌落PCR验证电泳图。

19、(引物为T7和T7ter)。 0037 图3是重组表达载体pET28a-LaC3H(N29)的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和 T7ter)。 0038 图4是重组表达载体pET28a-CPR-LaC3H的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和SEQ ID NO： 10)。 0039 图5是重组表达载体pET28a-CPR-LaC3H(N29)的菌落PCR验证电泳图(引物为T7 和SEQ ID NO： 10)。 0040 图6是重组表达载体pET28a-CPR的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和T7ter)。 0041 图7是重组菌株EcR-LaC3H、 EcR-CPR、 EcR-CPR-LaC。

20、3H和EcR-CPR-LaC3H(N29)生 物转化图。 0042 图8是重组表达载体pACYC184-CPR的菌落PCR验证电泳图(引物为T7和T7ter)。 0043 图9是重组表达载体pACYC184-CPR-C4H的菌落PCR验证电泳图(引物为SEQ ID NO： 19和T7ter)。 0044 图10是重组表达载体pET28a-CPR-LaC3H(N29)-rbsPAL的菌落PCR验证电泳图 说明书 3/7 页 5 CN 106906189 A 5 (引物为SEQ IDNO： 17和T7ter)。 0045 图11是重组菌株Ec31884-CPR-LaC3H(N29)-C4H-PAL。

21、发酵生产咖啡酸的产量图。 具体实施方式 0046 以下结合具体实施例并附图， 进一步阐述本发明。 0047 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。 在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0048 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0049 实施例1、 对香豆酸-3-羟化酶LaC3H编码基因的克隆 0050 合成两条引物分别具有序列表中SEQ ID NO： 3、 SEQ ID NO： 4的核苷酸序列。 0051 以从忽地笑中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板。

22、， 利用如上两条引物SEQ ID NO： 3和SEQ ID NO： 4进行PCR。 DNA聚合酶选用南京诺唯赞生物科技有限公司的 Super-Fidelity DNA聚合酶。 PCR扩增程序为： 955min； 9445s， 5645s， 722min， 共30 个循环； 7210min， 降至10。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 结果如图1。 0052 在紫外灯照射下， 切下目标DNA条带。 然后采用多功能DNA纯化试剂盒(离心柱型) (北京百泰克生物技术有限公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的对香豆酸-3-羟化 酶编码基因的DNA片段。 利用宝生物工程(大连)有限公司(TaKaR。

23、a)的pMD19-T克隆试剂盒， 将回收的PCR产物克隆到pMD19-T载体， 所构建的载体命名为pMDT-LaC3H。 经测序获得LaC3H 的编码基因序列。 0053 LaC3H编码基因具有序列表中SEQ ID NO： 2的核苷酸序列。 自SEQ ID NO： 2的5 -端 第1-1518位核苷酸为LaC3H的开放阅读框(Open Reading Frame， ORF)， 自SEQ ID NO： 2的 5， -端的第1-3位核苷酸为LaC3H编码基因的起始密码子ATG， 自SEQ ID NO： 2的5 -端的第 1516-1518位核苷酸为LaC3H编码基因的终止密码子TAA。 对香豆酸-。

24、3-羟化酶编码基因编码 一个含有505个氨基酸的蛋白质LaC3H， 具有SEQ ID NO： 1的氨基酸序列， 用软件预测到该蛋 白质的理论分子量大小为57.7KDa， 等电点pI为8.70。 0054 实施例2、 LaC3H基因的重组表达载体的构建 0055 (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 5和SEQ ID NO： 7核苷酸序列的两条引物。 在合成的引物SEQ ID NO： 5和SEQ ID NO： 7的5 -端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其 保护碱基序列， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR扩增产物 经琼脂糖凝胶电泳检测。

25、、 分离、 切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切， 利用宝生物工程(大连)有 限公司(TaKaRa)的T4DNA连接酶连接同样经NdeI和XhoI双酶切的pET28a载体(Novagen)中。 连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5 (购自南京诺唯赞生物科技有限公司)感受态细胞， 并 涂布于添加25 g/mL卡那霉素的LB平板上。 通过菌落PCR验证获得阳性转化子， 菌落PCR产物 的琼脂糖电泳结果如图2。 通过测序进一步验证重组质粒pET28a-NdeI-LaC3H-XhoI构建成 功， 并在NdeI和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO： 2的全长多核苷酸序列。 所获得的重组质 。

26、粒命名为pET28a-LaC3H。 0056 (2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 7核苷酸序列的两条引物。 在合成的引物SEQ ID NO： 6和SEQ ID NO： 7的5 -端分别设置NdeI和XhoI两个酶切位点及其 说明书 4/7 页 6 CN 106906189 A 6 保护碱基序列， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR扩增产物 经琼脂糖凝胶电泳检测、 分离、 切胶回收后经NdeI和XhoI双酶切， 利用T4DNA连接酶(购自宝 生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)连接同样经NdeI和XhoI双酶切的。

27、pET28a载体 (Novagen)中。 连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5 (购自南京诺唯赞生物科技有限公司) 感受态细胞， 并涂布于添加卡那霉素(终浓度为25 g/mL)的LB平板上。 通过菌落PCR验证阳 性转化子， 菌落PCR产物的琼脂糖电泳结果如图3。 测序进一步验证重组质粒pET28a-NdeI- LaC3H(N29)-XhoI构建成功， 并在NdeI和XhoI酶切位点之间含有SEQ ID NO： 2多核苷酸序 列中88-1518位核苷酸。 所获得的重组质粒命名为pET28a-LaC3H(N29)。 0057 实施例3、 LaC3H和LaC3H(N29)功能性表达载体的构建。

28、 0058 (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 9核苷酸序列的两条引物， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-LaC3H载体NdeI酶 切位点两侧同源的序列。 利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司 (TaKaRa)将pET28a-LaC3H载体线性化。 利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生 物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a-LaC3H载体。

29、的NdeI酶切位点 中， 利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ IDNO： 10核苷酸序列的引物进行菌落 PCR验证， 获得重组表达质粒pET28a-CPR-LaC3H， 结果如图4。 进一步测序证实重组质粒中 CPR和LaC3H进行了基因的融合表达。 0059 (2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 11核苷酸序列的两条引物， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-LaC3H(N29)载 体NdeI酶切位。

30、点两侧同源的序列。 利用NdeI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公 司(TaKaRa)将pET28a-LaC3H(N29)载体线性化。 利用One-step cloning试剂盒(购自南 京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a-LaC3H(N29)载 体的NdeI酶切位点中， 利用通用测序引物T7与合成的具有序列表中SEQ ID NO： 10核苷酸序 列的引物进行菌落PCR验证， 获得重组表达质粒pET28a-CPR-LaC3H(N29)， 结果如图5。 进 一步测序证实重组质粒中CPR和LaC3H(N29)进行了基因的融合表达。 0060 (3)合成。

31、分别具有序列表中SEQ ID NO： 8和SEQ ID NO： 12核苷酸序列的两条引物， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增CPR编码基因。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a载体NdeI酶切位点 上游、 XhoI酶切位点下游同源的序列。 利用NdeI和XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大 连)有限公司(TaKaRa)将pET28a载体线性化。 利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺 唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将CPR编码基因导入pET28a载体的NdeI和XhoI酶。

32、 切位点间， 利用通用测序引物T7与T7ter进行菌落PCR验证， 获得重组表达质粒pET28a-CPR， 结果如图6。 0061 实施例4、 LaC3H催化对香豆酸合成咖啡酸 0062 (1)配制培养基。 诱导培养基(1L)： 31g Na2HPO4， 15g KH2PO4， 2.5g NaCl， 5.0g NH4Cl， 0.24g MgSO4， 0.01g CaCl2， 10g Glucose， 1mL微量元素母液。 生物转化培养基(1L)： 31g Na2HPO4， 15g KH2PO4， 2.5g NaCl， 0.24g MgSO4， 0.01g CaCl2， 20g Glucose，。

33、 1mL微量元 说明书 5/7 页 7 CN 106906189 A 7 素母液。 微量元素母液配方为(1L)： 0.15mM(NH4)6Mo7O24， 20.0mM H3BO3， 1.5mM CoCl2， 0.5mM CuSO4， 4.0mM MnCl2， 0.5mM ZnSO4， 100mM HCl。 0063 (2)将重组质粒pET28a-LaC3H、 pET28a-CPR、 pET28a-CPR-LaC3H和pET28a-CPR- LaC3H(N29)分别转化进入大肠杆菌Rosseta(DE3)细胞， 获得重组菌株Rosseta(DE3)/ pET28a-LaC3H、 Rosseta(。

34、DE3)/pET28a-CPR、 Rosseta(DE3)/pET28a-CPR-LaC3H和Rosseta (DE3)/pET28a-CPR-LaC3H(N29)， 分别命名为菌株EcR-LaC3H、 EcR-CPR、 EcR-CPR-LaC3H和 EcR-CPR-LaC3H(N29)。 每个菌株各挑取单克隆接种添加卡那霉素(终浓度为25 g/ml)的 LB培养基于37、 200rpm过夜培养。 0064 (3)将过夜培养菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25 g/mL)的50mL诱导培 养基中培养。 待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8时， 加入诱导剂异丙基- -D-硫。

35、代 半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导培养， 诱导时间为12h， 诱导温度为25。 0065 (4)收集诱导12h的细菌培养液于8000rpm、 4离心5min， 弃上清后用40mL生物转 化培养基洗涤菌体1次。 菌体用40ml生物转化培养基重悬后全部转移到250ml无菌三角瓶 中， 加入对香豆酸(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)二甲基亚砜(DMSO)母液至终浓 度为100 M， 于25、 250rpm震荡培养48h。 0066 (5)取生物转化液1ml于4冻融， 加入等体积的甲醇， 振荡混匀。 室温下， 12000rpm， 离心5min。 取上清用0.22 m孔。

36、径滤膜过滤， 滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行 分析。 分析条件为： 采用LC-20A高效液相色谱仪(岛津， 日本)， InertSustain C18色谱柱(5 m， 4.6mm250mm)， 30柱温， 二极管阵列检测器， 278nm和314nm波长， 10 l进样量， 1.5 (v/v)乙酸水溶液为流动相A， 100乙腈为流动相B， 0.9mL/min流速， 梯度洗脱。 分析结果如 图7， 结果表明： 在CPR的存在下， LaC3H和LaC3H(N29)能够催化底物对香豆酸合成产物咖 啡酸。 0067 实施例5、 重组大肠杆菌Ec31884-CPR-LaC3H(N29)-C4H-P。

37、AL的构建 0068 (1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 13和SEQ ID NO： 14核苷酸序列的两条引 物， 以重组质粒pET28a-CPR为模板进行PCR扩增T7-RBS-CPR-T7ter操纵子片段。 PCR扩增程 序为： 955min； 9445s， 5645s， 723.5min， 共30个循环； 7210min， 降至10。 PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pACYC184载体 (购自New England Biolabs)EcoRI酶切位点两侧同源的序列。 利用EcoRI限制性内切酶(购 自宝生物工程(大连)有。

38、限公司(TaKaRa)将pACYC184载体线性化。 利用One-step cloning 试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将T7-RBS-CPR-T7ter片段导 入pACYC184载体的EcoRI酶切位点中， 利用合成的通用测序引物T7和T7ter进行菌落PCR验 证， 获得重组表达质粒pACYC184-CPR， 结果如图8。 进一步测序证实重组质粒中T7-RBS-CPR- T7ter片段的序列正确。 0069 (2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 15和SEQ ID NO： 16核苷酸序列的两条引 物， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增C4H编码基因。

39、。 PCR扩增程序同实施例1。 PCR产物经 琼脂糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pACYC184-CPR载体 XhoI酶切位点两侧同源的序列。 利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司 (TaKaRa)将pACYC184-CPR载体线性化。 利用One-step cloning试剂盒(购自南京诺唯赞生 物科技有限公司)按照产品说明书将C4H编码基因导入pACYC184-CPR载体的XhoI酶切位点 说明书 6/7 页 8 CN 106906189 A 8 中， 利用合成的具有序列表中SEQ ID NO： 19核苷酸序列的引物与通用测序引物T。

40、7ter进行 菌落PCR验证， 获得重组表达质粒pACYC184-CPR-C4H， 结果如图9。 进一步测序证实重组质粒 中CPR和C4H进行了基因的融合表达。 0070 (3)合成分别具有序列表中SEQ ID NO： 17和SEQ ID NO： 18核苷酸序列的两条引 物， 以忽地笑的cDNA为模板进行PCR扩增苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)编码基因。 PCR扩增程序 为： 955min； 9445s， 5645s， 723.5min， 共30个循环； 7210min， 降至10。 PCR产物 经琼脂糖凝胶电泳分离、 回收。 回收获得的DNA片段两端分别带有25bp与pET28a-CPR-La。

41、C3H (N29)载体XhoI酶切位点两侧同源的序列， 并且PAL基因起始密码子上游12bp处添加了核 糖体结合位点(rbs)序列(AGGAG)。 利用XhoI限制性内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公 司(TaKaRa)将pET28a-CPR-LaC3H(N29)载体线性化。 利用One-step cloning试剂盒(购 自南京诺唯赞生物科技有限公司)按照产品说明书将PAL编码基因导入pET28a-CPR-LaC3H (N29)载体的XhoI酶切位点中， 利用合成的具有序列表中SEQ ID NO： 17核苷酸序列的引 物与通用测序引物T7ter进行菌落PCR验证， 获得重组表达质粒pET2。

42、8a-CPR-LaC3H(N29)- rbsPAL， 结果如图10。 进一步测序证实重组质粒中PAL与CPR-LaC3H(N29)形成了多顺反子 基因结构。 0071 (4)利用 DE3溶原化试剂盒(购自Novagen)按照试剂盒说明书操作， 将 DE3原噬菌 体插入到大肠杆菌苯丙氨酸生产菌株ATCC31884(购自ATCC)基因组中， 获得溶原化的宿主 菌株大肠杆菌ATCC31884(DE3)。 0072 (5)将重组质粒pACYC184-CPR-C4H和pET28a-CPR-LaC3H(N29)-rbsPAL共转化进 入大肠杆菌ATCC31884(DE3)细胞， 获得重组菌株ATCC318。

43、84(DE3)/pACYC184-CPR-C4H& pET28a-CPR-LaC3H(N29)-rbsPAL， 命名为菌株Ec31884-CPR-LaC3H(N29)-C4H-PAL。 0073 实施例6、 重组大肠杆菌Ec31884-CPR-LaC3H(N29)-C4H-PAL发酵合成咖啡酸 0074 (1)配制发酵培养基(1L)： 31g Na2HPO4， 15g KH2PO4， 2.5g NaCl， 5.0g NH4Cl， 0.24g MgSO4， 0.01g CaCl2， 30g Glucose， 1mL微量元素母液。 微量元素母液配方同实施例4。 0075 (2)挑取菌株Ec3188。

44、4-CPR-LaC3H(N29)-C4H-PAL单克隆接种添加卡那霉素(终 浓度为25 g/ml)和四环素(终浓度为12.5 g/ml)的LB培养基于37、 200rpm过夜培养。 0076 (3)将过夜培养菌液按100倍稀释于含卡那霉素(终浓度为25 g/mL)和四环素(终 浓度为12.5 g/ml)的50mL发酵培养基中培养。 待菌液生长至600nm波长下吸光度为0.6-0.8 时， 加入诱导剂异丙基- -D-硫代半乳糖苷(IPTG)(终浓度为0.1mmol/L)进行诱导。 培养温 度转变为25， 发酵时间为72h。 0077 (4)取发酵液1ml于4冻融， 加入等体积的甲醇， 振荡混匀。。

45、 室温下， 12000rpm， 离 心5min。 取上清用0.22 m孔径滤膜过滤， 滤液上样高效液相色谱仪(HPLC)进行分析。 分析条 件同实施例4。 分析结果如图11， 结果表明： 所构建的大肠杆菌菌株能够合成咖啡酸， 产物的 量为350mg/L。 可以理解为， 基于能够合成LaC3H的底物及其上游代谢产物的微生物菌株， 在 分子伴侣CPR的存在下， LaC3H(N29)能够进行咖啡酸的生物合成。 0078 此外应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作 各种改动或修饰， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 说明书 7/7 页 9 CN 1。

46、06906189 A 9 0001 序列表 1/7 页 10 CN 106906189 A 10 0002 序列表 2/7 页 11 CN 106906189 A 11 0003 序列表 3/7 页 12 CN 106906189 A 12 0004 序列表 4/7 页 13 CN 106906189 A 13 0005 序列表 5/7 页 14 CN 106906189 A 14 0006 序列表 6/7 页 15 CN 106906189 A 15 0007 序列表 7/7 页 16 CN 106906189 A 16 图1 图2 图3 图4 说明书附图 1/4 页 17 CN 106906189 A 17 图5 图6 图7 说明书附图 2/4 页 18 CN 106906189 A 18 图8 图9 图10 说明书附图 3/4 页 19 CN 106906189 A 19 图11 说明书附图 4/4 页 20 CN 106906189 A 20 。