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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510866523.9 (22)申请日 2015.12.02 C12P 7/18(2006.01) C12P 7/58(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 曹海龙 尹恒 李曙光 王文霞 陈玮 赵勇 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种生物法联产甘露醇与葡萄糖酸或葡萄糖 酸盐的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用生物法联产甘露醇和 葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。该方法以。
2、蔗糖或 葡萄糖和果糖的混合溶液为原料， 在有或无蔗糖 酶情况下， 利用 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶与 NAD(P)H 依赖的葡萄糖脱氢酶构成的生物催化体 系催化生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐。本 发明提供的甘露醇及葡萄糖酸或葡萄糖酸盐生产 方法具有原料廉价、 反应选择性高等特点， 是一种 新的联产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的制备 反应路线。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 106811488 A 2017.06.09 CN 106811488 A 1/1 页 2 1.一种生物法联产甘露醇。
3、与葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法， 其特征在于 ： 以葡萄糖和 果糖的混合溶液为原料， 采用氧化还原酶及辅酶构成的生物催化体系 ； 或， 以蔗糖原料， 采用蔗糖酶、 氧化还原酶及辅酶构成的生物催化体系 ； 在有或无金属 阳离子的条件下， 催化生产甘露醇与葡萄糖酸或葡萄糖酸盐 ； 氧化还原酶为 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢 酶和 NAD(P)H 依赖的葡萄糖脱氢酶。 2.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的蔗糖酶， 于水体系中用量 100U/ L-100000U/L， 酶学分类号为 EC3.2.1.26， 选自但不限于曲霉菌属来源的蔗糖酶、 青霉菌属 来源的蔗糖酶、 酵母菌属来源。
4、的蔗糖酶中的一种或二种。 3.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶包括 NADH 依赖的甘露醇脱氢酶或 NADPH 依赖的甘露醇脱氢酶中的一种或二种， 于水体系中用量 分别为100U/L-1000000U/L， 酶学分类号为EC1.1.1.138和EC1.1.1.67， 选自但不限于蘑菇 属来源的甘露醇脱氢酶、 假丝酵母属来源的甘露醇脱氢酶、 乳杆菌属来源的甘露醇脱氢酶、 明串珠菌属来源的甘露醇脱氢酶、 假单胞菌属来源的甘露醇脱氢酶中的一种或二种以上。 4.如权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述的NAD(P) +依赖型的葡萄糖脱氢酶包。
5、括 NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶或 NADP +依赖型的葡萄糖脱氢酶中的一种或二种， 于水体系中 用量 100U/L-1000000U/L， 酶学分类号为 EC1.1.1.118、 EC1.1.1.119， 选自但不限于芽孢杆 菌属来源的葡萄糖脱氢酶、 假单胞菌属来源的葡萄糖脱氢酶、 葡糖杆菌属来源的葡萄糖脱 氢酶中的一种或二种以上。 5.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述辅酶为 NADH 或 NAD +中的一种或二种， 以及 NADPH 或 NADP+中的一种或二种 ； 体系中 NADH 和 NAD +的量 5mM-500mM， 体系中 NADPH 和 NADP+的量 5mM。
6、-500mM。 6.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 于水体系中， 蔗糖、 葡萄糖或果糖的终质量 浓度为 0.5-40， 反应 pH 为 4.0-9.0， 反应温度为 10-60 度。 7.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的生物催化体系可以为表达有蔗糖酶、 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶和 NAD(P)+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶的一种或二种以上的细 胞， 及利用细胞内NADH、 NAD+、 NADPH和NADP+， 以及细胞自身代谢再生NAD+为NADH或NADP+ 为 NADPH 的细胞自身代谢辅酶再生系统， 组成的生物催化体系 ； 或者， 所述的生物催化体系可。
7、以为不依赖活体细胞的蔗糖酶、 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱 氢酶、 NAD(P)+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶及 NADH、 NAD+、 NADPH 和 NADP+ 组成的生物催化体系。 8.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于所述的金属阳离子为钙、 钠、 钾、 锌、 ( 亚 ) 铁 离子中的一种或两种以上。 9.如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的葡萄糖酸盐为葡萄糖酸钙、 葡萄糖酸 钠、 葡萄糖酸钾、 葡萄糖酸锌或葡萄糖酸 ( 亚 ) 铁等中的一种或二种以上。 权 利 要 求 书 CN 106811488 A 2 1/4 页 3 一种生物法联产甘露醇与葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方。
8、法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体地说， 是关于一种联产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄 糖酸盐的生产方法。 背景技术 0002 甘露醇是一种天然存在的六元糖醇， 在食品、 医药、 化工和轻工等领域具有广泛应 用。目前， 甘露醇主要由化学法或海带提取法生产。由于， 现有的甘露醇生产方法成本及耗 能较高。近年来， 具有高选择性、 低耗能等优点的微生物发酵生产甘露醇的方法广受关注 (参考文献1Ghoreishi SM,Shahrestani RG.Innovative strategies for engineering mannitol production.Trends in Foo。
9、d Science&Technology,2009,20:263270)。 0003 自然界中许多微生物可以利用碳水化合物合成甘露醇， 如球拟酵母菌属 (Torulopsis)、 假丝酵母菌属 (Candida)、 接合酵母菌属 (Zygosaccharomyces)、 亮白曲霉 (Aspergillus candidus)、 产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、 斜卧青霉(Penicillium decumbens)、 粗 糙 青 霉 (Penicillium scabrosum)、 黑 曲 霉 (Aspergills niger)、 乳 酸 乳球菌 (Lactoco。
10、ccus lactis)、 布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)， 发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)， 旧金山乳杆菌 (Lactobacillus sanfranciscensis)， 中间乳 杆菌 (Lactobacillus intermedius)， 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides) 和假 肠膜明串珠菌 (Leuconostoc pseudomesenteroides) 等 ( 参考文献 2， Saha BC,Racine FM.Biotechnological production of mann。
11、itol and its applications.Applied Microbiology and Biotechnology.2011,89(4):879-91.)。然而， 利用生物发酵法生产甘 露醇的技术路线， 葡萄糖被转化为廉价的乙酸和乳酸， 同时提供能量参与果糖向甘露醇的 转化， 且分离过程需要耗费较高的成本。 0004 近年来， 利用全细胞催化或多酶协同催化体系进行甘露醇的生产的研究受到广 泛重视。Kaup 等人构建了表达有甘露醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的大肠杆菌全细胞催化剂， 以果糖和甲酸为底物， 实现了甘露醇的高效生产 (Kaup,et al.,Metabolic engineeri。
12、ng of Escherichia coli:construction of an efficient biocatalyst for D-mannitol formation in a whole-cell biotransformation.Commun Agric Appl Biol Sci.2003 ； 68(2Pt A):235-40.)。随后， 以甘露醇脱氢酶和甲酸脱氢酶为核心构建的多酶协同催化体 系成功应用于肠膜眀串珠菌、 谷氨酸棒杆菌等微生物中， 实现了甘露醇的高效生产。 该方法 与发酵法相比， 终反应体系中只含有甘露醇， 另外的产物二氧化碳被排放到大气中。因此， 其分离工业更。
13、为简单。然而， 该方法利用甲酸或甲酸盐为其中的一个底物， 并产生二氧化 碳， 不仅不利于环境且造成了原料的浪费。 0005 由于， 目前的酶催化路线的局限性， 还需要对该体系进行巨大的改进。 葡萄糖脱氢 酶在辅酶 NAD+或 NADP +的作用下具有将催化葡萄糖生成葡萄糖酸内酯的活性， 该反应过程 中葡萄糖酸内酯可自发的进一步转化为葡萄糖酸。Kim 等人， 曾利用酵母来源的 Reductase YOR120W 与枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶构建了一个用于首先醇的反应体系， 转化率 说 明 书 CN 106811488 A 3 2/4 页 4 可达到 78.5 (Shin Ah Yoon an。
14、d Hyung Kwoun Kim， Development of a Bioconversion System Using Saccharomyces cerevisiae Reductase YOR120W and Bacillus subtilis Glucose Dehydrogenase for Chiral Alcohol Synthesis,J.Microbiol.Biotechnol. (2013),23(10),13951402)。 目前， 尚未有报道利用葡萄糖脱氢酶与甘露醇脱氢酶构成的 双酶催化体系应用于甘露醇合成的报道。因此， 建立葡萄糖脱氢酶与甘露醇脱氢酶构成的 双酶协。
15、同催化体系， 对于转化含有葡萄糖和果糖的原料， 生产高值的甘露醇和葡萄糖酸具 有重大意义。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种联产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生产方法。 0007 本发明以蔗糖为原料， 或葡萄糖和果糖为原料， 在有或无金属离子的条件下， 利用 蔗糖酶、 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶、 NAD(P)+依赖型的葡萄糖脱氢酶构成的生物催化体 系催化生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐。 0008 具体的， 采用蔗糖为底物时， 通过蔗糖酶的作用， 将蔗糖转化为葡萄糖和果糖 ； 果 糖在 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶 (EC 1.1.1.138 或 EC 1.1.1.。
16、67) 及辅酶 NADH 或 NADPH 的作用下， 生成甘露醇和 NAD(P)+， 产生的 NAD(P)+在 NAD(P) +依赖型的葡萄糖脱氢酶 (EC 1.1.1.118、 EC 1.1.1.119) 的作用下， 生成 NAD(P)H， 并将葡萄糖转化成葡萄糖酸 ； 葡萄糖 酸可进一步与体系中的金属盐进行反应， 生成相应的葡萄糖酸盐 ； 以葡萄糖和果糖为底物 时， 果糖在 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶 (EC 1.1.1.138 或 EC 1.1.1.67) 及辅酶 NADH 或 NADPH 的作用下， 生成甘露醇和 NAD(P)+， 产生的 NAD(P)+在 NAD(P) +依赖。
17、型的葡萄糖脱氢酶 (EC 1.1.1.118、 EC 1.1.1.119) 的作用下， 生成 NAD(P)H， 并将葡萄糖转化成葡萄糖酸 ； 葡 萄糖酸可进一步与体系中的金属盐进行反应， 生成相应的葡萄糖酸盐。 0009 本发明提供的联产甘露醇和葡萄糖酸及葡萄糖酸盐的生产方法， 所述的蔗糖酶， 酶学分类号为 EC3.2.1.26， 选自但不限于曲霉菌属来源的蔗糖酶、 青霉菌属来源的蔗糖酶、 酵母菌属来源的蔗糖酶中的一种或二种。所述的 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶， 酶学分类 号为 EC1.1.1.138 或 EC1.1.1.67， 选自但不限于蘑菇属来源的甘露醇脱氢酶、 假丝酵母属 来源。
18、的甘露醇脱氢酶、 乳杆菌属来源的甘露醇脱氢酶、 明串珠菌属来源的甘露醇脱氢酶、 假单胞菌属来源的甘露醇脱氢酶 ； 所述的 NAD(P)+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶， 酶学分类号为 EC1.1.1.118、 EC1.1.1.119， 选自但不限于芽孢杆菌属来源的葡萄糖脱氢酶、 假单胞菌属来 源的葡萄糖脱氢酶、 葡糖杆菌属来源的葡萄糖脱氢酶中的一种或二种。所述的金属阳离子 为钙、 钠、 钾、 锌、 ( 亚 ) 铁离子中的一种或两种以上 0010 具体地， 所述的以蔗糖或葡萄糖和果糖为原料生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄 糖酸盐的生物催化体系为表达有蔗糖酶 (EC3.2.1.26， )、 NAD(P)H 依赖。
19、的甘露醇脱氢 酶 (EC1.1.1.138 或 EC1.1.1.67)、 NAD(P)+依 赖 型 的 葡 萄 糖 脱 氢 酶 (EC1.1.1.118 或 EC1.1.1.119) 的一种或多种细胞， 及利用细胞内 NADH、 NAD+、 NADPH 和 NADP+， 以及细胞自身 代谢再生 NAD+为 NADH 或 NADP +为 NADPH 的细胞自身代谢辅酶再生系统， 组成的生物催化体 系。或者， 以蔗糖或葡萄糖和果糖为原料生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的所述的生 物催化体系可以为不依赖活体细胞的蔗糖酶、 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶、 NAD(P)+依赖 型的葡萄糖脱氢酶及 。
20、NADH、 NAD+、 NADPH 和 NADP+， 组成的生物催化体系。 说 明 书 CN 106811488 A 4 3/4 页 5 0011 该技术路线以廉价的蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物为原料， 可在反应体系中实现 葡萄糖向葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的高效转化， 同时实现果糖向甘露醇的高效转化。 附图说明 0012 图 1 反应原理图。 具体实施方式 0013 以下结合具体实施例， 对本发明做进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。 0014 如图 1 所示， 本发明的甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的生产方法， 以蔗糖或葡 萄糖和果糖为底物， 通过由蔗糖酶、。
21、 NAD(P)H 依赖的甘露醇脱氢酶、 NAD(P)+依赖型的葡萄糖 脱氢酶和辅酶构成的生物催化体系催化生产甘露醇和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐。 0015 实施例 1 0016 于 1L 水体系中， 葡萄糖的终质量浓度为 10， 果糖的终质量浓度为 10， 烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸(NADP+)的终浓度为100mM， 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的 终浓度为100mM， 氯化钙浓度为0.6M， 反应pH为7.0， 反应温度为30度， Agaricus bisporus 来源的 NADPH 依赖型的甘露醇脱氢酶的量 1000U/L， Gluconobacter oxydans 来源的 N。
22、ADP+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶的量 10000U/L， 反应 12h， 反应体系中甘露醇浓度为 7.9， 葡萄糖 酸钙 74g。 0017 实施例 2 0018 于 1L 水体系中， 蔗糖的终质量浓度为 10， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 的终 浓度为 100mM， 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 的终浓度为 100mM， 氯化钙浓度 为 0.6M， 反应 pH 为 7.0， 反应温度为 30 度， 蔗糖酶的量为 300U/L， Agaricus bisporus 来源 的 NADPH 依赖型的甘露醇脱氢酶的量 1000U/L， Gluconobacter oxydan。
23、s 来源的 NADP+依赖 型的葡萄糖脱氢酶的量 10000U/L， 反应 12h， 反应体系中甘露醇浓度为 3.9， 葡萄糖酸钙 31g。 0019 实施例 3 0020 于 1L 水体系中， 葡萄糖的终质量浓度为 10， 果糖的终质量浓度为 10， 烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 的终浓度为 100mM， 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADH) 的 终浓度为 100mM， 氯化钙浓度为 0.6M， 反应 pH 为 7.0， 反应温度为 30 度， Lactobacillus brevis 来源的 NADH 依赖型的甘露醇脱氢酶的量 1000U/L， Bacillus subti。
24、lis 来源的 NAD+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶的量 10000U/L， 反应 12h， 反应体系中甘露醇浓度为 8.4， 葡萄糖 酸钙 87g。 0021 实施例 4 0022 于 1L 水体系中， 葡萄糖的终质量浓度为 10， 果糖的终质量浓度为 10， 烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 的终浓度为 100mM， 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADH) 的 终浓度为 100mM， 氯化锌浓度为 0.6M， 反应 pH 为 7.0， 反应温度为 30 度， Lactobacillus brevis 来源的 NADH 依赖型的甘露醇脱氢酶的量 1000U/L， Bacillus sub。
25、tilis 来源的 NAD+ 依赖型的葡萄糖脱氢酶的量 10000U/L， 反应 12h， 反应体系中甘露醇浓度为 8.4， 葡萄糖 说 明 书 CN 106811488 A 5 4/4 页 6 酸锌 8.9。 0023 实施例 5 0024 于 1L 水体系中， 葡萄糖的终质量浓度为 10， 果糖的终质量浓度为 10， 还原型 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADH)的终浓度为200mM， 氯化钙浓度为0.6M， 反应pH为7.0， 反应温度为 30 度， Lactobacillus brevis 来源的 NADH 依赖型的甘露醇脱氢酶的量 1000U/ L， Bacillus subtilis。
26、来源的NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的量10000U/L， 反应12h， 反应体 系中甘露醇浓度为 8.2， 葡萄糖酸钙 76g。 0025 实施例 6 0026 于 1L 水体系中， 葡萄糖的终质量浓度为 10， 果糖的终质量浓度为 10， 氯化钙 浓度为 0.6M， 反应 pH 为 7.0， 反应温度为 30 度， 共表达有 Lactobacillus brevis 来源的 NADH 依赖型的甘露醇脱氢酶与 Bacillus subtilis 来源的 NAD+依赖型的葡萄糖脱氢酶的 大肠杆菌全细胞催化剂 5g( 湿重 )， 反应 12h， 反应体系中甘露醇浓度为 92， 葡萄糖酸钙 86g。 说 明 书 CN 106811488 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 106811488 A 7 。