一种鸡法氏囊抗体的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101704889 B (45)授权公告日 2013.01.16 CN 101704889 B *CN101704889B* (21)申请号 200910237717.7 (22)申请日 2009.11.13 C07K 16/10(2006.01) C07K 16/02(2006.01) (73)专利权人 烟台绿叶动物保健品有限公司 地址 264003 山东省烟台市莱山区桐林路 32 号烟台绿叶动物保健品有限公司 (72)发明人 张兴晓 丁军涛 王颖 孔义波 郭东 吕淑荣 (74)专利代理机构 北京法思腾知识产权代理有 限公司 11318 代理人 高宇 CN 1084。

2、066 A,1994.03.23, CN 1522760 A,2004.08.25, CN 101113176 A,2008.01.30, 温建新 等 . 抗传染性法氏囊病高免卵黄抗 体的使用 .中国兽医杂志 .1999, 第 25 卷 ( 第 3 期 ), 周维纯 等 . 杨树皮类脂饲料添加剂 .饲料 工业 .1991, 第 12 卷 ( 第 1 期 ), (54) 发明名称 一种鸡法氏囊抗体的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及免疫学领域， 具体地， 本发明涉及 一种鸡法氏囊抗体的制备方法。根据本发明的 鸡法氏囊抗体的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 用 杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡， 用量。

3、为每只鸡每天 0.080.1g， 饲喂2030天后， 对饲喂杨树皮类 脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫， 采集鸡血清测定抗鸡法氏囊病毒中和抗体效价， 合格者， 收集该鸡群产的蛋 ； 2) 无菌条件下分离 蛋清， 捣碎蛋黄， 将卵黄液和无菌生理盐水混匀， 制备卵黄抗体。通过本发明的方法不仅具有制作 简单方便， 性质稳定等特点， 其产生的传染性法氏 囊抗体效价可比常规方法制得的卵黄抗体提高 2 倍以上， 在紧急预防与治疗鸡传染性法氏囊病方 面具有显著的效果。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘天耀 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 。

4、(12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种鸡法氏囊抗体的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步骤 ： 1） 用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡， 用量为每只鸡每天 0.08 0.1g， 饲喂 20 30 天 后， 对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫， 首次免疫每只鸡注射 0.5ml 弱毒疫苗， 14d 后进行第二次免疫， 每只鸡注射 1.0ml 油乳剂灭活苗， 21d 时进行第 3 次免疫， 每只鸡注射l.0ml油乳剂灭活苗， 28d时进行第四次免疫， 每只鸡肌肉注射lml油乳 剂灭活苗， 采集鸡血清测定抗鸡法氏囊病毒中和抗体效价， 合格。

5、者， 收集该鸡群产的蛋 ； 2） 无菌条件下分离蛋清， 捣碎蛋黄， 将卵黄液和无菌生理盐水混匀， 制备卵黄抗体。 2. 根据权利要求 1 所述鸡法氏囊抗体的制备方法， 其特征在于， 在制备卵黄抗体过程 中， 向所述卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗沙姆 188， 使其终浓度达到 0.5-2.%。 3. 根据权利要求 1 所述鸡法氏囊抗体的制备方法， 其特征在于， 卵黄液和无菌生理盐 水以 1:4 混合。 权 利 要 求 书 CN 101704889 B 2 1/4 页 3 一种鸡法氏囊抗体的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及免疫学领域， 具体地， 本发明涉及一种鸡法氏囊抗体的制备方法。 背。

6、景技术 0002 卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体， 由于卵黄中仅有 IgG 类抗体， 故称其为卵黄免疫球蛋白 IgG(egg yolkimmunoglobulins)， 简称为 IgY。卵黄抗体 的研究始于 19 世纪末， 1893 年 Klemperer 发现了卵黄中富含抗体 ； 1934 年 Jukes 的实验证 明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中， 从而为雏鸡提供被动免疫保护。 Patters等的试验 证实， 相对别的血浆蛋白， IgG 被选择性的转运到卵泡中。1969 年， Leslie 和 Clem 将这种 抗体命名为 IgY。 0003 卵黄抗体的形成过程是 ：。

7、 当机体受到外界特异性抗原 ( 尤其是灭活抗原 ) 的刺激 后诱发一系列的免疫应答反应， 激发 B 细胞分化成能分泌特异性抗体的浆细胞， 分泌大量 的特异性抗体进入血液中。同时在产蛋禽体内， 血液中的特异性抗体 IgG( 所有亚群 ) 由卵 巢 IgG 受体的介导逐步进入到卵巢滤泡和输卵管中， 并在卵黄中蓄积起来， 也正是由于这 种卵黄累积作用， 使卵黄中的IgG明显地高于血清中的含量， 而血清中的其他抗体(主要是 IgM， IgA) 与输卵管中的卵白白蛋白一起混入到鸡蛋白中。 0004 卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性， 在低于 75条件下， 卵黄抗体具有良好 的热稳定性， 90处理 15。

8、min 后， 大部分卵黄抗体丧失结合活性， 在 pH 4 时， 仅有少量卵 黄抗体失去活性。在 pH4-12 范围内， 卵黄抗体的活性几乎不受影响， 在 pH 12 时， 卵黄抗 体迅速失去结合活性。实验表明， 卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性， 即使经过 5 次冻融， 其抗原结合活性几乎不受影响。在室温下可保存 6 个月， 4保存可达 5 年以上， 活性仅下 降 5左右。由于具有这些稳定的理化性质， 所以其开发应用备受人们所关注。 0005 除上述理化特性外， 卵黄抗体还有其他重要的生物学特性。卵黄抗体浓度高于血 清 IgG， 单个卵黄 ( 约 15mL) 含 200mg 左右的卵黄抗体， 自。

9、卵黄中获得卵黄抗体较实验动物 血清方便。且卵黄抗体不与哺乳动物补体、 Fc 受体结合， 也不与葡萄球菌蛋白 A(SPA) 或链 球菌蛋白G(SPG)结合， 卵黄抗体还不与血清中的类风湿因子(RF)结合， 可提高免疫学检测 的准确性。因而可用卵黄抗体检测粪便中的病毒， 因为粪便中经常含有大量 SPA， 用卵黄抗 体检测可避免假阳性结果。卵黄抗体是独特的 IgG 同种型抗体， 同时哺乳动物组织结构较 禽类组织具有高度免疫性， 卵黄抗体用于哺乳动物检测具有明显的优势， 许多高度保守的 抗原， 在步入动物中仅产生极小的免疫原性， 却可用卵黄抗体进行区分， 因此卵黄抗体可用 于兽医和人类免疫学的检测。 。

10、0006 杨树皮类脂(Poplar Bark Lipid， PBL)是从杨树皮中提取的一种橙黄色脂溶性物 质， 富含大量的多糖、 有机酸、 甾醇、 磷脂、 甙类及维生素等物质。多糖类具有促胸腺体液反 应、 刺激网状内皮系统， 提高机体特异性免疫反应能力 ； 有机酸具有增强机体免疫功能的作 用， 能够刺激和促进单核吞噬细胞功能， 对抗免疫抑制对免疫器官的抑制作用 ； 甙类能够加 速抗体的产生、 促进淋巴细胞转化和增强网状内皮系统功能等作用。这些物质在动物体内 说 明 书 CN 101704889 B 3 2/4 页 4 协调统一， 大大提高动物体的免疫机能。 0007 作为杨树皮的提取物， 杨树。

11、皮类脂与大多数的中草药一样， 也存在着双向性， 当使 用剂量过大时， 不但不能起到正向促进作用， 相反免疫器官会出现免疫抑制作用， 因此， 合 适的剂量是发挥杨树皮类脂免疫增强作用的关键所在。 0008 法氏囊作为最重要的禽的中枢免疫器官， 其发育的状况、 淋巴细胞发育程度、 分化 成熟程度将直接影响到制备法氏囊抗体水平。 适量的杨树皮类脂对法氏囊发育具有明显的 促进作用。由于杨树皮类脂成分中含有大量的必需氨基酸、 维生素、 甾醇等， 这些营养物质 正是免疫器官发育过程中不可或缺的组分， 通过饲喂适量的杨树皮类脂， 可以很好的促进 法氏囊等免疫器官的发育， 刺激并促进各淋巴细胞的分裂与增值， 。

12、使法氏囊淋巴组织与淋 巴细胞具有较强的生物学活性， 从而整体提高法氏囊产生免疫应答， 分泌抗体的水平， 高水 平表达的抗体可通过体液循环到达卵巢， 并在卵黄形成阶段被收集， 经过卵的各个形成过 程， 最终以卵黄抗体的形式得到保存。 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种鸡法氏囊抗体的制备方法。 0010 根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法， 包括以下步骤 ： 0011 1) 用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡， 用量为每只鸡每天 0.08 0.1g， 饲喂 20 30 天后， 对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强化免疫， 采集鸡血清测定抗 鸡法氏囊病毒中和抗体效价， 合格者， 收集该鸡。

13、群产的蛋 ； 0012 2) 无菌条件下分离蛋清， 捣碎蛋黄， 将卵黄液和无菌生理盐水混匀， 制备卵黄抗 体。 0013 根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法， 其中， 对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡 进行法氏囊灭活疫苗强化免疫的过程为 ： 首次免疫每只鸡注射 0.5ml 弱毒疫苗， 14d 后进行 第二次免疫， 每只鸡注射1.0ml油乳剂灭活苗， 21d时进行第3次免疫， 每只鸡注射1.0ml油 乳剂灭活苗， 28d 时进行第四次免疫， 每只鸡肌肉注射 1ml 油乳剂灭活苗。 0014 根据本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法， 其中， 在制备卵黄抗体过程中， 向所述卵 黄和生理盐水的混合液中添加泊罗。

14、沙姆 188， 使其终浓度达到 0.5-2.0。 0015 根据本发明的具体实施例， 本发明的鸡法氏囊抗体的制备方法具体包括以下步 骤 ： 0016 1) 杨树皮类脂 ( 购自山东省莒县林产化工厂 ) 饲喂健康产蛋鸡， 每只鸡每天 0.08 0.1g， 每天一次， 一个月后对饲喂杨树皮类脂的健康产蛋鸡进行法氏囊灭活疫苗强 化免疫， 0017 其中， 法氏囊灭活疫苗强化免疫方法如下 ： 0018 利用法氏囊 B87 毒株 ( 购自中国兽医药品监察所 ) 接种 SPF 鸡胚 ( 购自山东省 SPF 试验鸡场 )， 收集 60 96h 死亡胚胚体、 绒毛膜和尿囊液混合捣碎， 冻融三次， 离心， 取 。

15、上清液， 加 0.1甲醛灭活， 然后与油佐剂 ( 购自杭州炼油厂 10 号轻质白油 ) 充分乳化制 成油乳剂灭活疫苗， 用于经杨树皮类脂饲喂一个月的健康产蛋鸡的免疫， 首次免疫每只鸡 胸部肌肉注射 0.5ml 弱毒疫苗， 14d 后进行第二次免疫， 每只鸡胸部肌肉注射 1.0ml 油乳剂 灭活苗， 21d 时进行第 3 次免疫， 每只鸡肌肉注射 1.0ml 油乳剂灭活苗， 28d 时进行第四次免 说 明 书 CN 101704889 B 4 3/4 页 5 疫， 每只鸡肌肉注射 1ml 油乳剂灭活苗 ； 0019 2) 卵黄抗体的制备 ： 0020 第 4 次免疫后 14d， 采集鸡血清测定抗。

16、鸡法氏囊病毒中和抗体效价 ( 按 2008 版农 业部兽用生物制品标准 )， 合格者， 收集该鸡群产的蛋， 自来水清洗污物后用 0.05百毒杀 浸泡 3-5min， 纱布擦干后， 再用 75酒精擦一遍， 晾干， 无菌条件下分离蛋清， 把蛋黄倒人 消毒好的组织捣碎机中 ； 0021 3) 按照 1 4 的比例混合卵黄液和无菌生理盐水， 进行匀浆 1 2min， 在上述混 合液中添加泊罗沙姆 188， 使其终浓度达到 0.5-2.0， 4-8冷浸过滤， 120 目纱网第一次 过滤， 然后将滤液依次转入 100m、 50m 的微孔滤袋中， 压力过滤， 滤液经巴氏消毒后加 入万分之一的硫柳汞， 分装，。

17、 无菌检验合格备用。 0022 本发明提供了一种新型抗鸡传染性法氏囊病的精致抗体制备方法， 利用杨树皮类 脂的免疫增强功能先提高蛋鸡中枢免疫器官的成熟程度， 激活机体免疫系统， 通过机体对 疫苗注射产生的特殊免疫应答使注射过杨树皮类脂的蛋鸡所产的鸡蛋中含有高滴度的抗 鸡传染性法氏囊病的抗体。 通过本发明的方法不仅具有制作简单方便， 性质稳定等特点， 其 产生的传染性法氏囊抗体效价可比常规方法制得的卵黄抗体提高 2 倍以上， 在紧急预防与 治疗鸡传染性法氏囊病方面具有显著的效果。 具体实施方式 0023 实施例 1 鸡传染性法氏囊抗体的制备 0024 利用杨树皮类脂饲喂健康产蛋鸡， 每只鸡每天饲。

18、喂 0.08g。 0025 利用法氏囊 B87 毒株接种 SPF 鸡胚， 收集 60 96h 死亡胚胚体、 绒毛膜和尿囊液 混合捣碎， 冻融三次， 离心， 取上清液， 加 0.1甲醛灭活。然后与油佐剂充分乳化制成油乳 剂灭活疫苗， 用于经杨树皮类脂 ( 购自山东省莒县林产化工厂 ) 饲喂一个月的健康产蛋鸡 的免疫。 首次免疫每只鸡胸部肌肉注射0.5ml弱毒疫苗， 14天后进行第二次免疫， 每只鸡胸 部肌肉注射1.0ml油乳剂灭活苗， 21天时进行第3次免疫， 每只鸡肌肉注射1.0ml油乳剂灭 活苗， 28 天时进行第四次免疫， 每只鸡肌肉注射 1ml 油乳剂灭活苗。 0026 第四次免疫后 1。

19、4 天， 采集鸡血清测定抗鸡法氏囊病毒中和抗体效价 ( 按 2008 版 农业部兽用生物制品标准 )， 合格者， 收集该鸡群产的蛋， 自来水清洗污物后用 0.05百毒 杀浸泡 3-5min， 纱布擦干后， 再用 75酒精擦一遍， 晾干。无菌条件下分离蛋清， 把卵黄倒 入消毒好的组织捣碎机中， 按照 1 4 的比例混合卵黄液和无菌生理盐水， 进行匀浆 1 2min。在上述混合液中添加泊罗沙姆 188， 使其终浓度达到 0.5。4-8冷浸过滤， 120 目 纱网第一次过滤， 然后将滤液依次转入 100m、 50m 的微孔滤袋中， 压力过滤。滤液经巴 氏消毒后加入万分之一的硫柳汞， 分装， 无菌检验。

20、合格备用 ( 无菌检验、 安全检验根据 2008 版农业部兽用生物制品质量标准进行 )。 0027 经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不低于 1 256， 其安全性为 100、 无菌 性检测结果为阴性 0028 治疗用量 ： 对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射 2.0ml/ 只， 7 天以后再次注射 2.0ml/ 只。 0029 实施例 2 说 明 书 CN 101704889 B 5 4/4 页 6 0030 除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天 0.1g、 向卵黄和生理盐水的混合液中添加泊罗 沙姆 188 的终浓度为 2.0外， 其余步骤同实施例 1。 0031 经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不。

21、低于 1 256， 其安全性、 无菌性检测结 果阴性为 0032 治疗用量 ： 对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射 2.0ml/ 只， 7 天以后再次注射 2.0ml/ 只。 0033 实施例 3 0034 除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天 0.09g、 向卵黄和生理盐水的混合液中添加泊 罗沙姆 188 的终浓度为 1.5外， 其余步骤同实施例 1。 0035 经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价不低于 1 256， 其安全性 100、 无菌性 检测结果为阴性。 0036 治疗用量 ： 对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射 2.0ml/ 只， 7 天以后再次注射 2.0ml/ 只。 0037 对比实施例 1 0038 除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天 0.05g 外， 其余步骤同实施例 1。 0039 经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价一般在 1 128. 0040 治疗用量需要对发病初期的鸡紧急胸部肌肉注射 3-4.0.ml/ 只， 7 天以后再次注 射 3-4.0ml/ 只。 0041 对比实施例 2 0042 除杨树皮类脂饲喂量为每只鸡每天 0.12g 外， 其余步骤同实施例 2。 0043 经测定制备的鸡法氏囊卵黄抗体的效价低于 1 128， 0044 治疗时， 即使超过 4.0ml/ 只注射， 保护率也较低。 说 明 书 CN 101704889 B 6 。