本发明涉及用于提取通过从可发酵生物质开始进行厌氧发酵而产生的羧酸的方法。该方法特别地旨在提取处于液相中的羧酸。
“可发酵生物质”在此意指从由有机材料形成的废料、副产物和联产物获得的有机底物(有利地非食物性的有机底物)，所述由有机材料形成的废料、副产物和联产物即为由于人类活动而产生的生物质，无论这些活动是家庭的、工业的、农业的、林业的、水产养殖业的、农产品加工业的还是来自畜牧业的。作为非限制性的例子，可以提及下列材料作为有机底物：厩肥，生活垃圾的有机级分，屠宰场的联产物，源自农产品加工业的纤维素或木质纤维素残留物，例如由于甘蔗(蔗渣)、向日葵或大豆的转化而产生的那些。
“厌氧发酵”是指由微生物(真核生物或原核生物，例如细菌、真菌、藻类或酵母)在厌氧条件下所进行的发酵。
在发酵代谢物之中，羧酸是被称为前体的发酵代谢物；应当理解的是，其他发酵代谢物也被称为前体。作为非限制性的例子，可以提及乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸和苯基乙酸。这些前体随后允许产生具有更大的能量和/或化学益处的分子；应当理解的是，它们是有机分子。可以提及下列物质作为具有能量和/或化学益处的分子：例如，具有碳链的分子例如酸类、烃类、甲烷、酯类、醇类、酰胺类、聚合物。
下面，将会以羧酸作为参考；应当理解，总体而言，本发明适用于发酵代谢物的提取。羧酸，尤其是挥发性脂肪酸或VFA，可以被转化为，例如酮类、烷烃类、醇类、烯烃类。可以设想的是，这样的发酵也产生除羧酸之外的其他代谢物，其以或大或小的量。尤其可以提及酯类、气体、乳酸、醇类、氢和二氧化碳。此外，已知通过厌氧发酵来实施的羧酸的产生诱导出对于微生物有害的介质酸化。由于介质酸化诱导对微生物的抑制，并因而诱导发酵的放慢甚至停止，因此需要不连续地进行工作。为此，在给定的发酵时间后，在不同的步骤期间提取羧酸。因此，这样的提取不允许所谓前体的分子的快速和连续产生，其中产率不是最佳的。此外，这样的不连续的提取方法消耗微生物株系，并且产生可再利用性低的或不可再利用的废料。令人感兴趣的是，以最佳方式提取通过厌氧发酵而产生的羧酸而不抑制微生物。由WO-A-2011/063391知晓了用包含羧酸的提取溶剂来提取给定代谢物(在该情况下，丁醇)的方法。所述溶剂是商购可得的溶剂。还由FR-A-2 591 505知晓了处理水的方法，其使得能够通过使用有机溶剂(在该情况下，液体的且与水不相混溶的羧酸)作为溶剂来提取有机化合物(包括胺类、氨基酸类和酚类)，以便获得有机相和水相。已证实，这些方法不适合于提取通过发酵连续地产生的代谢物(例如羧酸)。
更特别地，本发明旨在通过提供这样的提取方法来纠正这些缺点，所述提取方法使得能够以连续的、生物相容的、有规律的、受控的方式生产通过厌氧发酵而获得的各种各样的称为前体的发酵代谢物，其中具有最小量的不可再利用性废料并且不抑制微生物地。
为此，本发明的目标在于用于提取在发酵反应器中通过从可发酵生物质开始进行厌氧发酵而由微生物产生的具有一至九个碳的羧酸的方法，所述提取是液体-液体类型的，所述方法的特征在于，所述方法至少包括下列步骤：
-a)在至少一种在厌氧发酵期间所产生的羧酸之中选择内源性提取溶剂，从而使得所述溶剂的碳数目大于或等于其密度低于水的密度且其沸点在正常压力条件下高于70℃的待提取的羧酸的碳数目；
-b)在发酵反应器外使所选择的提取溶剂与发酵介质相接触，而不中断发酵；
-c)通过至少一次蒸馏来将发酵代谢物与提取溶剂分开；
-d)收集和储存或使用在步骤c)中所获得的发酵代谢物。
这样的方法使得能够连续地提取发酵代谢物，同时保持在生物反应器中存在的微生物的生产能力。
术语“内源性(的)”应当被理解为意指通过所述厌氧发酵而产生但不是仅仅通过所述厌氧发酵而产生的化合物或者化合物的混合物。换言之，所述内源性溶剂可以通过导致与在所述厌氧发酵期间所产生的那种相似的(如果不相同的话)产物的其他途径来产生，无论所产生的量为何。
所述提取步骤不仅使得能够连续地收集在发酵反应器中所产生的分子，而且还使得能够保持负责该产生的微生物，其中在对于全体微生物来说非致死的条件下，即在生物相容的提取条件下，借助于内源性溶剂来进行所述提取。以这种方式，摆脱了与发酵反应器中前体的积累相关联的问题，例如由于所产生的羧酸(其对于微生物来说是有害的)的积累而引起的发酵介质的酸化。在整个发酵循环期间，微生物的活性被维持在高水平，接近初始水平。
根据本发明的有利但非必须的方面，这样的方法可以包括一个或多个下列特征：
-在步骤a)期间，所述内源性提取溶剂为具有至少四个碳的羧酸；
-在步骤c)之后和在步骤d)之前，在额外的步骤e)期间通过蒸馏将在步骤c)中获得的有机相的水与羧酸分开；
-所述提取溶剂为具有四至九个碳的羧酸；
-所述提取溶剂为具有七或八个碳的羧酸；
-所述提取溶剂选自庚酸、辛酸或壬酸；
-在步骤c)和d)之间的额外的滗析步骤f)允许有机相与水相之间的首次分开；
-在反应器外使发酵介质与提取溶剂相接触期间，连续地抽取发酵介质；
-在反应器外使发酵介质与提取溶剂相接触期间，顺次地抽取发酵介质；
-在步骤b)和c)之后，将至少一部分来自所述提取的液相再引入到发酵反应器中并与发酵介质相掺和。
本发明还涉及施行根据前述特征之一的方法的设备，其特征在于，所述设备至少包括：
-发酵反应器，
-适合于确保使发酵介质与提取溶剂相接触的提取装置，
-至少一个蒸馏装置。
根据本发明的有利但非必须的方面，这样的设备可以包括一个或多个下列特征：
-所述设备另外还包括至少两个蒸馏装置和至少一个滗析装置。
通过阅读作为非限制性实施例而给出并且参考下列附图而做出的对于本发明的数个实施方案的描述，本发明将会更好地得到理解，并且本发明的其他优点将会更加清楚地显现出来，其中
-图1是本发明的目标方法的实施方案的代表性简化示意图，其包括两次蒸馏和一个滗析装置。
现在，通过参考图1来描述所述方法的各种不同步骤；应当理解的是，对于本身已知的步骤不作详细说明。应当注意，图1图解说明了包括两次蒸馏的方法，即其为代表了对于常用尺寸的设备来说在经济上有益的解决方案的一个实施方案。具有单个蒸馏站的设备在技术上是可能的和甚至是有利的，但是，为了在经济上是有益的，需要更大尺寸的设备，例如具有在工业精炼厂中所遇到的那些的大小的设备。
此外，随后将会描述作为例子的羧酸的提取；应当理解的是，其他发酵代谢物可以用内源性羧酸来进行提取。
首先，有利地，对于用于厌氧发酵的底物S不进行处理，即不使它经历任何物理化学的或酶促的预处理。该底物S主要地由可发酵生物质组成。作为非限制性的例子，可以提及农业或植物废料(秸秆、蔗渣、玉米残渣、草、木材、割下的草)、造纸废料(纸板、纸张)、农产食品和饲料加工废料、屠宰场废料、生活垃圾的有机级分、畜牧业排放物(厩肥、液肥、鸟兽粪)、藻类、水产养殖废料、林业活动的废料或者化妆品工业的可发酵联产物。某些底物包含有机分子，例如有机酸，其将不会影响或微小地影响发酵过程。相反地，这些分子可以存在于发酵介质中，并且参与例如所确定的最终有机分子的产生。
将底物S引入到本身已知的且为所希望的产生按尺寸加工的发酵反应器1中，不论所希望的产生是为了进行试验而以实验室规模还是在生产的情况下以工业规模。换言之，所述发酵反应器1或生物反应器具有根据需要从几升到几百立方米变化的体积。
有利地，在最初以对于开始进行发酵来说足够的量将微生物引入到发酵反应器1中。有利地，将微生物以聚生体的形式进行接种，如由箭头M所注明的。术语“聚生体”是指微生物(真核生物和原核生物)的混合物或混合体，无论其是细菌、酵母、真菌还是藻类。这些微生物基本上源自天然生态系统，有利地但非仅仅源自厌氧生态系统，例如(作为非限制性的例子)水生环境的厌氧区(例如某些湖泊的缺氧区)、土壤、沼泽、净化污泥、反刍动物的瘤胃或白蚁的肠道。应当牢记，在聚生体M中各种不同类型和种类的微生物的定性和定量分布不是确切地知道的并且尤其可以以大的比例变化。已证实，该定性和定量多样性以令人惊讶的方式提供了微生物的稳固性和适应性，这使得能够确保底物的最佳利用，无论这些底物的组成为何并且这是在可变的发酵条件下。
此外，由于就这样地使用底物S，即没有对它进行灭菌，或更一般而言没有在将它引入到生物反应器1中之前清除它所包含的微生物，因而已证实，对于底物S来说特有的微生物事实上掺入到聚生体M中或者至少在生物反应器1中与聚生体M相联合。
与可能存在于底物1中的微生物相联合的微生物聚生体M允许底物S的发酵，这无需添加诸如酶的产品。此外，所述发酵在厌氧条件下发生，更确切而言，在氧化还原电位低于-200mV，有利地在-550mV和-200mV之间之时，和在pH低于8，优选地在4和7之间之时。所述发酵有利地局限于被称为前体的发酵代谢物(即羧酸)的产生。因此，诱导了与在反刍动物中遇到的酸中毒现象相似的反应，同时具有接近零的甲烷产生。通常，甲烷是在由来自天然生态系统的微生物进行厌氧发酵期间所获得的最终发酵代谢物之一。
所述发酵首先导致形成具有一至九个碳(主要地二至四个碳)的羧酸，例如乙酸、丙酸和丁酸。还获得具有更长的链(因此多于四个碳)的羧酸，例如戊酸和己酸、庚酸、辛酸或壬酸。通过继续进行发酵和/或通过增加在生物反应器1中的微生物的量(如果需要，用所选择的微生物)，可能有助于具有更长的碳链(因此多于四个碳)的羧酸的产生。
换言之，在所述发酵期间大量产生的代谢物基本上是具有二至六个碳的羧酸。后面，所述提取将基本上涉及这些羧酸的提取；应当理解的是，所述方法可以被实施用于其他羧酸或在其他类型的发酵期间所产生的其他发酵代谢物。
优选地，所述发酵可以以连续方式，以不连续或分批方式，或者以连续-不连续或补料分批方式，在单个发酵反应器1中或在串联布置的数个发酵反应器1中进行。
在所有情况下，进行发酵以确保在液相中产生羧酸。因此，容易设想到，发酵介质包含固相，所述固相包含(至少在最初)底物S的固体级分以及微生物聚生体M的固体级分。
发酵介质的液相包含在所述发酵期间所产生的分子，或发酵代谢物，以及底物S的液体级分(至少在发酵开始的时候)。
发酵时间尤其随着底物S、所存在的微生物M和发酵条件而变化。典型地，发酵时间段为1至7天，优选地2至4天。在该时间段结束时在发酵介质中所获得的代谢物的浓度是可变的，但是对于羧酸来说，其按照羧酸不同通常为10至20g/L的级别；应当理解的是，在某些条件下，它可以高于35g/L，例如接近50g/L。在发酵步骤结束时，由于在发酵介质中羧酸的存在，发酵介质处于酸性pH(其通常为4至6)。
当通过底物S的发酵来进行的预先确定的代谢物(例如羧酸)的产生达到确定的量时，通常在发酵的稳态运行工况阶段，启动分子的提取步骤。
优选地但非必须地，该预先确定的羧酸的量相应于微生物生长的放慢，因此位于微生物抑制阈值(这与由所述羧酸造成的发酵介质的酸化相关)的附近。
所述提取是液体-液体类型的。所述提取溶剂为内源性溶剂，即从至少一种在发酵期间所产生的化合物中选择的溶剂。可以设想的是，所述溶剂可以是发酵期间所产生的数种化合物的混合物。在此，所述内源性溶剂选自构成发酵代谢物的一部分的羧酸。
这是因为，不同于其他有机溶剂，所述羧酸是在发酵期间产生的。使用这样的内源性溶剂具有许多优点。
首先，因此保证了除了来自发酵的那些分子之外不存在其他分子：没有很可能以痕量在最终产物中被发现的有机溶剂。
用所述羧酸，尤其可能的是，不仅提取羧酸，而且还提取其他代谢物，例如醇类、胺类、氨基酸类和芳香化合物例如苯基羧酸(phenylacids)。此外，在液体-液体类型的提取中，溶剂的损失是不可避免的。损失发生于储存期间、蒸馏期间、甚至发酵期间，如果该溶剂能够被所述微生物所消耗。因此需要供给溶剂，这就产生了在运输和环境方面的额外的花费和限制。
通过使用对于所述厌氧发酵过程来说内源性的溶剂(例如羧酸)，这使得能够至少部分地补偿溶剂的损失。
此外，这样的内源性溶剂避免了溶剂不仅与在发酵期间所产生的挥发性脂肪酸之间，而且更一般而言与来自发酵的产物之间的不想要的和/或不受控的反应的任何风险。
最后，使用羧酸作为溶剂参与了在提取期间水相的pH的降低。
能够在发酵介质中存在的在发酵期间产生且作为溶剂使用的羧酸为例如(但不仅仅是)具有四至九个碳的酸。
在所有情况下，将会如此地选择羧酸，从而使得其碳数目大于或等于待提取的代谢物的碳数目。
在发酵期间所产生的此类酸的非限制性例子在下面的表1中给出。
在表1中，密度在环境温度(接近20℃)下给出。
表1
更确切地，申请人从所进行的试验中看出，具有六至九个碳，有利地七或八个碳的羧酸是特别有利的内源性溶剂。换言之，从在表1中以非限制性方式和作为例子而提及的羧酸出发，申请人留下己酸、庚酸和辛酸作为内源性溶剂。作为一种变化形式，可能的是使用这些酸的异构体。
优选地，将分子(因此在此为发酵代谢物)从发酵介质的液相开始独自地进行提取或者至少以分子家族进行提取，这尤其允许更好的产率并且有助于从这些所提取的分子开始来产生特定的化合物。
在所有情况下，在以至于提取不破坏且不抑制微生物M的这样的条件下，或者至少采用以至于这不明显地改变由在发酵介质中存在的微生物M所进行的发酵的继续进行的这样的比例，来提取至少部分地提取的代谢物。换言之，所述溶剂对于全体微生物来说不是致死的。因此，所述提取既不干扰，也不毁坏发酵介质以及它所包含的微生物M的发酵能力。因此，所述提取在生物相容的这样的条件下进行。
当从发酵介质中提取分子例如羧酸时，事实上降低了由这些酸引起的发酵介质的酸化。因此，发酵，和因此代谢物的产生，在与初始条件相似的条件下继续进行，其中发酵介质保持不太酸的状态。
有利地，已证实，在提取后残留的液相可以包含活的(因此潜在地有活性的)微生物M。由于在该液相中存在比最初时少的羧酸，因而该液相的pH是较为不酸的。因此，可能的是将其再注入到发酵反应器1中。因此，不仅通过提取酸性化合物而减少了酸中毒的现象和/或在发酵过程中使发酵介质的pH稳定，而且在一定程度上还用微生物M重新接种了介质，从而确保了发酵，这没有显著地降低发酵介质的pH。
这样的解决方案使得能够优化发酵的产率并且实现连续发酵，这是通过减少发酵时间来进行的，同时趋向于零废料。
所述提取连续地或顺次地进行，例如每12小时进行一次提取。换言之，可能的是继续进行发酵，同时提取所产生的代谢物(要么随着它们的产生，要么有规律地)。一旦被提取，就通过本身已知的化学技术例如蒸馏、合成、电合成、酰胺化或聚合来纯化代谢物和/或将其转化为其他产物，例如烷烃类、烯烃类、酰胺类、胺类、酯类、聚合物。
更确切地，按照箭头3，在柱子的顶部用发酵汁对提取柱2进行进料。在柱2中，事先注入内源性溶剂，因此羧酸或羧酸的混合物。如在前面所提及的，所述内源性溶剂有利地为具有七或八个碳的羧酸。然而，通过发酵所产生的量通常不足以确保大部分的所产生的其他羧酸的提取。因此，需要引入源自除了正在进行的发酵之外的其他来源的此类羧酸。其可以是例如以前提取的并为了该用途而储存的羧酸，或者源自商业来源的(有利地生物来源的)酸。
通过本身已知的手段来进行的以逆流或在搅拌下的循环使得能够使羧酸与溶剂相接触。在该第一个步骤期间，羧酸或者其中的至少一部分被转移到溶剂中。
在提取柱2的底部收集事实上被耗竭了羧酸的发酵汁，并且优选地按照箭头4将其再引入到发酵罐1中。在溶剂也是在发酵汁中存在的羧酸之一的情况下，任何在再引入发酵汁后由溶剂造成的对于发酵的继续进行来说有害的污染都是不可能的。
在提取柱2的顶部收集溶剂以及它所包含的羧酸，并且按照箭头5将其转移至第一蒸馏柱6。溶剂和所提取的羧酸形成至少一个与水至少部分地可混溶的有机相。在此提醒，所描述和举例说明的实例相应于具有多于一个即两个蒸馏柱的实施方案。这样的实施方案是对于具有所谓平均大小的设备将会遇到的。
在使得能够选择性地回收其沸点低于溶剂沸点的羧酸的温度下进行蒸馏。
在蒸馏结束时，在柱6的顶部收集来自所述提取的羧酸和水。按照箭头7，将该流再冷却并引向滗析器8。
在柱6的底部收集的溶剂比所提取的羧酸重。按照箭头9，将所述溶剂再引向提取柱2。因此，所述溶剂被再利用，其中使损失最小化并且限制了外部供给内源性溶剂的需求。
在滗析结束时，收集水相并按照箭头10送回至提取柱2中。
因此，在滗析器8的底部所回收的有机相的构成性羧酸是各种不同羧酸和可能地水的混合物，其以在某些情况下需要额外处理的比例。换言之，除了大型设备例如在工业精炼厂中所遇到的那些外，为了优化“功效/成本”比，合理的将会是如在图1中所图解说明的那样进行额外的蒸馏。为此，将羧酸按照箭头11引向第二蒸馏柱12。因此，在蒸馏柱12中引入基本上仅包含有机相的溶液。
在第二次蒸馏结束时，在柱12的底部收集羧酸(其中沸点高于水的沸点)，并且按照箭头13引向收集和储存装置14。有利地，当存在两个蒸馏装置时，有益的是考虑预备至少一个滗析装置。作为一种变化形式，将至少一部分所收集的羧酸(其是经纯化的或以混合物形式)直接引向使得能够合成最终分子的装置。优选地，将在第二次蒸馏结束时所收集的水按照箭头15引向提取柱2。此外，如在图1中所图解说明的实施方案中那样，对于未纯化的羧酸，有益的是考虑预备另一次分离(通过至少一次蒸馏)，以收集纯的产物，或最不可用的产物。因此，用相继的蒸馏，可以分开每一种酸。这些各种不同的蒸馏可以在单个蒸馏装置中进行，只要该后者具有足够的设计和大小。在实践中，它通常是在精炼厂类型的工业设备中所遇到的蒸馏柱。
根据蒸馏条件，有利的是考虑预备至少一个热交换器16以便使溶剂再冷却。有利地，将如此回收的热用于在其被引入到蒸馏柱6中之前对在提取柱顶部流出的溶剂进行预热。以这种方式，可能的是以显著的方式减少对于第一次蒸馏来说必需的能量消耗。可以设想的是，要么为这些各种不同的热流考虑预备至少两个交换器，要么单个交换器。
在其他实施方案中，各种不同装置的数目和/或尺寸与所描述的那些不同。特别地，可以考虑预备数个并联的设备。
同样地，技术人员能够考虑预备在提取和/或蒸馏设备中常常遇到的控制和安全装置。
申请人已按照各种不同的实施方案进行了试验，在提取羧酸的情况下。
试验1：用庚酸进行的提取
在包含生活垃圾的可发酵级分(以50g/L干物质(DM)的浓度)的底物上进行的发酵的过程中产生羧酸。回收50ml的发酵介质，因此液相。该抽取物的pH为4.3。然后，使这50ml经历用庚酸进行的提取，以1/1的体积比。所获得的提取产率为37％。
申请人看出，在相同的试验条件下，通过用辛酸代替庚酸，获得了相同的产率。
还由申请人根据各种不同的实施方案进行了比较发酵试验，以便评价在发酵介质中提取溶剂的存在对于发酵产率的影响。
试验2：在庚酸存在或不存在下的发酵的比较
在以中温模式(38℃)运作的有效体积为2L的厌氧生物反应器中，以25g/L干物质的浓度，在160小时期间平行地进行两个以非无菌方式的草坪割草的发酵。在第一个实验中，在接种了经优化的厌氧微生物混合物后，以2.8g/L的水平进行庚酸的初始添加。庚酸的该存在使得能够理解用该类型的溶剂进行的提取的生物相容特征。这是因为，在提取后将培养基再引入到生物反应器中，并且可以包含痕量的提取溶剂直至其溶解度阈值水平。在相同的条件下(除了添加庚酸外)平行地进行第二个发酵，事实上其是对照培养物。
在这些发酵期间，进行液相和气相代谢物的监测。在发酵结束时，关于挥发性脂肪酸的产生的所获得的产率为0.33g VFA/g干物质(在具有庚酸添加的实验的情况下)，和0.39g VFA/g干物质(对于对照发酵)。因此看出，溶剂的存在对于挥发性脂肪酸的产生诱导了15％的级别的略微负面的影响，同时保持了高于30％的产率，这本身是在性能方面充分可接受的值。
在生物反应器中庚酸的存在引起与在发酵介质中挥发性脂肪酸的过量积累相同的代谢行为。通过降低庚酸的初始浓度或者选择在培养基中具有比庚酸的溶解度更低的溶解度的羧酸作为溶剂，这使得能够达到与用对照培养物所获得的产率等价的产率。
为了验证该解决方案，申请人进行了下面的试验。
试验3：在辛酸存在或不存在下的发酵的比较
重现试验2，以相同的培养条件，但是从50g/L再生废料干物质开始，并且这次针对不包含辛酸的对照发酵实验比较在初始添加了0.7g/L的辛酸的发酵期间所获得的产率。
在发酵结束时获得0.3g VFA/g干物质的产率(在具有辛酸的培养物的情况下)，和0.31g VFA/g干物质的产率(关于对照培养物)。
因此，所述产率是等价的，并且得出结论，以其最大溶解度的辛酸的存在不干扰发酵。
这样的方法的施行不仅牵涉在设备中至少一个发酵反应器1的存在，而且还牵涉在设备中至少一个提取柱2，和至少一个(有利地两个)蒸馏柱6和12以及至少一个滗析器8，和在一个有利的实施方案中，至少一个热交换器16的存在。这些装置是本身已知的，其数目和其大小适合于所述类型的生产。
这样的设备有利地还包括至少一个用于储存来自提取的产物的装置。考虑预备管理和控制手段，例如温度传感器、pH探针和/或氧化还原探针。此外，通过本身已知的方法来进行微生物活性的监测，例如通过对气体或液体代谢物的产生进行分析监测、用流式细胞术进行计数、分子生物学技术例如分子印记或生物芯片。