技术领域
本发明涉及分子遗传学领域，具体地说，涉及一种与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
我国是一个养猪大国，猪肉产量和质量的市场需求日益增加，提高猪肉产量、改善猪肉胴体质量，成为育种科学家长期以来不断探索的工作。早期的育种工作主要集中于猪的表型选择，随着基因组工作的不断推进和遗传标记的广泛开发，分子选择正逐渐成为可靠而有效的选择方法。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)标记是第三代分子标记，是指在基因组DNA序列上有单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。SNP具有量大、高频率、低突变率等优点，广泛应用于基因组分析，生物信息自动化检测，简单和复杂疾病的遗传研究，畜牧育种标记及全球种族遗传学等研究。分子标记辅助选择育种，是在分子水平上对目标性状进行选择，可以不受环境影响，通过遗传背景选择，减少连锁累赘，从而加速育种过程及精准度。
全基因组关联分析(Genome-wide association studies，GWAS)是畜禽经济性状遗传改良和机理解析的重要方法。随着二代测序技术的发展，全基因组重测序和简化基因组测序技术成为高通量SNP分型的有力工具，GBS(Genotyping-by-sequencing)是简化基因组测序的经典代表，是一种高效的全基因组SNP分型方法，可以从群体中直接鉴定SNP并进行分型，能以较低的成本获得几万到几十万不等的SNP分型信息，已被广泛应用于动植物的分子标记开发、群体遗传分析、全基因组关联分析以及基因组选择育种等研究中(De Donato et al.，2013；Elshire et al.，2011；He et al.，2014)。
猪达100kg体重日龄直接与猪的生长性能相关，因此，研究猪的达100kg体重日龄，在育种中具有重要的研究意义。
利用优化的GBS技术对猪群体进行GWAS研究，有助于快速找到影响猪达100kg体重日龄的有意义的分子标记，为猪的标记辅助选择育种提供有利的理论依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，发明人通过优化的GBS技术对3702头具有重要经济性能记录的杜洛克猪群体进行GWAS研究，通过对GWAS结果的分析得到一个影响猪达100kg体重日龄的SNP(chr8：140618337，基因组版本Ensembl Sscrofa 10.2)位点，对这个位点在中国地方猪种及商品猪种中进行SNP频率分析，发现其SNP频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异，商品猪中T为优势等位基因，地方猪中C为优势等位基因。商品猪生长速度要高于地方猪种，表明这个SNP位点可作为分子标记应用于优良猪种的选育。
鉴于此，本发明提供一种与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于猪8号染色体上，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列第101位碱基为SNP位点，该处碱基为T的猪生长速度高于该处碱基为C的猪生长速度。
本发明还提供所述的SNP分子标记在猪的标记辅助选择育种中的应用。
前述的应用包括以下步骤：
(1)检测样品猪在所述SNP位点的基因型；
(2)选择具有优势等位基因基因型的样品猪进行优势品系的选育。
其中，所述优势等位基因的SNP位点处碱基为T。在生长速度慢的群体中，通过选择与商品猪种同等位基因T的个体，可以提高群体的生长速度。
所述步骤(1)采用直接测序，或先扩增含所述SNP分子标记的DNA片段再检测的方式进行。例如，根据含有所述SNP位点的DNA片段为靶序列，设计引物，从SEQ ID No.1所示的序列中扩增出含有所述SNP分子标记的DNA片段，再检测该位点上的等位基因。
本发明还提供了所述SNP分子标记在鉴定生长速度快的商品猪/地方猪品种中的应用。
另一方面，用于扩增含有本发明所述SNP位点的DNA片段的引物对、含有该引物对的检测试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明还提供所述SNP分子标记、引物对、或述检测试剂或试剂盒在鉴定或选育生长速度快的优良猪种中的应用。
本发明还提供所述SNP分子标记、引物对、或述检测试剂或试剂盒在与猪达100kg体重日龄性状相关的基因分型检测中的应用。
本发明还提供所述SNP分子标记、引物对、或述检测试剂或试剂盒在猪全基因组SNP基因分型中的应用。
本发明的有益效果在于：
通过测定并记录杜洛克猪的重要经济性状，利用优化的GBS技术对3702头杜洛克猪体进行GWAS研究，得到了一个与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP(chr8：140618337)位点。统计该SNP位点在重测序的地方猪种(五指山猪、陆川猪、梅山猪、巴马香猪、荣昌猪、莱芜猪、二花脸猪、河套猪和民猪)与商品猪种(杜洛克猪、约克夏猪和杜长大猪)中的SNP频率，发现其SNP频率分布在地方猪种和商品猪种中存在显著差异，商品猪中T为优势等位基因，地方猪中C为优势等位基因。商品猪生长速度要高于地方猪种，表明这个SNP位点可作为分子标记应用于生长速度快的优良猪种的选育。在生长速度慢的群体中，通过选择与商品猪种相同等位基因T的个体，可以提高群体的生长速度。本发明通过检测SNP分子标记能够早期、快速、低成本、有效地预测猪生长速度，在猪种改良方面具有广阔的应用前景，并能够取得优异的经济价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中猪达100kg体重日龄GWAS结果的曼哈顿图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1猪经济性状全基因组关联分析
1.试验材料
以杜洛克猪纯种群体为研究对象，收集2007年8月至2016年1月出生的33,960头个体(12,987头公猪和20,973头母猪)的生产性能记录用于本发明。达100kg体重日龄性能测定严格按照猪场内部规范进行。
2.试验方法
2.1达100kg体重日龄测定
当猪只体重达到100±5kg时，开始进行检测，检测前一天下午开始停料，空料10小时后称取猪只的体重，记为体重并记录达100kg日龄指标。由于校正公式对终测体重有一定要求，因此后续数据处理时，将终测体重<75kg或>140kg的个体记录设定为缺失值。
2.2基于GBS技术的猪全基因组SNP分型方法
通过模拟酶切猪基因组，预测了36种常见的Ⅱ型限制性内切酶以及24种双酶切组合在猪基因组中的酶切效果；根据研究目的和群体特点，选择EcoRⅠ和MspⅠ双酶切组合用于猪的GBS建库，并对GBS实验和分析流程进行了优化，建立了基于GBS技术的猪全基因组SNP分型方法。通过对3757头杜洛克猪进行GBS测序，鉴定到的102,254个SNP覆盖了猪的整个基因组。
2.3全基因组关联分析
对杜洛克猪群体的达100kg体重日龄(AGE)进行了全基因组关联分析。
2.4 SNP质控
为了获得可靠的GWAS结果，本发明采用以下条件进行质控：(1)MAF≥0.05；(2)HWE≥10E-6；(3)每个SNP的两种纯合子个体数均≥30。
2.5与经济性状显著相关的SNP位点
基因组水平显著位点的检测，采用独立标记数进行Bonferroni校正，独立标记数的计算使用PLINK indep-pairwise命令获得，得到Bonferroni基因组水平5％显著水平的p值为0.05/14,084＝3.55×10-6，而潜在关联的p值阈值为1.0/14,084＝7.10×105。
根据该标准，得到一个与猪达100kg体重日龄达到Bonferroni校正的5％基因组水平显著的SNP位点(P<10-5.45)。
3.结果与分析
本发明以3702头杜洛克群体为对象，利用优化的GBS测序获得的102,254个SNP对猪的达100kg体重日龄进行了GWAS分析，确定了一个与猪达100kg体重日龄显著相关的SNP(chr8：140618337)位点，如图1所示。
该SNP位于猪8号染色体上，含有SNP位点及其两侧各100bp碱基的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该SNP位点处碱基为T的猪生长速度高于该处碱基为C的猪生长速度。
实施例2 SNP标记(chr8：140618337)在不同品种猪中的频率分布
1.试验材料
地方猪种包括：6头莱芜猪，5头二花脸猪，6头河套猪，6头民猪，6头五指山猪，6头陆川猪，14头梅山猪，9头荣昌猪和6头巴马香猪。商品猪种包括：16头杜洛克猪，8头约克夏猪和36头杜长大猪。
2.试验方法
2.1基因组DNA的提取
采用QIAGEN公司的GIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA，具体操作步骤如下：
(1)向1.5ml离心管中加入180μl的ATL缓冲液，再加入20μl蛋白酶K，混匀；
(2)取约20mg猪耳组织样品放入上述溶液中，55℃消化8h；
(3)向消化好的组织液中加入25mg/ml RNase A 3μl，37℃恒温水浴锅中放置30min，目的是降解组织溶液中的RNA；
(4)再向上述溶液中加入200μl AL溶液，旋涡振荡混匀后放入70℃水浴锅中消化10min；待离心管恢复至室温，加入200μl无水乙醇，再次涡旋震荡混匀；
(5)将上述溶液全部加入DNA吸附柱中，室温放置2min后，13000rpm离心1min；
(6)离心结束后，弃滤出液，并将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中，加入500μl PW1溶液，13000rpm离心1min；
(7)离心结束后，再将吸附柱放进另一个新的2ml收集管中，加入500μl PW2溶液，13000rpm离心3min；
(8)倒掉收集管中的溶液，用纸巾擦净收集管管口的液体，再次将吸附柱放在收集管中，13000rpm离心2min；
(9)将DNA吸附柱的盖子打开，放入已编号的1.5ml离心管中，室温放置2min，使管中残留的乙醇挥发完；
(10)向吸附柱的正中心加入120-150μl AE缓冲液，室温放置2min后，13000rpm离心1min，所得溶液即为基因组DNA。基因组DNA经过1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用NanoDrop定量浓度；再将浓度统一稀释到50ng/μl，用于下一步实验。
2.2SNP(chr8：140618337)在各品种猪全基因组重测序数据中的频率
将各品种猪基因组DNA送测序，统计SNP(chr8：140618337)在以上地方猪种和商品猪种重测序数据中的频率分布。
3.结果与分析
SNP(chr8：140618337)在不同地方猪种和商品猪种中的SNP频率分布结果如表1所示，在地方猪种和商品猪种中存在显著差异。商品猪中T为优势等位基因，地方猪中C为优势等位基因。
表1 SNP(chr8：140618337)在不同地方猪种和商品猪种中的SNP频率
由此，得到了一种与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记，在生长速度慢的群体中，通过选择与商品猪种同等位基因T的个体，可以提高群体的生长速度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用
<130> KHP171115719.3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 201
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> misc_feature
<222> (101)..(101)
<223> n=c或t
<400> 1
tatgctacct ccagactcat ttatctaaac acatctctac tcaaattcaa caagtccaaa 60
actaactcat catctttctt ctaggaccag attctctaat nttagtatta acaccaacat 120
ttactcagtt ccccaaatta gaaatgtgat agcccagaat tcctgtcgtg gctcagtggt 180
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