一种没食子酰葡萄糖基转移酶CSUGT84A22基因及其编码蛋白和应用.pdf

本发明公开了一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因，所述CsUGT84A22基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述基因的编码蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；与现有技术相比，本发明首次克隆并验证了形成1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷相关的尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的功能，并提供了含有该CsUGT84A22基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷，进一步开展酯型儿茶素生物合成调控研究奠定基础。

1.  一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因，其特征在于，所述CsUGT84A22基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.  一种如权利要求1所述的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因在制备酯型儿茶素中的应用。

3.  一种如权利要求1所述的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

4.  一种如权利要求3所述的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的编码蛋白在制备酯型儿茶素中的应用。

5.  一种含有如权利要求1所述的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的重组质粒。

6.  根据权利要求5所述的含有没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将所述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT84A22。

7.  一种转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌含有如权利要求5所述的重组质粒，或其基因组中整合有外源的如权利要求1所述的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因序列。

8.  根据权利要求7所述的一种转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒，或其基因组中整合有外源的所述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。

一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用
技术领域
本发明涉及的是分子生物学领域，尤其涉及的是一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
茶叶是世界三大无酒精饮料之一。儿茶素(黄烷-3-醇)，作为茶叶中主要的保健和药理成分，是茶叶中主要存在的茶多酚，约占茶鲜叶干重的12–24％，也是红茶浸提物中典型的苦涩味化合物,尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯(简称EGCG)在茶汤中含量最高且对茶叶涩味贡献最大，并赋予茶叶苦涩的口感。
儿茶素类化合物是2-苯基苯并吡喃的衍生物，属于类黄酮化合物中的黄烷-3-醇类。根据C环上3位是否连接没食子基团，儿茶素类化合物可分为酯型儿茶素(主要包括表没食子儿茶素(ECG)、表儿茶素没食子酸酯(EGCG))，和非酯型儿茶素(主要包括儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EC)和表没食子儿茶素(EGC))。其中，如附图1所示，酯型儿茶素的合成包括两步酶催化反应，涉及尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶(UGGT)和没食子酰基转移酶(ECGT)。
迄今为止，茶树中编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶的基因还没有得到验证。
尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶的催化产物，1-O-没食子酰-β-D- 葡糖苷(βG)，是合成酯型儿茶素的底物，但是至今没有市场商品产物。为了得到1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷(βG)，可从茶树鲜叶中提取或利用化学合成得到，但这两种方法均存在方法繁琐、成本高、得率少的的缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用，以提供一种能够大量合成1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷(βG)的途径，为酯型儿茶素合成的工程化奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该基因是从茶树鲜叶中分离获得的，为一种尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因。
本发明还提供了上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因在制备酯型儿茶素中的应用。
本发明还提供了上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的编码蛋白，所述编码蛋白具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的编码蛋白在制备酯型儿茶素中的应用。
本发明还提供了一种含有上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的重组质粒。
所述重组质粒为将上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因连接到pMal-c2X载 体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT84A22。
本发明还提供了一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有上述重组质粒，或其基因组中整合有外源的上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因序列。
所述转基因工程菌为含有上述重组质粒，或其基因组中整合有外源的上述没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因序列的大肠杆菌Novablue(DE3)菌株。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了形成1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷(βG)相关的尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因的功能，本发明还提供了含有该CsUGT84A22基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷(βG)，进一步开展酯型儿茶素生物合成调控研究奠定基础。
附图说明
图1为酯型儿茶素生物合成途径示意图；
图2为pMal-c2X载体的质粒图谱；
图3为CsUGT84A22基因与已知功能糖基转移酶基因的进化关系图；
图4为CsUGT84A22基因的编码蛋白与已知功能糖基转移酶蛋白序列同源性分析结果图；
图5为CsUGT84A22重组蛋白(rCsUGT84A22)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker；1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为 诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白；
图6为rCsUGT84A22酶促反应产物的HPLC图谱；其中，图6(A～G)分别表示利用rCsUGT84A22催化没食子酸、丁香酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸，形成对应的酶活产物没食子酰葡萄糖(1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷)、丁香酰葡萄糖、肉桂酰葡萄糖、香豆酰葡萄糖、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰葡萄糖和芥子酰葡萄糖的HPLC图谱；
图7为rCsUGT84A22酶促反应产物的HPLC-MS质谱分析结果图；其中，图7(A～G)分别表示利用rCsUGT84A22催化形成的酶活产物没食子酰葡萄糖(1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷)、丁香酰葡萄糖、肉桂酰葡萄糖、香豆酰葡萄糖、咖啡酰葡萄糖、阿魏酰葡萄糖和芥子酰葡萄糖一级和二级质谱图；
图8为rCsUGT84A22催化各酚酸类化合物的相对活性的柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例详细描述本发明，本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明，本发明的保护范围由权利要求所界定，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一、材料
1、茶树品种：农抗早(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensis cultivar Nongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80℃冰箱中备用；
2、pMal-c2X载体：其质粒图谱如图2所示；
3、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；
4、LB培养基：称取10g的NaCl，5g的酵母提取物，10g的胰蛋白胨，加入950mL去超纯水搅拌溶解，用1mol/L的NaOH调pH至7.0，加水定容至1000mL，高压蒸汽灭菌15min，即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；
5、质量浓度为40％的半乳糖溶液：称取40g半乳糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容至100mL，110℃灭菌10min；
5、质量比为40％的葡萄糖溶液：称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容至100mL，110℃灭菌10min；
6、氨苄青霉素母液(Amp⁺，100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素Amp，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，-20℃保存；
7、1mol/L的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：称取2.383 g IPTG，溶于灭菌超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20℃保存；
8、蛋白纯化缓冲液：包括上柱缓冲液和洗脱缓冲液，：
上柱缓冲液：称取0.37g的EDTA，11.67g的NaCl，2.42g的Tris，0.15g的二硫苏糖醇DTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀；用稀盐酸调其PH至7.4，定容至1L，即得上柱缓冲液；
洗脱缓冲液：1L上柱缓冲液中加入3.60g麦芽糖，溶解搅拌均匀；
9、100mM的pH7.5的Tris-HCL缓冲溶液：称取1.1214gTris加水至90mL搅拌溶解均匀，加稀HCL调pH至7.5，补水定容至100mL；
10、体积比为1％的乙酸：用移液管量取10mL色谱级乙酸溶液于1L容量瓶中，用超 纯水定容至1L。
二、CsUGT84A22基因的克隆：
1、设计带有表达载体pMal-c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：正向引物：5’-TCTAGAATGGGCTCTGAATCACTTGTCC-3’
SEQ ID NO：4：反向引物：5’-CTGCAGTTAAACAACAGTAGTAGTTGTG-3’；
2、按照TaKaRa RNAiso试剂盒和RNAiso Plus试剂盒说明书，提取茶树品种农抗早鲜叶RNA，并反转录为cDNA；
3、以反转录产物cDNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4引物进行扩增，扩增程序为94℃预变性30s，94℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸95s，30个循环，72℃继续延伸10min，获得的PCR产物置于16℃保存。
4、将PCR产物利用PCR纯化试剂盒纯化，并连接到pMD19-T Simple Vector后进行菌落PCR验证，获得阳性菌落，提取菌落质粒，获得含有CsUGT84A22基因的pMD19-T simple载体，同时将菌液送至深圳华大公司进行测序。
三、CsUGT84A22基因的功能预测分析
本发明中，为了预测编码茶树尿苷二磷酸葡萄糖依赖的没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因功能，我们通过生物信息学软件，利用MEGA软件邻位法(neighbor-joining method，NJ)将CsUGT84A22基因与已知功能的糖基转移酶基因进行系统进化树分析，其中，已知功能的糖基转移酶基因包括：美洲葡萄VlRSgt(ABH03018.1)、葡萄VvgGT1(AEW31187.1)、葡萄VvgGT2(AEW31188.1)、葡萄VvgGT3(NP_001267849.1)、矮牵 牛PhA5GT(BAA89009.1)、夏堇ThA5GT(BAC54093.1)、马鞭草GhA5GT(Q9ZR25.1)、紫苏PfA5GT(Q9ZR27.1)、拟南芥AtF3G7GT(NP_181217.1)、甘草GeIF7GT(BAC78438.1)拟南芥AtF7GT(NP_567955.1)、黄芩SbF7GT(BAA83484.1)，获得如图3所示的进化树，图中可看出CsUGT84A22基因被分到酯形成的糖基转移酶进化支，且与VvgGT1,VvgGT2和VvgGT3的亲缘关系比较近。
利用MEGA软件对CsUGT84A22基因的编码蛋白，VvgGT1基因的编码蛋白，VvgGT2基因的编码蛋白和VvgGT3基因的编码蛋白同源性进行分析，获得如图4所示的结果，图中可看出，CsUGT84A22基因的编码蛋白与已知功能的葡萄的三条VvgGT1,VvgGT2和VvgGT3基因的编码蛋白的一致性达到92％以上。
综上所述，CsUGT84A22基因被预测为具有苯甲酸类化合物糖酯化功能。
四、CsUGT84A22基因的原核表达及功能验证
本实施例中所用到的原核表达和及其功能验证技术手段为本领域的普通技术人员常用或完全可以理解技术手段。
1、将含有CsUGT84A22基因的T载体用Xba Ⅰ和Sal I进行双酶切，酶切产物连接到pMal-c2X载体的多克隆位点中，获得pMal-c2X-CsUGT84A22重组质粒；
2、将pMal-c2X-CsUGT84A22重组质粒转化到大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌中，接种到100μL的LB液体培养基，37℃，180r/min下培养45～60min；取100μL的菌液涂布于含100μg/mL Amp⁺的LB平板上，37℃倒置培养；
3、经过菌落PCR验证，挑取阳性菌落，接种至含2g/L的100mL的灭菌的LB液体培养基中，37℃，200r/min下震荡培养，直至OD₆₀₀≈0.6，获得转基因的工程菌；
4、在上述转基因的工程菌中加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃过夜培养，收集菌体，加入10mL上柱缓冲溶液，充分悬浮菌体，置于-20℃过夜，将菌体置于冰上解冻，待解冻后置于超声破碎仪中以15％功率超声破碎10min，12000rpm离心收集上清液；利用直链淀粉树脂亲和柱纯化重组蛋白(affinity chromatography on an amylase resin，New England Biolabs，MA，USA)，利用本领域常用的SDS-PAGE方法检测蛋白表达和纯化效果，结果如图5所示。
图5中可看出，pMal-c2X-CsUGT84A22重组质粒转化表达宿主菌Novablue(DE3)，诱导表达后，与诱导前(泳道1)相比，该基因在诱导后(泳道2)有重组蛋白的表达，且重组蛋白条带的大小与预测的一致，加上42.5kDa麦芽糖结合蛋白(MBP)重组标签后，在70kd到100kd之间有明显的重组蛋白条带；诱导后菌体经超声破碎离心后，上清中有可溶性重组蛋白(泳道3)，可用于进一步纯化分析；上清蛋白经直链淀粉树脂柱纯化后，得到较纯的重组蛋白rCsUGT84A22(泳道4)，纯化的蛋白可用于进一步的酶学分析。
五、CsUGT84A22重组蛋白的酶学活性检测分析
以酚酸类化合物作为底物，对CsUGT84A22重组蛋白的酶活进行检测，反应体系为50μL，在100mM，pH＝5.5的MES缓冲溶液中加入2.5mM的UDP-葡萄糖、0.5mM酚酸类化合物(没食子酸、丁香酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸或芥子酸)，6μg纯化后的CsUGT84A22重组蛋白和0.1％的β-巯基乙醇。
以类黄酮类化合物作为底物，对CsUGT84A22重组蛋白的酶活进行检测，反应体系为50μL，在100mM pH7.5的Tris-HCL缓冲溶液中加入5mM的UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖作为糖基供体，200μM潜在的类黄酮化合物(山奈酚、槲皮素、杨梅素、山奈素、柚皮素、 圣草酚、芹菜素、儿茶素或矢车菊色素)作为糖基受体、5-10μg的纯化后的CsUGT84A22重组蛋白和0.1％的β-巯基乙醇。
所有酶反应体系，30℃水浴30min后加入等体积的甲醇终止反应，矢车菊为底物的反应体系例外，需加入20μL的5％盐酸终止反应。反应均以空载蛋白作为对照。
酶反应产物经产物标准品结合HPLC-MS进行鉴定。
HPLC-MS检测条件如下：维特斯HSS T3色谱柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3，150mm×2.1mm，1.7tzm)；柱温为30℃；流速为1mL/min；进样体积为5μL；流动相A为含1％(v/v)乙酸溶液；流动相B为100％乙腈溶液；对于苯甲酸衍生物(没食子酸、丁香酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸)的检测，HPLC梯度程序设置为：0～10min，1％～10％B；10～17min，10～12％B；17～19min，12～1％B；对于类黄酮化合物的检测，HPLC梯度程序设置为：0～5min，10～15％B；5～15min，15～40％B；15～20min，40～60％B；20～25min，60～80％B；25～30min，80～10％B；光谱检测波长扫描范围为200～550nm。在化合物的MS定性识别中，采用ESI电喷雾离子源，负离子模式；毛细管电压为3.5kV，离子源温度为350℃，雾化气(氮气)流速为6L/min，化合物检测扫描质荷比范围设置为m/z 100～1000，碰撞电压为45V。
利用HPLC-MS对酶促反应产物进行检测，获得如图6和图7所示的结果，结果表明当以UDP-葡萄糖作为糖供体时，rCsUGT84A22可特异性的催化酚酸类底物(没食子酸、丁香酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸)，并于糖苷结合形成相应的酚酸酯葡萄糖，而类黄酮化合物作为底物时，并未检测到糖苷化产物的峰出现。另外，UDP-半乳糖作为糖供体时，CsUGT84A22对于类黄酮底物或酚酸类底物均未检测到任何酶活性。
在UDP-葡萄糖充足的情况下，分别以没食子酸、丁香酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸这7种酚酸类化合物作为底物，加入纯化后的rCsUGT84A22，在pH5.5条件下检测rCsUGT84A22对各酚酸类化合物底物的酶特异性。结果如图8所示，图中可看出，rCsUGT84A22对没食子酸活性最高，并生成没食子酰葡萄糖(1-O-没食子酰-β-D-葡糖苷，βG)，此化合物是茶树酯型儿茶素即茶饮料苦涩味化合物EGCG生物合成的直接前体底物。以没食子酸活性为100％，rCsUGT84A22对酚酸类化合物底物的催化活性大小顺序依次为没食子酸>对香豆酸>芥子酸>咖啡酸>阿魏酸>丁香酸>肉桂酸。