技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及革兰氏阳性球菌细菌表面单糖的合成，尤其涉 及肺炎链球菌23F中单糖的合成，更具体的说，是一种在革兰氏阳性菌中利用还原酶、 磷酸化酶和CDP转移酶合成CDP-2-甘油的制备方法及其用途。
背景技术
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界。 肺炎链球菌能否致病与其荚膜有密切关系，因为其荚膜能抵抗人体内吞噬细胞的吞噬作 用而大量繁殖，引起疾病。构成荚膜的多糖即荚膜多糖，由寡糖重复单元组成，构成这 些寡糖重复单元的单糖包括多种单糖，糖衍生物和糖类似物等，分为常见糖和罕见单糖。 常见糖(如葡萄糖，半乳糖)由于在细菌的其他基本代谢中同样需要，因此编码其合成 的基因不特别存在与荚膜多糖抗原基因簇中。罕见糖(如鼠李糖，阿拉伯糖和甘露糖) 仅存在于荚膜多糖中，编码其合成的基因位于荚膜多糖抗原基因簇中。
肺炎链球菌23F血清型的荚膜多糖由包含五个单糖(两个鼠李糖，1个半乳糖和1 个葡萄糖及1个甘油-2-磷酸)的寡糖重复单元组成。在这四种单糖中，半乳糖和葡萄糖 为两种最常见的单糖，在其它细菌表面抗原的组成中也有存在。鼠李糖虽为罕见单糖， 但是鼠李糖在革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌中的生物合成途径已经被研究。然而甘 油-2-磷酸的单糖合成路径未曾有过鉴定。因此，该合成途径的鉴定将为生物合成该罕见 糖奠定基础。
近年来，由于基因组学的迅速发展，已有200余种不同的细菌多糖基因簇被破译， 常见糖及一些罕见糖的合成基因的功能及其合成途径也已得到确认 (http://www.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)。糖具有高度的复杂性和多 样性。化学的方法只能合成部分单糖，而且成本高昂，化学合成罕见单糖有许多困难。与 生命有关的罕见单糖非常难分离。大量生产罕见单糖，多年来一直是糖科学研究的最重 要的目标。用生物技术大量生产罕见单糖是最有前景的途径。运用已确定功能的单糖合 成酶的组合，产生自然界中不存在或非常重要的罕见单糖，这对医疗和生物制药领域有 非常重要的意义。
目前，有关在肺炎链球菌23F中合成CDP-2-甘油(甘油-2-磷酸的前体)的酶学和 分子生物学特性还未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种在革兰氏阳性菌细菌表面中利用还原酶合成甘油 (glycerol)，利用磷酸化酶合成甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，进而合成CDP-2- 甘油(CDP-2-glycerol)。
本发明的另一目的是提供上述罕见单糖CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)的制备方法。
本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出了在肺炎链球菌23F中合成 甘油(glycerol)，甘油-2-磷酸(glycerol-2-phosphate)，进而合成CDP-2-甘油 (CDP-2-glycerol)的合成途径：
Gtp1 Gtp3 Gtp2
1，3-dihydroxyacetone——>glyceol——>glycerol-2-phosphate——> CDP-2-glycerol
在此合成路径中，这三种单糖及其所需要的还原酶，磷酸化酶和CDP转移酶是本发 明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出来的。为了实现上述目的，本发明提 供如下的技术方案：
一种在革兰氏阳性菌细菌中还原酶合成的甘油(Glycerol)。所述的革兰氏阳性菌 为肺炎链球菌23F，所述的还原酶为还原酶Gtp1；所述的编码还原酶Gtp1的基因具有选 自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列：
a)SEQID NO：1所示的核苷酸序列；
b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1 所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的还原酶的核 苷酸序列。
所述的还原酶Gtp1具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列：
j)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
k)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；
l)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列 的蛋白质有还原酶的活性。
本发明公开了还原酶Gtp1的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。
本发明公开了还原酶Gtp1的重组菌，所述的重组菌导入了还原酶。
本发明所述的甘油(Glycerol)经磷酸化酶Gtp3作用转化为甘油2-磷酸 (glycerol-2-phosphate)。
所述的编码磷酸化酶Gtp3的基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列：
d)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：2但编码的氨基酸序列与SEQID NO：2 所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的磷酸化酶的 核苷酸序列。
所述的磷酸化酶Gtp3具有选自于下列p)、q)或r)的氨基酸序列：
p)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
q)SEQID NO：5所示的氨基酸序列；
r)上述q)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列 的蛋白质有磷酸化酶的活性。
本发明所述的磷酸化酶Gtp3的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。
本发明所述的磷酸化酶Gtp3的重组菌，所述的重组菌导入了磷酸化酶Gtp3。
本发明所述的甘油2-磷酸(glycerol-2-phosphate)经CDP转移酶Gtp2的作用转化 为CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)。
本发明所述编码CDP转移酶Gtp2的基因具有选自于下列g)、h)或i)的核苷酸序列：
g)SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；
h)由于遗传密码的简并性，不同于SEQID NO：5但编码的氨基酸序列与SEQID NO：3 所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；
i)在严格杂交条件下与上述g)或h)中的序列杂交，并且编码具有活性的磷酸化酶的 核苷酸序列。
本发明所述的CDP转移酶Gtp2具有选自于下列该m)、n)或o)的氨基酸序列：
m)上述g)、h)或i)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
n)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列；
o)上述n)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列 的蛋白质有磷酸化酶的活性。
本发明所述的CDP转移酶Gtp2的重组质粒，所述的质粒的载体为pET-28a(+)。
本发明所述的CDP转移酶Gtp2的重组菌，所述的重组菌导入了CDP转移酶Gtp2。
应当指出的是，上述提到的术语“严格杂交条件”在本说明书中的含义是指在该条 件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相 互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交， 优选的是同源性不少于90％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件 而言，可以例如为如下的杂交条件：将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液， pH 7.0，7％SDS)中，50℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠 缓冲液，pH 7.0，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50℃杂交12hr；弃杂交液，加入 洗膜液I(2×SSC和0.1％SDS)，50℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(0.5×SSC 和0.1％SDS)，50℃洗膜30min。
所属技术领域的技术人员应该知道，本发明的编码罕见单糖合成的还原酶、磷酸化 酶和CDP转移酶的DNA序列，还包括编码对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3 所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失 并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
另外，对本发明的罕见单糖合成的还原酶、磷酸化酶和CDP转移酶基因所表达的酶 分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明 的目的。
因而本发明还包括与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列 具有至少70％的同源性，优选具有至少90％的同源性，但同时具有还原酶、磷酸化酶和 CDP转移酶酶活性的蛋白质。上面使用的术语“多个”可以是小于100的数目，优选为小 于10的数目。
此外，本发明的发明人对合成成CDP-2-甘油(CDP-2-glycerol)这种新的单糖的酶 进行了研究，以抑制上述单糖的合成或生产上述这种单糖，详述如下：
(1)调节还原酶的方法
本发明涉及到调节还原酶Gtp1的功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个还原酶将1， 3-二羟基丙酮转化为甘油。因为它拥有这个功能，所以它可以在商业上用来将1，3-二羟 基丙酮转化为甘油。
另一方面，本发明提供一种检验还原酶Gtp1活性的方法。向待测样品中加入足量的 NADH，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测终产物NAD的生成，进而检测甘油的生 成。
(2)调节磷酸化酶的方法
本发明涉及到调节磷酸化酶Gtp3的功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个磷酸化酶 将甘油转化为甘油-2-磷酸。
另一方面，本发明提供一种检验磷酸化酶Gtp3活性的方法。向待测样品中加入足量 的甘油，在适宜的条件和足够的时间下反应，Gtp3与Gtp2偶联，检测终产物CDP-2-甘 油的生成。
(3)调节CDP转移酶的方法
本发明涉及到调节CDP转移酶Gtp2功能的方法。在肺炎链球菌23F中这个CDP转移 酶将甘油-2-磷酸转化为CDP-2-甘油。因为Gtp2拥有这个功能，所以它可以在商业上用 来将甘油-2-磷酸转化为CDP-2-甘油。
另一方面，本发明提供一种检验CDP转移酶Gtp2活性的方法。向待测样品中加入足 量的甘油-2-磷酸，在适宜的条件和足够的时间下反应，检测CDP-2-甘油的生成。
本发明还提供一种检测有活性的物质的抑制因子的方法。这种筛选CDP转移酶Gtp2 活性抑制因子的方法包括①将包含以下物质的待测样品在一定条件下培养(a)有CDP转移 酶活性的物质(b)一个可能的抑制因子(c)甘油-2-磷酸；②终止反应；③比较样品与对 照(不含可能的抑制因子)中CDP-2-甘油的浓度，如果与样品比较，对照中的CDP-2-甘 油的浓度降低就说明找到了CDP转移酶Gtp2的活性抑制因子。
本发明进一步公开了CDP-2-甘油在制备治疗肺炎链球菌23F引起的细菌感染药物方 面的应用。
(1)利用本发明提供的序列制成反义寡核苷酸，然后利用反义寡核苷酸抑制对应基 因的表达或者制成药物，使对应罕见单糖的合成受阻，最终阻止细菌的繁殖。
本发明中的核酸序列相对于其正常转录状态可以转化为反义的核酸分子。更合适的 情况是，转化一个在起始密码子之前的区域或一个未被观察的区域，以得到反义序列。 特别地，本发明中的核酸分子包含的核酸序列或其中的片段，特别是SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核酸序列相对于其正常转录状态可以转化为反义的核酸分子。
本发明的反义核酸分子或其中一个片段可以通过使用天然存在的核苷酸或者各种用 来增加分子的生物稳定性或增加与mRNA或天然的基因结合的物理稳定性的修饰的核苷酸 (比如硫代磷酸化衍生物和吖啶替代核苷酸)进行化学合成。还可以用生物方法合成反 义序列：将表达载体以重组质粒、噬菌体质粒或减活病毒的形式转入细胞中。这样，反 义序列可以在高效调节区的控制下合成。合成效率取决于载体转入的细胞种类。
(2)利用本发明中的酶可制备单克隆抗体、多克隆抗血清或嵌和抗体衍生物等，这样 来抑制对应酶的活性，使对应罕见单糖的合成受阻。
本发明中蛋白的活性可以被针对本发明中蛋白的抗体抑制。可以用传统方法制备抗 体。比如，利用本发明中的蛋白或多肽，使用标准方法来制备多克隆抗血清或单克隆抗 体。用具有免疫原性形式的多肽来免疫哺乳动物(比如小鼠、大鼠或兔子)使之产生抗 体反应。使多肽具有免疫原性的技术包括将其连接到载体上或其它本领域公知的方法， 比如加入佐剂。免疫过程可以通过检测抗体在血浆或血清中的滴度方法控制。利用抗原 这样的免疫原和标准的ELISA实验或其它免疫检测方法来评估抗体的水平。免疫过程之 后可以获得抗血清，如果需要可以血清中分离多克隆抗体。
为生产单克隆抗体，可以从被免疫的动物中涉及抗体产生细胞(淋巴细胞)。这些 细胞可以通过标准的体细胞融合方法和骨髓瘤细胞融合，使之稳定并产生杂交瘤细胞。 这些技术在本领域是公知的，比如杂交瘤技术是由Kohler和Milstein(Nature 256， 495-497(1975))发明的，人体B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，Immunol.Today 4，72 (1983))，通过EBV-杂交瘤技术产生人体单克隆抗体(Cole等，《肿瘤治疗中的单克隆 抗体》(1985))Allen R.Bliss，Inc，77-96页)，和组合抗体库的筛选(Huse等，Science 246，1275(1989))。利用免疫化学方法筛选杂交瘤细胞，然后产生与多肽特异反应的 抗体，并且可分离出单克隆抗体。
嵌合抗体衍生物，比如由非人类动物的可变区合人类的恒定区组成的抗体也在本发 明的范围之内。例如嵌合抗体分子由来自鼠、小鼠或其它物种抗体的抗原结合位点和人 类的恒定区组成。可以用传统方法制备含有识别本发明中某一蛋白的免疫球蛋白可变区 的嵌合抗体(比如Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，6851(1985)；Takeda 等，Nature 314，452(1985)；Cabilly等，U.S.Pat.No.4,816,567；Boss等，U.S.Pat. No.4,816,397；Tanaguchi等，European Patent Publication EP171496；European Patent Publication 0173494，United Kingdom patent GB 2177096B)。
与本发明中某个蛋白特异反应的单克隆或嵌合抗体可以通过产生人类恒定区嵌合体 来进一步类人化。人类恒定区嵌合体中的可变区，特别是抗原结合位点的保守骨架区是 人源的，只有高变区是非人源的。这种免疫球蛋白分子可以通过本领域公知的技术制备 (比如Teng等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80，7308-7312(1983)；Kozbor等， Immunology Today，4，7279(1983)；Olsson等，Meth.Enzymol.，92，3-16(1982) 和PCT Publication WO92/06193或EP 0239400)。类人化的抗体也可进行商业生产 (Scotgen Limited，2Holly Road，Twickenham，Middlesex，Great Britain)。
(3)还可利用本发明中的核酸分子或蛋白分子制成疫苗来抑制细菌感染
本发明也涉及一种通过服用疫苗使机体对本发明中的蛋白产生免疫应答来抑制或处 理由肺炎链球菌23F引起的细菌胞感染的方法。
在美国针对肺炎链球菌的有效多价多糖疫苗，一种是适用于婴幼儿的，是2002年2 月通过许可的存在于蛋白载体上的7价多糖疫苗(4，6B，9V，14，18C，19F和23F)， 另一种是适用于成人的23价多糖疫苗。
本发明还提出一种生产可作为商品或其它反应底物的CDP-2-甘油的方法，该方法包 括在生产CDP-2-甘油过程中使用上述酶的步骤。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配 合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1Gtp1，gtp2和gtp3反应的毛细管电泳图；
图2Gtp2反应产物的一级质谱；
图3Gtp2反应产物的二级质谱；
图4Gtp2反应产物的核磁共振图。
具体实施方式
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合 说明书附图，作详细说明如下。以下各实施例仅仅是用于说明不是限制本发明。
实施例一合成酶基因的克隆
1.肺炎链球菌23F的总DNA提取
(1)取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于500μl 50mM Tris 缓冲液中(pH8.0)，离心去上清，菌体重悬于500μl 50mM Tris缓冲液中(pH8.0)加 入20μl 0.5M EDTA(pH8.0)，混匀后37℃保温20分钟，之后加入20μl 20mg/ml溶 菌酶，混匀后37℃保温15分钟，再加入25μl 20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后再加入 30μl 10％SDS，50℃保温至澄清，再加入10μl 25mg/ml RNA酶，65℃保温30分钟，分 别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次，最后一次的上清溶液加入 2.5倍体积的预冷的无水乙醇，回收DNA，用70％乙醇洗，沉淀溶于100μl TE缓冲液 (pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA)。将分离到的待测肺炎链球菌单菌落用血平板，37℃， 5％CO2培养箱过夜培养。
(2)将过夜培养的血琼脂培养基上的菌体刮至1.5ml的eppendorf管中，加入500μL 50mM的Tris(pH 8.0)重悬，10000rpm离心3分钟，弃上清。
(3)加入500μL 50mM Tris(pH 8.0)重悬，20μL 0.5M EDTA(pH8.0)，吹匀，37℃ 保温20分钟。
(4)加20μL 20mg/mL溶菌酶，混匀，37℃保温20分钟。
(5)加25μL 20mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。
(6)加30μL 10％SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清。
(7)加10μL 25mg/mL RNase，65℃水浴30分钟。
(8)加等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻柔颠倒数分钟，12000rpm 离心10分钟，上清转移至另一eppendorf管中，重复抽提一次。
(9)上清液转移至一新的eppendorf管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000 rpm离心10分钟，上清液转移至另一eppendorf管中。
(10)加2.5倍体积的预冷的无水乙醇，轻摇，沉淀DNA。
(11)用毛细管绕起DNA，并用70％冰乙醇洗涤。
(12)开盖37℃保温30分钟，挥发乙醇。
(13)将DNA溶于100μL TE中，DNA置-20℃冰箱保存。
2.还原酶Gtp1基因的克隆和筛选
取前面所述的肺炎链球菌23F总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物， 并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50.9℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。
引物序列见SEQ ID NO：7
SEQ ID NO：7
上游引物5’-GGGAATTCCATATGTTGAAAAATAATGATTTAAAGATA-3’
下游引物5’-CCGCTCGAGCTACAACTCGCTTATGAGTTC-3’
将上述PCR产物用NdeI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收1kb酶 切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受 态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养 12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQID No：1所示的DNA序列的 pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1282，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1550。采用 Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长1029bp。 由TTG起始密码开始，到TAG终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。 3磷酸化酶Gtp3基因的克隆和筛选
取前面所述的肺炎链球菌23F总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物， 并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。
引物序列见SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：8
上游引物5’-CATGCCATGGGCATGAAATTGACAAATAGAGTTGA-3’
下游引物5’-CCGCTCGAGGACAATTCCTTTCCACATT-3’
将上述PCR产物用NcoI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收0.8kb 酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感 受态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养 12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQ ID No：2所示的DNA序列的 pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1207，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1445。采用 Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长834bp。 由ATG起始密码开始，到TAT终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
4.CDP转移酶Gtp2基因的克隆和筛选
取前面所述的肺炎链球菌23F的总DNA溶液作为模板，以下列寡核苷酸序列为引物， 并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。
设定的PCR循环参数如下：
95℃，3min；95℃，30s；50℃，30s；72℃，1min；72℃，7min；4℃，2h。
引物序列见SEQ ID NO：9
SEQ ID NO：9
上游引物5’-CATGCCATGGGCATGAAAGCACTTATTTTAGCA-3’
下游引物5’-CCGCTCGAGAGCAAATAGTTTTTCTGCAG-3
将上述PCR产物用NcoI和XhoI双酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收0.7kb 酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感 受态大肠杆菌DH5α后，涂于50μg/ml Kan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37℃培养 12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQ ID No：3所示的DNA序列的 pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1263，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5α为H1520。采用 Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长705bp。 由ATG起始密码开始，到ATT终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。
实施例二合成酶的纯化
1.重组还原酶Gtp1的纯化和特性
将上述重组菌E.coliDH5αH1550中的质粒pLW1282提出，转入到E.coliBL21中， 并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中， 37℃，200rpm培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终 浓度为0.1mM，25℃，200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Binding buffer(50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞， 离心上清液为重组还原酶Gtp1的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的 蛋白质化学标准方法测定此重组该磷酸化酶的分子量为39.1KD，与理论推算的分子量 (38.3KD)相似。
2.重组磷酸化酶Gtp3的纯化和特性
将上述重组菌E.coliDH5αH1445中的质粒pLW1207提出，转入到E.coliBL21中， 并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中， 37℃，200rpm培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入200ml含50μg/ml Kan的LB培养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终 浓度为0.1mM，37℃，200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Binding buffer(50mM NaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞， 离心上清液为重组磷酸化酶Gtp3的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的 蛋白质化学标准方法测定此重组该磷酸化酶的分子量为31.7KD，与理论推算的分子量 (33.7KD)相似。
3.重组CDP转移酶Gtp2的纯化和特性
E.coli DH5αH1520中的质粒pLW1263提出，转入到E.coli BL21中，并筛选得到 阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃，200rpm 培养12小时，然后将培养物按1％(V/V)接种量接入250ml含50μg/ml Kan的LB培 养基(共2个摇瓶)，37℃，200rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mM， 37℃，200rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Binding buffer(50mM NaH2PO4pH 8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组CDP转 移酶Gtp2的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(Chelating Sepharose)镍亲合柱层析 纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此 重组CDP转移酶的分子量为27.5KD，与理论推算的分子量(28.3KD)相似。
实施例三肺炎链球菌23F中CDP-2-甘油产物的鉴定
1.重组还原酶Gtp1的作用
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：10mM 1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH， 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，2.97μM实施例二中制得的重组氧化还原酶Gtp1的纯化 酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ 毛细管电泳分析，结果如图1所示，结果显示NADH完全消失，有新产物NAD生成。初步 证明1，3-二羟基丙酮被还原为甘油。
2.重组CDP转移酶Gtp2的作用
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：20mM甘油-2-磷酸，50mM磷酸盐缓冲 液(pH 7.4)，5MM的CTP，0.013mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶 制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ 毛细管电泳分析，结果如图1所示，结果显示CTP完全消失，有新产物生成。重复此反 应，积累500μl体系后，经Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪检测，初步证明产物 为CDP-2-甘油，如图2所示。
3.重组磷酸化酶Gtp3的作用
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)， 0.071mM实施例二中制得的重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入 等体积的氯仿抽提，取水相，再加入相应比例的CTP和0.026mM实施例二中制得的重组 CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂37℃反应0.5小时。结果如图1所示，结果显示CTP完全 消失，有ATP和新产物生成。
实施例四终产物CDP-2-甘油的分离纯化及质谱检测方法
将反应体系注入岛津LC-20AT高效液相色谱中分离，使用Venusil MP-C18柱(4.6 ×250mm)，流动相为70％乙腈和30％水，流速为0.6ml/min。
将收集到的产物注入Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪检测。使用电喷雾源， 负相，4.5kV，220℃。以氮气作为碰撞气体，氦气为辅助气体。在做二级质谱时碰撞能 量为20-30eV。
实施例五肺炎链球菌合成途径的确定
肺炎链球菌中CDP-2-甘油合成途径中的三个酶Gtp1，Gtp3和Gtp2的功能均未在其 它菌株中被鉴定过。通过实施例三中的实验证明了肺炎链球菌23F中的还原酶Gtp1将1， 3-二羟基丙酮转化为甘油，磷酸化酶Gtp3将甘油转化为甘油-2-磷酸，CDP转移酶Gtp2 将甘油2-磷酸转化为CDP-2-甘油。至此证明了肺炎链球菌23F中CDP-2-甘油的合成途径 可以表述如下：
1，3二羟基丙酮→甘油→甘油-2-磷酸→CDP-2-甘油
实际制备方法如下：10mM的1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH，50mM磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)，2.97μM还原酶Gtp1的纯化酶制剂，37℃恒温水浴锅中反应0.5小时，1，3- 二羟基丙酮即被还原成甘油。然后5mM甘油，5mM ATP，5mM CTP，50mM磷酸盐缓冲液 (pH7.4)，0.05U/ml IP，0.071mM重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂和0.026mM的重 组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂，37℃水浴反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水 相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析，有CDP-2-甘油的生成。如果以甘油 -2-磷酸为底物，在下列条件下，同样可以实现CDP-2-甘油的制备。20mM的甘油-2-磷 酸，5mM CTP，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.07.4)，10mM MgCl2，0.05U/ml IP，0.013 mM的重组CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。
实施例六合成酶的活性鉴定
1.重组还原酶的活性鉴定
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：10mM的1，3-二羟基丙酮，1mM的NADH， 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，2.97μM实施例二中制得的重组还原酶Gtp1的纯化酶制 剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ 毛细管电泳分析。
(1)最适酶活温度
上述反应条件下，在4-75℃范围内测定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明该 酶的最适温度为37℃。
温度(℃) 4 15 25 37 50 55 60 65 转化率 (％) 8.8 10.8 24.8 37.4 49.3 66.5 76.5 86.6
(2)最佳反应pH
上述反应条件下，在pH 5.5-9.5范围内测定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明 该酶的最适pH范围为6.5-7.0。
pH 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5
转化率(％) 58.2 91.4 94.8 94.7 88.3 83.2 69.2 70.3 46.4
(3)金属离子影响
上述反应条件下，金属离子为NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+条件下， 测定上述重组还原酶Gtp1的活性，结果表明该还原酶对金属离子没有依赖，但是其中 Fe2+对其转化率有促进作用。
离子 无 NH4+ Cu2+ Ni2+ Zn2+ Mn2+ Ca2+ Fe3+ Co2+ Fe2+ Mg2+ 转化率(％) 62.3 76.8 38.9 23.8 45.0 46.2 56.3 56.6 55.3 91.2 66.4
(4)Km、kcat值测定
上述反应条件下(60℃)，50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)，0.496μM酶，5min)， 改变一种底物的浓度，测定NAD+的生成浓度，根据米氏方程得出上述重组CDP转移酶 Gtp2的Km值和kcat。
底物 Km(mM) Kcat(min-1) Vmax(mM min-1) 1，3-二羟基丙酮 0.12±0.01 50.40±11.23 0.025±0.006 甘油醛 0.19±0.03 21.47±4.96 0.021±0.005 NADH 1.74±0.21 247.98±34.39 0.123±0.02
2.重组CDP转移酶的活性测定
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油-2-磷酸，50mM磷酸盐缓 冲液(pH 7.4)，10mM MgCl2，0.013mM实施例二中制得的重组CDP转移酶Gtp2的纯 化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析。
(1)最适酶活温度
上述反应条件下，在4-75℃范围内测定上述重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果表明 该酶的最适温度为37℃。
温度(℃) 4 15 25 37 50 65 75 转化率(％) 13.3 24.9 33.6 60.9 29.9 8.7 5.7
(2)最佳反应pH
上述反应条件下，在pH 6.0-9.5范围内测定上述重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果 表明该酶的最适pH为8.0。
pH 6 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 转化率(％) 45.6 48.5 57.1 59.5 65.1 49.2 46.8 33.1
(3)金属离子的影响
上述反应条件下，金属离子为NH4+，Mg2+，Ca2+，Ni2+，Zn2+，Cu2+，Fe3+条件下，测定上述 重组CDP转移酶Gtp2的活性，结果表明该CDP转移酶对Mg2+有依赖，其中Fe3+对其转化率 有促进作用。Ni2+和Cu2+对其酶活的抑制作用最大。
离子 无 Fe2+ NH4+ Cu2+ Ni2+ Ca2+ Zn2+ Co2+ Mn2+ Fe3+ Mg2+ 转化率(％) 0 84.4 51.5 0 0 35.4 47.7 17.1 23.3 55.4 55.7
(4)Km、kcat值测定
上述反应条件下(37℃，50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)，0.028μM酶，5min)， 改变一种底物的浓度，测定CDP-2-甘油的生成浓度，根据米氏方程得出上述重组CDP转 移酶Gtp2的Km值和kcat。
底物 Km(mM) Kcat(min-1) Vmax(mMmin-1) 甘油2-磷酸 3.03±0.32 875.6±54.99 0.024±0.002 甘油-1-磷酸 13.49±0.18 623.73±149.84 0.017±0.004 CTP 0.15±0.02 755.63±251.89 0.021±0.007 dCTP 1.37±0.06 188.7±88.53 0.051±0.024
3.重组磷酸化酶的活性鉴定
在0.5ml离心管中装入20μl下列反应体系：5mM甘油，50mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)， 0.071mM实施例二中制得的重组磷酸化酶Gtp3的纯化酶制剂。37℃反应0.5小时。加入 等体积的氯仿抽提，取水相，再加入相应比例的CTP和0.026mM实施例二中制得的重组 CDP转移酶Gtp2的纯化酶制剂37℃反应0.5小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经 Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳分析。
虽然本发明已较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域 的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的 保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>南开大学
<120>一种在革兰氏阳性菌中合成的CDP-2-甘油及其制备方法与用途
<160>12
<210>1
<211>1029bp
<212>DNA
<213>基因序列
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1029)
<400>1
ttgaaaaata atgatttaaa gataggaagt ggagctattc atcaaatctc cgctacactt 60
tctcaaaata atatttcggg aaagatttta tattgtgctg atccagttgt cgatgacttg 120
tacggttcga tagtacgttc acaaatagag gaaattggtc gggtaaagga agaaagttgc 180
aattataata ctattgctta tgcgatgaat atagcagaaa gggctattgc cacagatatt 240
gactgtattg tgggaatggg aggaggtcgt gttttagatg tctgcaagta tgcatctttt 300
atttcgaaac gtccttacct atcgattccg acaacagcag caaatgatgg cattgcttcc 360
ccagttgctg ttttgaaaag gcaggatgat agaccaaaaa gcttaggggc ggctatcccc 420
tcaatgacac taattgatat tgatgttatt gcatcaggac ctatacaaaa cataaaagct 480
ggtatcggtg atacaatatc caattacact gcattgaaag attgggagtt ggcagttgag 540
cgagggaaag atgagatgca tggttttgca tatctaatgt cgcaaaattc tttagatgct 600
ttaatgaaaa cgaagtataa ttctattacc cctgatttta ttgaagtttt ggtaaactct 660
ttagttttat caggcattgc aatggatttt gcgggaagta gtagacctgt cagtgggtca 720
gagcacttat ttagtcatgc attagattac tatggttcta caaggaatct tcatggaatt 780
caggttgcat taggtacagt cgcagttttg aaattaattg aaaattctgt tgatgctgtg 840
gtggattact tgcaaagatt tgaggttcat attaacccga aacttttggg gatagatgaa 900
gagttgttta tttattgtat gcaacatgct acaaaaatga gaagtaatcg ctatacttat 960
ctgcatgagg ttgatcttag tacagataga ttgaaacaaa tatataagga actcataagc 1020
gagttgtag 1029
<210>2
<211>834bp
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>基因序列
<222>(1)..(834)
<400>2
atgaaattga caaatagagt tgattatttt ggtgctgata ttagtgaact tcagaataaa 60
aaattattct tatttgatat ggatggtacc atttatgaag aagatagatt gtttgagggt 120
actctcgaat tattagacta tattcataat attggcggtg agtatatttt tattacaaac 180
aattcatcta agtctgttgt tgactatgtt gaaaaagtta acagattagg tattaaagct 240
gaacgagata atttttttac ctctgctcaa gccacaattg tttatattaa agaaaattat 300
cctaaatcta aagtttattg ccaaggaaca aaatctttga taaaagaact atctgacgca 360
ggaattgatg taactgagca agttagtgct gatatagatg ttgttcttgt tggttttgat 420
acagaattaa ccagtgataa aattcgcaat acctgcgaga ttctatcaac aaaggacgta 480
cctttcatag ctactaaccc tgatattcgc tgcccagtat cgtttggatt catcccagat 540
tgtggttcta tttgtgatat gattagtaaa tcagtcgata ggaaacctgt ttacataggt 600
aaacctgaac ctacgatggt tgatattgtt cgaaaaaaat taaattattc tctatttgaa 660
acagttgtga ttggagatcg cttgtatacg gatatcatga ctggtataaa tgcaggagta 720
acttcagttt gtgtgctgac aggagaagca acggtgaatg atattcaaca aggtagtata 780
aaaccgactt atacatttaa aaacgtgaaa gaaatgtgga aaggaattgt ctga 834
<210>3
<211>705bp
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<221>基因序列
<222>(1)..(705)
<400>3
atgaaagcac ttattttagc agcagggtta ggaacacgtc tagccccaat taccaatgag 60
gtaccaaaat ctttggtacc agtcaatggt aagccaattt tgatgaaaca aattgaaaat 120
ttatatcaaa ataatattac agatattacg attattgctg gatataagtc atctgtatta 180
acagatgcag ttactgaaaa gtatccagaa attaatatta ttgataatgt tgattttaaa 240
acgactaata atatgtattc agcctatcta ggaaaagctg caatgggtga tagtgacttc 300
ttaatgatga atgcagatgt attttatgat gcttctgtta ttaaaagtct gttgcttcat 360
aaagctccaa atgcaattgt aactgattta ggtacttata ttgaagagtc tatgaaagtc 420
gtagaaaaaa atgggcgttt agtggaaatt tctaaacaga tttcacctga ggaggcttta 480
ggggcttcta ttgatgttta taaattctct tatgaagcag gtgctcgatt ctttgaaaag 540
tgtaaggaat ttattgaaga taaacgagaa cttcaaatgt ggagtgaggt tgctcttaat 600
gcaatccttc cagaagttga gtttatagca tgtccattgg atggccgttg gttagaaatt 660
gataatcatg aagacctagc tgttgcagaa aaactatttg cttaa 705
<210>4
<211>342bp
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(342)
<400>4
Leu Lys Asn Asn Asp Leu Lys Ile Gly Ser Gly Ala Ile His Gln Ile
1 5 10 15
Ser Ala Thr Leu Ser Gln Asn Asn Ile Ser Gly Lys Ile Leu Tyr Cys
20 25 30
Ala Asp Pro Val Val Asp Asp Leu Tyr Gly Ser Ile Val Arg Ser Gln
35 40 45
Ile Glu Glu Ile Gly Arg Val Lys Glu Glu Ser Cys Asn Tyr Asn Thr
50 55 60
Ile Ala Tyr Ala Met Asn Ile Ala Glu Arg Ala Ile Ala Thr Asp Ile
65 70 75 80
Asp Cys Ile Val Gly Met Gly Gly Gly Arg Val Leu Asp Val Cys Lys
85 90 95
Tyr Ala Ser Phe Ile Ser Lys Arg Pro Tyr Leu Ser Ile Pro Thr Thr
100 105 110
Ala Ala Asn Asp Gly Ile Ala Ser Pro Val Ala Val Leu Lys Arg Gln
115 120 125
Asp Asp Arg Pro Lys Ser Leu Gly Ala Ala Ile Pro Ser Met Thr Leu
130 135 140
Ile Asp Ile Asp Val Ile Ala Ser Gly Pro Ile Gln Asn Ile Lys Ala
145 150 155 160
Gly Ile Gly Asp Thr Ile Ser Asn Tyr Thr Ala Leu Lys Asp Trp Glu
165 170 175
Leu Ala Val Glu Arg Gly Lys Asp Glu Met His Gly Phe Ala Tyr Leu
180 185 190
Met Ser Gln Asn Ser Leu Asp Ala Leu Met Lys Thr Lys Tyr Asn Ser
195 200 205
Ile Thr Pro Asp Phe Ile Glu Val Leu Val Asn Ser Leu Val Leu Ser
210 215 220
Gly Ile Ala Met Asp Phe Ala Gly Ser Ser Arg Pro Val Ser Gly Ser
225 230 235 240
Glu His Leu Phe Ser His Ala Leu Asp Tyr Tyr Gly Ser Thr Arg Asn
245 250 255
Leu His Gly Ile Gln Val Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Leu Lys Leu
260 265 270
Ile Glu Asn Ser Val Asp Ala Val Val Asp Tyr Leu Gln Arg Phe Glu
275 280 285
Val His Ile Asn Pro Lys Leu Leu Gly Ile Asp Glu Glu Leu Phe Ile
290 295 300
Tyr Cys Met Gln His Ala Thr Lys Met Arg Ser Asn Arg Tyr Thr Tyr
305 310 315 320
Leu His Glu Val Asp Leu Ser Thr Asp Arg Leu Lys Gln Ile Tyr Lys
325 330 335
Glu Leu Ile Ser Glu Leu
340
<210>5
<211>277bp
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(277)
<400>5
Met Lys Leu Thr Asn Arg Val Asp Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Ser Glu
1 5 10 15
Leu Gln Asn Lys Lys Leu Phe Leu Phe Asp Met Asp Gly Thr Ile Tyr
20 25 30
Glu Glu Asp Arg Leu Phe Glu Gly Thr Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Ile
35 40 45
His Asn Ile Gly Gly Glu Tyr Ile Phe Ile Thr Asn Asn Ser Ser Lys
50 55 60
Ser Val Val Asp Tyr Val Glu Lys Val Asn Arg Leu Gly Ile Lys Ala
65 70 75 80
Glu Arg Asp Asn Phe Phe Thr Ser Ala Gln Ala Thr Ile Val Tyr Ile
85 90 95
Lys Glu Asn Tyr Pro Lys Ser Lys Val Tyr Cys Gln Gly Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Ile Lys Glu Leu Ser Asp Ala Gly Ile Asp Val Thr Glu Gln Val
115 120 125
Ser Ala Asp Ile Asp Val Val Leu Val Gly Phe Asp Thr Glu Leu Thr
130 135 140
Ser Asp Lys Ile Arg Asn Thr Cys Glu Ile Leu Ser Thr Lys Asp Val
145 150 155 160
Pro Phe Ile Ala Thr Asn Pro Asp Ile Arg Cys Pro Val Ser Phe Gly
165 170 175
Phe Ile Pro Asp Cys Gly Ser Ile Cys Asp Met Ile Ser Lys Ser Val
180 185 190
Asp Arg Lys Pro Val Tyr Ile Gly Lys Pro Glu Pro Thr Met Val Asp
195 200 205
Ile Val Arg Lys Lys Leu Asn Tyr Ser Leu Phe Glu Thr Val Val Ile
210 215 220
Gly Asp Arg Leu Tyr Thr Asp Ile Met Thr Gly Ile Asn Ala Gly Val
225 230 235 240
Thr Ser Val Cys Val Leu Thr Gly Glu Ala Thr Val Asn Asp Ile Gln
245 250 255
Gln Gly Ser Ile Lys Pro Thr Tyr Thr Phe Lys Asn Val Lys Glu Met
260 265 270
Trp Lys Gly Ile Val
275
<210>6
<211>234bp
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>(1)..(234)
<400>6
Met Lys Ala Leu Ile Leu Ala Ala Gly Leu Gly Thr Arg Leu Ala Pro
1 5 10 15
Ile Thr Asn Glu Val Pro Lys Ser Leu Val Pro Val Asn Gly Lys Pro
20 25 30
Ile Leu Met Lys Gln Ile Glu Asn Leu Tyr Gln Asn Asn Ile Thr Asp
35 40 45
Ile Thr Ile Ile Ala Gly Tyr Lys Ser Ser Val Leu Thr Asp Ala Val
50 55 60
Thr Glu Lys Tyr Pro Glu Ile Asn Ile Ile Asp Asn Val Asp Phe Lys
65 70 75 80
Thr Thr Asn Asn Met Tyr Ser Ala Tyr Leu Gly Lys Ala Ala Met Gly
85 90 95
Asp Ser Asp Phe Leu Met Met Asn Ala Asp Val Phe Tyr Asp Ala Ser
100 105 110
Val Ile Lys Ser Leu Leu Leu His Lys Ala Pro Asn Ala Ile Val Thr
115 120 125
Asp Leu Gly Thr Tyr Ile Glu Glu Ser Met Lys Val Val Glu Lys Asn
130 135 140
Gly Arg Leu Val Glu Ile Ser Lys Gln Ile Ser Pro Glu Glu Ala Leu
145 150 155 160
Gly Ala Ser Ile Asp Val Tyr Lys Phe Ser Tyr Glu Ala Gly Ala Arg
165 170 175
Phe Phe Glu Lys Cys Lys Glu Phe Ile Glu Asp Lys Arg Glu Leu Gln
180 185 190
Met Trp Ser Glu Val Ala Leu Asn Ala Ile Leu Pro Glu Val Glu Phe
195 200 205
Ile Ala Cys Pro Leu Asp Gly Arg Trp Leu Glu Ile Asp Asn His Glu
210 215 220
Asp Leu Ala Val Ala Glu Lys Leu Phe Ala
225 230
<210>7
<211>38bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
gggaattcca tatgttgaaa aataatgatt taaagata 38
<210>8
<211>30bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ccgctcgagc tacaactcgc ttatgagttc 30
<210>9
<211>35bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
catgccatgg gcatgaaatt gacaaataga gttga 35
<210>10
<211>28bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ccgctcgagg acaattcctt tccacatt 28
<210>11
<211>33bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
catgccatgg gcatgaaagc acttatttta gca 33
<210>12
<211>29bp
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
ccgctcgaga gcaaatagtt tttctgcag 29