技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地说是谷胱甘肽废液在微生物生产中的应 用及应用方法。
背景技术
谷胱甘肽，一般指还原性谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，它是一种广 泛存在于人体正常细胞内的生物活性物质，是人类细胞中自然合成的含量最 丰富的含巯基的低分子三肽，临床证明还原性谷胱甘肽是一种用途广泛的小 分子肽类活性物质，具有重要的抗氧化和整合解毒作用，用于病毒性、药物 毒性、酒精毒性及其它化学物质引起的肝脏损害，也是癌症患者放化疗时的 辅助治疗药物，对急性贫血、成人呼吸窘迫综合症、败血症联合治疗有着积 极的作用。
目前，谷胱甘肽制备方法主要有溶剂提取法、化学合成法、酶合成法、 微生物发酵法。溶剂提取法主要利用小麦胚芽、酵母为原料，虽然已经工业 化，但工艺较落后，生产规模小且产量低，而且产品质量不高；化学合成法 主要利用谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸为原料，工艺较成熟，但存在成本高、 反应步骤多、反应时间长、操作复杂的缺点，同时产物为谷胱甘肽的左旋体 和右旋体的混合物，化学拆分困难，由此造成了产品纯度不高，并且环境污 染很严重限制了该方法的应用；酶合成法主要是以谷氨酸、半管氨酸、甘氨 酸为底物，利用谷胱甘肽合成酶，加入ATP合成，处于研究阶段，虽然酶法 生产工艺明确，产品纯度较高，但是操作复杂，而且需要底物氨基酸和昂贵 的ATP，因此生产成本很高。
微生物发酵法生产谷胱甘肽主要以糖类为原料，利用酵母和大肠杆菌体 内物质代谢来获得谷胱甘肽，具有反应条件温和、成本低、生产效率快等优 点，其生产过程为：无菌条件下接入种子液，在一定温度下，通风培养，得 到含有谷胱甘肽的发酵液，将发酵液离心过滤(1)，得到含有谷胱甘肽的菌 体，将洗涤好的菌体制成菌悬液，离心过滤(2)，取滤液加入适量物料反应 生成沉淀，将沉淀制成混悬液，离心过滤(3)，将滤液脱色、浓缩、结晶、 离心(4)得到谷胱甘肽湿晶体，最后用真空干燥得到谷胱甘肽干品。
微生物发酵法生产谷胱甘肽过程中的设备清洗废水、发酵液离心后的残 液、地面冲洗废水、离心结晶母液等各种废水共同构成谷胱甘肽发酵生产废 液。各种废液直接排放不仅会严重污染环境，而且造成资源浪费。利用传统 的物化处理技术、生物处理技术如凝聚法、蒸发浓缩法、吸附法、活性污泥 法、生物活性炭法、生物膜法等进行废水处理，虽然能够达标，但是基建投 资及运行维护费用高，工艺复杂，废弃物再生利用率低，易产生二次污染。
谷胱甘肽废液资源化是谷胱甘肽企业可持续发展的最佳战略，但相关研 究成果还未见报道。
发明内容
本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供谷胱甘肽废液在微 生物生产中的应用。
本发明进一步的技术任务是提供上述应用的应用方法。
谷胱甘肽废液中含有大量的氨基酸、糖类、粗蛋白、营养盐等营养成分， 经过申请人大量实验验证得到，将谷胱甘肽废液应用于微生物生产中，可达 到意想不到的技术效果。
在微生物生产中，可以以谷胱甘肽废液作为种子培养基有效成分使用。
为了更好地适应培养需要，可以将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍， 在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h， 降温至27～36℃后作为种子培养基使用。
利用种子培养基进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子 罐公称容积的50％～75％，优选60％，接种量控制在种子罐实际装料量的 0.5％～2.0％(接入种子罐中的种子液体积与种子罐内装的料液体积之比)， 在适当温度、pH值、通气量及搅拌速度下发酵一定时间，得到种子罐培养 液。
种子罐培养时使用的种子液体，可通过现有技术中公知的菌种种子液制 备方法得到。例如，可以首先对保藏菌种进行斜面活化，然后对活化后的菌 种进行三角瓶种子制备。菌种活化、三角瓶种子制备时所使用培养基的类型、 成分不影响本发明技术效果的实现。
在微生物生产中，还可以以谷胱甘肽废液作为发酵培养基有效成分使 用。
为了更好地适应培养需要，可以将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍， 在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h， 降温至27～36℃后作为发酵培养基使用。
利用发酵培养基进行发酵罐培养时，发酵罐的培养基装料量控制在发酵 罐公称容积的50％～75％，优选60％，培养液的接种量控制在发酵罐实际装料 量的3％～10.0％(接入发酵罐中的种子液体积与发酵罐内装的料液体积之 比)，在适当温度、pH值、通气量及搅拌速度下发酵一定时间，得到发酵液。
利用上述种子培养基和发酵培养基进行种子罐培养和发酵罐培养时，温 度、pH值、通气量、搅拌速度及发酵时间可根据待发酵微生物自身特性确 定，例如：
地衣芽胞杆菌种子罐培养时，发酵温度控制在28～31℃，优选30℃； pH控制在6.8～7.2，优选7.0；搅拌转速控制在160～180r/min，优选 170r/min；通气量控制在1VVm～2VVm，优选1.5VVm；培养18h～26h，优选 24h。
地衣芽胞杆菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同地衣芽胞 菌种子罐培养。
产朊假丝酵母菌种子罐培养时，发酵温度控制在27～30℃，优选28℃； pH控制在5.8～6.2，优选6.0；搅拌转速控制在190～220r/min，优选 200r/min；通气量控制在1VVm～2VVm，优选1.5VVm；培养20h～26h，优选 24h。
产朊假丝酵母菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同产朊假 丝酵母菌种子罐培养。
嗜酸乳杆菌种子罐培养时，发酵温度控制在35～37℃，优选36℃；pH 控制在5.6～6.0，优选5.8；搅拌转速控制在135～160r/min，优选150r/min； 不通气，培养23h～36h，优选30h。
嗜酸乳杆菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同嗜酸乳杆菌 种子罐培养。
枯草芽孢杆菌种子罐培养时，发酵温度控制在28～30℃，优选29℃； pH控制在7.0～7.2，优选7.2；搅拌转速控制在135～160r/min，优选 150r/min；通气量控制在1VVm～3VVm，优选1.5VVm；培养24h～36h，优选 30h。
枯草芽孢杆菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同枯草芽孢 杆菌种子罐培养。
德式乳杆菌保加利亚亚种种子罐培养时，发酵温度控制在28～32℃，优 选30℃；pH控制在6.2～6.5，优选6.3；搅拌转速控制在130～155r/min， 优选150r/min；不通气，培养22h～30h，优选28h。
德式乳杆菌保加利亚亚种发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件 同德式乳杆菌保加利亚亚种种子罐培养。
苏云金芽孢杆菌种子罐培养时，发酵温度控制在35～37℃，优选36℃； pH控制在7.0～7.2，优选7.2；搅拌转速控制在135～160r/min，优选 150r/min；通气量控制在1VVm～3VVm，优选1.5VVm；培养24h～36h，优选 32h。
苏云金芽孢杆菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同苏云金 芽孢杆菌种子罐培养。
解淀粉芽孢杆菌种子罐培养时，发酵温度控制在35～37℃，优选36℃； pH控制在6.8～7.2，优选7.0；搅拌转速控制在140～160r/min，优选155r/min； 通气量控制在1VVm～3VVm，优选1.5VVm；培养24h～36h，优选32h。
解淀粉芽孢杆菌发酵罐培养时，发酵培养液的配方和控制条件同解淀粉 芽孢杆菌种子罐培养。
作为优选，所述谷胱甘肽废液为微生物发酵法生产谷胱甘肽过程中发酵 液离心后的残液，即背景技术中所述的发酵液离心过滤(1)的残液。其主 要营养物质及其含量为：氮1.48g/100mL～1.55g/100mL；磷0.096g/100mL～ 0.12g/100mL；钾3.0g/100m～3.08g/100mL；有机质40.35g/100mL～ 41.0g/100mL；氨基酸总量4.9～5.02g/100mL；粗蛋白含量14.86～ 15.31g/100mL；可溶性固形物含量38.0g/100mL～38.86g/100mL，含糖量 17.85g/100mL～18.24g/100mL，pH5.0～5.5g/100mL；水分53.50％～ 55.20g/100mL。
所述的种子罐培养基初始pH、发酵罐培养基初始pH、种子罐培养过程 中料液pH、发酵罐培养过程中料液pH控制，均由摩尔浓度为1mol/L的氢 氧化钠溶液、摩尔浓度为1mol/L的盐酸溶液来调节。
所述的地衣芽胞杆菌、产朊假丝酵母菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、 德式乳杆菌保加利亚亚种这五种微生物，原菌种出自中国工业微生物菌种保 藏管理中心(CICC)，它们既可作为农业微生物应用，也可作为畜牧饲料添 加剂应用，还可作为环保净化用。
所述的苏云金芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这两种微生物，原菌种出自中 国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，它们可作为农业微生物用。
本发明谷胱甘肽废液在微生物生产中的应用及应用方法与现有技术相 比具有以下突出的有益效果：
(一)利用谷胱甘肽废液生产微生物，改变了谷胱甘肽企业“废弃物达 标即排”的旧观念，形成“变废为宝”，“污染零排放”的生态生产新观念， 既降低了微生物生产成本，又节省了废水处理的高额费用，节能环保，充分 发挥了物质的生产潜力，提高了资源的利用率：谷胱甘肽废液成为生产功能 微生物的原料，使企业不仅享有主产品(谷胱甘肽)经济效益，也同时享有 副产品(功能微生物)经济效益,提高了企业市场竞争力，使企业保持可持 续性的发展。
(二)利用谷胱甘肽废液生产的微生物既是动、植物营养调节剂，又是 生物肥料和全能型的饲料添加剂，可以广泛用于农业、畜牧业、环境保护等 领域，具有巨大的社会效益及经济效益；
(三)在种植业方面，利用谷胱甘肽废液生产的微生物能提高农作物的 产量；改善农产品品质；增强作物的抗病、抗逆能力；防止重茬使作物连续 栽培；连续使用，提高土壤肥力；降低农产品的药物残留，延长保质期，是 建设有机食品(OEDC)生产基地的理想选择。
(四)在畜牧业方面，利用谷胱甘肽废液生产的微生物发酵液含有多种 微生物合成的大量糖类，氨基酸、维生素等生理活性物质；含有多种消化酶 和代谢酶，作为饲料添加剂，能够分解饲料中的粗纤维，提高饲料的消化利 用率；提高畜禽免疫力、减轻动物病害；改善畜产品品质；提高畜禽成活率、 产蛋率、产奶率，缩短出栏周期；消除畜禽粪便恶臭，改善生态环境。
(五)环境保护方面，利用谷胱甘肽废液生产的微生物，可作为环保净 化剂，用于处理生活垃圾时，能除去垃圾臭气，净化垃圾渗流水质，降低垃 圾的苍蝇密度，还可把垃圾等废弃物发酵成生物有机肥，发展可持续农业。
(六)本发明以功能微生物为关键技术点，利用谷胱甘肽废液为原料， 通过低成本运行费用的新技术、新工艺，生产多元化的功能微生物并应用于 种植业、畜牧养殖业和环保业，对这三大关联产业将产生极大的带动作用， 意义重大。
具体实施方式
以具体制备实施例、实验例对本发明的谷胱甘肽废液在微生物生产中的 应用及应用方法作以下详细地说明。
各实施例中，均以1mol/L的氢氧化钠溶液或1mol/L的盐酸溶液调节料 液或培养基pH值。
制备实施例一：
【原料】
2014年9月，以取自山东金城生物药业有限公司的谷胱甘肽废液(即 微生物发酵法生产谷胱甘肽时的发酵液离心后的残液)为原料。经山东省农 业科学院农业资源与环境研究所检测，其成分组成：氮1.51g/100mL；磷 0.10g/100mL；钾3.05g/100mL；有机质40.75g/100mL；可溶性固形物含量 38.4g/100mL，含糖量18g/100mL，pH5.11；水分54.34％。
经农业部都市农业(北方)重点实验室日历L-8900高速氨基酸自动分析 仪检测，其18种氨基酸和粗蛋白含量分析见表1：
表1谷胱甘肽废液中的18种氨基酸和粗蛋白含量分析
【菌种来源】
地衣芽胞杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种 保藏管理中心，编号CICC23584。
【发酵液制备】
1)地衣芽胞杆菌菌种活化
斜面培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl1.5％，琼脂1.5％， 调培养基至pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试 管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的地衣芽胞杆菌菌种接种到斜 面中，30℃条件下活化48h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)地衣芽胞杆菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl1.5％， MnSO4·H2O5ppm，调培养基至初始pH7.0，121℃～125℃，0.103MPa～ 0.168MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取1～2环经步骤1)活化的地 衣芽胞杆菌斜面菌种，接入装量为30mL液体培养基的250mL三角瓶中，置 于170r/min中摇床中，30℃恒温培养24h，得到地衣芽胞杆菌三角瓶种子 液。
3)地衣芽胞杆菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH控制在7.0 (以1mol/L的氢氧化钠溶液或1mol/L的盐酸溶液调节)，121℃，0.103MPa， 灭菌1h，降温至30℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐的体积为200L，种子罐的培养基装料量控制 在种子罐公称容积的60％，即种子罐的装料量为120L，在无菌条件下，取经 步骤2)制备的地衣芽胞杆菌三角瓶种子液(50个三角瓶的种子液共1.5L， 即接种量为种子罐装料量的1.25％)接入种子罐中，使发酵温度控制在30℃， 发酵过程中pH控制在7.0，搅拌转速控制在170r/min，通气量控制在 1.5VVm[指单位时间(min)单位种子液体积(m3)通入的标准状态下的空气 体积(m3)]，培养24h，得到地衣芽胞杆菌种子罐培养液，培养结束时，测 得芽孢形成率为83％，活菌数为10.37×108CFU/mL，杂菌污染率为0.26％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH7.0，121℃， 0.103MPa，灭菌0.5h，降温至30℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m3,发酵罐实际装料量为3m3，在无 菌条件下，取经步骤3)制备的地衣芽胞杆菌种子罐培养液全部接入发酵罐 中，经计算，接种量体积发酵罐实际装料量体积的4％，发酵温度控制在30℃， 发酵过程中pH控制在7.0，搅拌转速控制在170r/min，通气量控制在 1.5VVm，保持发酵24h，得到发酵液。
发酵液指标：pH7.02；地衣芽胞杆菌含菌量12.61×108CFU/mL；芽孢含 量73％，重金属2.3mg/Kg；霉菌数8CFU/mL；大肠杆菌4CFU/100mL；沙门氏 菌无检出。
制备实施例二：
【原料】
同制备实施例一。
【菌种来源】
嗜酸乳杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保 藏管理中心，编号CICC6074)。
【发酵液制备】
1)嗜酸乳杆菌菌种活化
斜面培养基制备：酪蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，葡萄糖0.5％， 乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，Tween800.1％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O0.02％， CaCO32％，琼脂1.5％，调培养基的pH5.8，121℃，0.103MPa，灭菌30min， 无菌条件下制备斜面试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌接种到斜面中， 36℃条件下活化36h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)嗜酸乳杆菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：酪蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，葡萄 糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，Tween800.1％，K2HPO40.2％， MgSO4·7H2O0.02％，CaCO32％，pH5.8，121℃，0.103MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤1)活化的嗜酸乳 杆菌菌斜面菌种，接入装量为100mL液体培养基的500mL三角瓶中，置于 150r/min中摇床中，36℃封口培养30h，得到嗜酸乳杆菌菌三角瓶种子液。
3)嗜酸乳杆菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释8倍，pH5.8，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至36℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐的体积为250L，种子罐的装料量控制在种子 罐公称容积的60％，即种子罐的装料量为150L，取经步骤2)制备的嗜酸乳 杆菌三角瓶种子液(12个三角瓶的种子液共1.2L)接入种子罐中，即接种 量为种子罐实际装料量的0.8％，发酵温度控制在36℃，pH控制在5.8，搅 拌转速控制在150r/min，不通气，培养30h，得到嗜酸乳杆菌种子罐培养液， 培养结束时测得活菌数为20.64×108CFU/mL，杂菌污染率为0.37％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释8倍，pH5.8，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至36℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m3,装料量为3m3，在无菌条件下， 取经步骤3)制备的嗜酸乳杆菌种子罐培养液全部接入发酵罐中，经计算， 接种量为发酵罐装料量的5％，发酵温度控制在36℃，pH控制在5.8，搅拌 转速控制在150r/min，不通气，培养30h，得到发酵液。
发酵液指标：pH5.76；嗜酸乳杆菌含菌量25.86×108CFU/mL；重金属 1.67mg/Kg；霉菌数11CFU/mL；大肠杆菌7CFU/100mL；沙门氏菌无检出；外 观、气味具有酸香味的深棕色液体。
制备实施例三：
【原料】
2014年12月，以取自山东金城生物药业有限公司的谷胱甘肽废液(即 微生物发酵法生产谷胱甘肽时的发酵液离心后的残液)为原料。经山东省农 业科学院农业资源与环境研究所检测，其成分组成：氮1.53g/100mL；磷 0.097g/100mL；钾3.04g/100mL；有机质40.97g/100mL；可溶性固形物含量 38.33g/100mL，含糖量17.78g/100mL，pH5.22；水分53.94％。
经农业部都市农业(北方)重点实验室日历L-8900高速氨基酸自动分析 仪检测，其18种氨基酸和粗蛋白含量分析见表2：
表2谷胱甘肽废液中的18种氨基酸和粗蛋白含量分析
【菌种来源】
产朊假丝酵母菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌 种保藏管理中心，编号CICC31188)。
【发酵液制备】
1)产朊假丝酵母菌菌种活化
斜面培养基制备：5°Bé麦芽汁，琼脂1.5％，自然pH，121℃，0.103MPa， 灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的产朊假丝酵母菌接种到斜面 中，28℃条件下活化48h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)产朊假丝酵母菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：5°Bé麦芽汁，自然pH，121℃，0.103MPaMPa， 灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤1)活化的产朊假 丝酵母菌斜面菌种，接入装量为50mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于 200r/min中摇床中，28℃恒温培养24h，得到产朊假丝酵母菌三角瓶种子液。
3)产朊假丝酵母菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释12倍，pH6.0，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至28℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐体积250L，种子罐的装料量控制在种子罐公 称容积的60％，即种子罐的装料量为150L，在无菌条件下，取经步骤2)制 备的产朊假丝酵母菌三角瓶种子液(60个三角瓶的种子液共3L)，即接种量 为种子罐装料量的2％，接入种子罐中，发酵温度控制在28℃，pH控制在6.0， 搅拌转速控制在200r/min，通气量控制在1.5VVm，培养24h，得到产朊假 丝酵母菌种子罐培养液，培养结束时测得活菌数为5.33×108CFU/mL，杂菌 污染率为0.36％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释12倍，pH6.0，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至28℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m3,装料量为3m3，在无菌条件下， 取经步骤3)制备的产朊假丝酵母菌种子罐培养液全部接入发酵罐中，经计 算，接种量为发酵罐装料量的5％，发酵温度控制在28℃，pH控制在6.0。 发酵温度控制在28℃，pH控制在6.0，搅拌转速控制在200r/min，通气量 控制在1.5VVm，培养24h。
发酵液指标：pH6.04；产朊假丝酵母菌含菌量7.93×108CFU/mL；重金 属0.4mg/Kg；霉菌数6CFU/mL；大肠杆菌7CFU/100mL；沙门氏菌无检出。
制备实施例四：
【原料】
同制备实施例三。
【菌种来源】
枯草芽孢杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种 保藏管理中心，编号CICC20872)。
【发酵液制备】
1)枯草芽孢杆菌菌种活化
斜面培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl0.5％，琼脂1.5％， pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌接种到斜面中， 29℃条件下活化24h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)枯草芽孢杆菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl0.5％， MnSO4·H2O5ppm，pH7.2，121℃，0.103MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤1)活化的枯草芽 孢杆菌斜面菌种，接入装量为50mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于 150r/min中摇床中，29℃恒温培养30h，得到枯草芽孢杆菌三角瓶种子液。
3)枯草芽孢杆菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释12倍，pH7.2，121℃， 0.103MPaMPa，灭菌1h，降温至29℃，备用。
种子罐培养方法：种子罐体积250L，种子罐的装料量控制在种子罐公 称容积的60％，即种子罐的装料量为150L，在无菌条件下，取取经步骤2) 制备的枯草芽孢杆菌三角瓶种子液(30个三角瓶的种子液共1.5L)接入种 子罐中,即接种量为种子罐实际装料量的1％，发酵温度控制在29℃，pH控 制在7.2，搅拌转速控制在150r/min，通气量控制在1.5VVm，培养30h，得 到枯草芽孢杆菌种子罐培养液，培养结束时测得芽孢形成率为93.2％，含菌 量为11.71×108CFU/mL，杂菌污染率为0.2％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释12倍，pH7.2，121℃， 0.103MPaMPa，灭菌1h，降温至29℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m3,装料量为3m3，在无菌条件下， 取经步骤3)制备的地衣芽胞杆菌种子罐培养液全部接入发酵罐中，经计算， 接种量控制在发酵罐实际装料量的5％，发酵温度控制在29℃，pH控制在7.2， 搅拌转速控制在150r/min，通气量控制在1.5VVm，培养30h。
发酵液指标：测得芽孢形成率为92.8％，枯草芽孢杆菌含菌量12.77× 108CFU/mL；重金属0.20mg/Kg；霉菌数10CFU/mL；大肠杆菌6CFU/100mL； 沙门氏菌无检出。
制备实施例五：
【原料】
2015年5月，以取自山东金城生物药业有限公司的谷胱甘肽废液(即 微生物发酵法生产谷胱甘肽时的发酵液离心后的残液)为原料。经山东省农 业科学院农业资源与环境研究所检测，其成分组成：氮1.49g/100mL；磷 0.102g/100mL；钾3.0g/100mL；有机质40.51g/100mL；可溶性固形物含量 38.56g/100mL，含糖量18.18g/100mL，pH5.12；水分55.04％。
经农业部都市农业(北方)重点实验室日历L-8900高速氨基酸自动分析 仪检测，其18种氨基酸和粗蛋白含量分析见表3：
表3谷胱甘肽废液中的18种氨基酸和粗蛋白含量分析
【菌种来源】
德氏乳杆菌保加利亚亚种(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业 微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6100)。
【发酵液制备】
1)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌菌种活化
斜面培养基制备：酪蛋白胨(胰酶消化)10g，肉汤提取物10g，酵母粉 5g，葡萄糖20g，吐温801g，K2HPO42g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g， MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，琼脂15g，pH6.3，121℃，0.103MPa， 灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的德氏乳杆菌保加利亚亚种接 种到斜面中，30℃条件下活化28h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)德氏乳杆菌保加利亚亚种三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：酪蛋白胨(胰酶消化)10g，肉汤提取物10g， 酵母粉5g，葡萄糖20g，吐温801g，K2HPO42g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g， MgSO4·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，pH6.3，121℃，0.103MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤1)活化的德氏乳 杆菌保加利亚亚种斜面菌种，接入装量为50mL液体培养基的250mL三角瓶 中，置于150r/min中摇床中，30℃恒温培养28h，得到德氏乳杆菌保加利 亚亚种三角瓶种子液。
3)德氏乳杆菌保加利亚亚种种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释15倍，pH6.3，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至30℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐的体积为250L，种子罐的装料量控制在种子 罐公称容积的60％，即种子罐的装料量为150L，取经步骤2)制备的德氏乳 杆菌保加利亚亚种三角瓶种子液(45个三角瓶的种子液共2.25L)接入种子 罐中，经计算，接种量控制在种子罐实际装料量的1.5％，发酵温度控制在 30℃，pH控制在6.3，搅拌转速控制在150r/min，不通气，培养28h，得到 德氏乳杆菌保加利亚亚种种子罐培养液，培养结束时测得活菌数为18.44× 108CFU/mL，杂菌污染率为0.5％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释15倍，pH6.3，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至30℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为7.5m3,装料量为4.5m3，在无菌条件 下，取经步骤3)制备的德氏乳杆菌保加利亚亚种培养液全部接入发酵罐中， 经计算，接种量控制在发酵罐实际装料量的3％，发酵温度控制在30℃，pH 控制在6.3，搅拌转速控制在150r/min，不通气，培养28h，得到发酵液。
发酵液指标：pH6.22；德氏乳杆菌保加利亚亚种含菌量22.31× 108CFU/mL；重金属2mg/Kg；霉菌数10CFU/mL；大肠杆菌5CFU/100mL；沙门 氏菌无检出；外观、气味具有酸香味的深棕色液体。
制备实施例六：
【原料】
同制备实施例五。
【菌种来源】
苏云金芽孢杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌 种保藏管理中心，编号CICC21298。
【发酵液制备】
1)苏云金芽孢杆菌菌种活化
斜面培养基制备：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO40.2g， K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，FeCl3微量，Na2MoO4·2H2O 微量，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.2，121℃，0.103MPa，灭菌30min， 无菌条件下制备斜面试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的苏云金芽孢杆菌菌种接种到 斜面中，36℃条件下活化32h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)苏云金芽孢杆菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO40.2g， K2HPO40.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O0.1g，FeCl3微量，Na2MoO4·2H2O 微量，蒸馏水1.0L，pH7.2，121℃，0.103MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取1～2环经步骤1)活化的地 衣芽胞杆菌斜面菌种，接入装量为100mL液体培养基的500mL三角瓶中，置 于170r/min中摇床中，控制pH7.2，36℃恒温培养32h，得到苏云金芽孢杆 菌三角瓶种子液。
3)苏云金芽孢杆菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH控制在7.2， 121℃，0.103MPa，灭菌1h，降温至30℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐的体积为250L，种子罐的装料量控制在种子 罐公称容积的60％，即种子罐的装料量为150L，在无菌条件下，取经步骤2) 制备的苏云金芽孢杆菌三角瓶种子液(30个三角瓶的种子液共3L)接入种 子罐中，即接入的种子液体积为种子罐装料量体积的2％，发酵温度控制在 36℃，发酵过程中pH控制在7.2，搅拌转速控制在150r/min，通气量控制 在1.5VVm，培养24h，得到苏云金芽孢杆菌种子罐培养液，培养结束时，测 得芽孢形成率为80％，活菌数为9.42×108CFU/mL，杂菌污染率为0.43％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH7.2，121℃， 0.103MPa，灭菌0.5h，降温至36℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为3m3,发酵罐实际装料量为1.8m3，在 无菌条件下，取经步骤3)制备的苏云金芽孢杆菌种子罐培养液全部接入发 酵罐中，经计算，即接入的种子液体积为发酵罐装料量体积的8.5％，发酵 温度控制在36℃，发酵过程中pH控制在7.2，搅拌转速控制在150r/min， 通气量控制在1.5VVm，保持发酵32h，得到发酵液。
发酵液指标：pH7.18；苏云金芽孢杆菌含菌量11.27×108CFU/mL；芽孢 含量76.3％，重金属3mg/Kg；霉菌数6CFU/mL；大肠杆菌5CFU/100mL；沙门 氏菌无检出。
制备实施例七：
【原料】
同制备实施例五。
【菌种来源】
解淀粉芽孢杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国农业微生物菌 种保藏管理中心，编号ACCC19745。
【发酵液制备】
1)解淀粉芽孢杆菌菌种活化
斜面培养基制备：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g， 蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面 试管。
活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的解淀粉芽孢杆菌菌种接种到 斜面中，36℃条件下活化32h，得到斜面菌种或菌种斜面。
2)解淀粉芽孢杆菌三角瓶种子液制备
三角瓶液体培养基制备：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，琼 脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min。
三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取1～2环经步骤1)活化的地 衣芽胞杆菌斜面菌种，接入装量为60mL液体培养基的250mL三角瓶中，置 于155r/min中摇床中，控制pH7.0，36℃恒温培养32h，得到解淀粉芽孢杆 菌三角瓶种子液。
3)解淀粉芽孢杆菌种子罐培养
种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH控制在7.0， 121℃，0.103MPa，灭菌1h，降温至36℃，备用。
种子罐培养过程：种子罐的体积为300L，种子罐的装料量控制在种子 罐公称容积的60％，即种子罐的装料量为180L，在无菌条件下，取经步骤2) 制备的解淀粉芽孢杆菌三角瓶种子液(30个三角瓶的种子液共1.8L接入种 子罐中，即接种量体积为种子罐装料量体积的1％，发酵温度控制在36℃， 发酵过程中pH控制在7.0，搅拌转速控制在155r/min，通气量控制在 1.5VVm，培养32h，得到解淀粉芽孢杆菌种子罐培养液，培养结束时，测得 芽孢形成率为80％，活菌数为8.36×108CFU/mL，杂菌污染率为0.54％。
4)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH7.0，121℃， 0.103MPa，灭菌0.5h，降温至36℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m3,发酵罐实际装料量为3m3，在无 菌条件下，取经步骤3)制备的解淀粉芽孢杆菌种子罐培养液全部接入发酵 罐中，经计算，接种量为发酵罐装料量体积的6％，发酵温度控制在36℃， 发酵过程中pH控制在7.0，搅拌转速控制在155r/min，通气量控制在 1.5VVm，保持发酵32h，得到发酵液。
发酵液指标：pH7.04；解淀粉芽孢杆菌含菌量10.02×108CFU/mL；芽孢 含量81.2％，重金属4.3mg/Kg；霉菌数9CFU/mL；大肠杆菌8CFU/100mL；沙 门氏菌无检出。
制备实施例八(复合型液体微生物菌肥的制备)
1)发酵液的混合
将实施例一、实施例七步骤4)制备的地衣芽孢杆菌发酵液、解淀粉芽 孢杆菌发酵液进行1:1等体积混合；
2)复合型微生物菌肥的制备
将1)混合后的发酵液打入储存罐，加入纯水，稀释10倍，经过滤后， 最后通过全自动灌装生产线(洗灌装机120桶/min，5L/桶，10桶/箱)，历 时1小时45分钟，获得液体型桶装功能微生物产品1250箱，产品活菌数浓 度为2.3×108CFU/mL，保质期为1年，6个月时检验菌种存活率为85.79％， 1年时检验菌种存活率81.34％。
制备实施例九(复合型液体微生物饲料添加剂的制备)：
1)发酵罐发酵
发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH6.2，121℃， 0.103MPa，灭菌1h，降温至30℃，备用。
发酵罐培养方法：发酵罐的体积为15m3,装料量为9000L，即装料量的 体积占发酵罐体积的60％，在无菌条件下，取制备实施例二、三、四步骤3) 制备的嗜酸乳杆菌种子罐培养液150L、产朊假丝酵母菌种子罐培养液150L、 枯草芽孢杆菌种子罐培养液150L、共计450L接入发酵罐中，即三个种子罐 培养液的总体积占发酵罐装料量体积的5％，发酵温度控制在30℃，pH控制 在6.2。在发酵开始时，同时关闭搅拌和所有阀门，24h后打开放气阀，调 节放气阀的开关幅度控制发酵罐罐压0.025MPa，以后每4小时同时开启搅 拌和通气，搅拌和通气时间为30min，放气阀一直为打开状态，通过调节放 气阀的开关幅度，将发酵罐罐压保持在0.025MPa，通气量控制在1.5VVm， 搅拌转速控制在200r/min，保持发酵36h，得到发酵液。发酵液指标：pH5.72； 嗜酸乳杆菌含菌量26.01×108CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量8.07× 108CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量12.84×108CFU/mL；总活菌数46.92× 108CFU/mL；重金属0.5mg/Kg；霉菌数8CFU/mL；大肠杆菌4CFU/100mL；沙 门氏菌无检出；外观、气味具有酸香味的深棕色液体；
2)经1)发酵好的复合菌液打入储存罐中，用纯水稀释20倍，得到18.9 吨稀释后的菌液，通过调配混匀、过滤后经全自动灌装生产线(洗灌装机 150瓶/min，2L/瓶，12瓶/箱)，获得液体型瓶装功能微生物产品总活菌数 为2.4×108CFU/mL，保质期为1年，6个月时检验菌种存活率为86.14％，1 年时检验菌种存活率82.67％。
制备实施例十(复合型粉剂微生物饲料添加剂的制备)：
1)卧式双轴桨叶混合机型号SSHJ-4，全体积4m3，每批混合量为2吨， 其中装填的麸皮(含水量8.5％)1.7吨，发酵液0.3吨(制备实施例九步骤 一所得)，混合时间60s，从混合机出来的物料水分为22％，枯草芽孢杆菌含 菌量2.69×108CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量2.88×108CFU/mL；嗜酸乳杆 菌含菌量4.61×108CFU/mL；总活菌数10.18×108CFU/mL；
2)将从混合机出来的物料装入托盘中，每个托盘所装的物料深度为 4cm，将托盘送至烘干室立体架上，烘干室12m×12m×3m，每1h翻动物料 一次，烘干室温度控制在37℃，烘干时间20h，获得1.7吨干燥后的固体功 能微生物产品，外观为酸香味的粉剂产品，水分为8.5％，枯草芽孢杆菌含 菌量2.17×108CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量2.38×108CFU/mL；嗜酸乳杆 菌含菌量4.31×108CFU/mL；总活菌数8.86×108CFU/mL；相比烘干前，总活 菌数降低12.97％，重金属0.3mg/Kg；霉菌6CFU/mL；大肠杆菌4CFU/100mL； 沙门氏菌无检出。经全自动定量包装机生产线，200袋/分钟，2Kg/袋，12 袋/箱，保质期为1年，6个月时检验菌种存活率为92.58％，1年时检验菌 种存活率86.23％。
实验例一；
以制备实施例八所得复合型液体微生物菌肥与市售购买的其他公司生 产的进行对比试验。
试验地点：设在济南市农业高新技术产业示范园生菜大棚
试验时间：2014年10月08日至12月25日和2015年3月7日至5月 18日。2014年10月08日和2015年3月7日分别进行播种育苗；2014年 11月2日和2015年3月31日分别进行定植，定植密度为行、株20～25厘 米；2014年12月23日和2015年5月21日分别进行采收。
供试生菜品种：美国大速生。
供试菌肥:本发明实施例八所得的复合型液体微生物菌肥(菌种组合为 解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，经检测活菌总数为2.3×108CUF/mL)；华 雨液体微生物菌肥(菌种组合为解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，经检测活 菌总数为2.27×108CUF/mL),来自沧州华雨生物科技有限公司。
试验设计：
本发明实施例八所得的复合型液体微生物菌肥、华雨液体微生物菌肥2 种供试菌肥分别用A、B来表示,每种菌肥设置3个处理浓度,分别为1:100、 1:200、1:500(菌肥剂量与水量之比),以清水作为对照(CK),共计7个处理, 各处理设置详见表4。每个处理小区面积30m2,随机区组排列,3次重复。育 苗前种子分别用各处理菌肥浓度浸种1.5h,在生菜定植缓苗后开始叶面喷 施微生物菌肥进行处理,每隔1星期喷施一次,喷施时间均为下午3点,共喷 施5次。喷施菌肥采用喷雾器喷施法,每小区配用15公斤待用浓度的菌肥, 然后均匀喷施至生菜叶片。
表4各处理名称
测定项目及方法：
1)生菜形态指标和产量的测定
生菜地上部生长指标的测定：播种后3d开始记录不同微生物菌肥处理 的生菜的出苗率；定植后45天随机取30株生菜，用蒸馏水冲洗干净，吸去 表面水分，测定其地上部生长指标，包括株高、叶面积、地上部鲜重、地上 部干重、亩产量。株高为根莲处至时片生长最高点距离；地上部和地下部分 别在105℃下杀青，75℃烘至恒重，测量干质量。
2)生菜品质指标的测定
采收期，每处理随机取30株生菜,将烂叶黄叶去除，将其他叶片剪碎混 合，测定可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、游离氨基酸的含量。可溶性糖 含量的测定釆用蒽酮比色法；可溶性蛋白质的测定采用考马斯亮蓝G-250 染色法；维生素C采用分光光度计法测定；游离氨基酸采用茚三酮溶液显 色法测定。
试验结果：
1)在播种后的第10天，两种菌肥各浓度的出苗率均达到了85％以上, 表明微生物菌肥处理后的土壤透气性和保水性均有利于生菜种子的出苗，可 有效缩短育苗时间；A2(以实施例八所得的复合型液体微生物菌肥1:200 清水稀释)的孔隙度最大，透气性最好，所以对育苗影响最大，其出苗率最 高达98.53％，与清水对照组相比提高了4.5％；B2(华雨液体微生物菌肥1:200 清水稀释)的总孔隙率次之，相应的出苗率低于A2(以实施例八所得的复 合型液体微生物菌肥1:200清水稀释)，但也比清水对照组提高了0.58％。
两种微生物菌肥不同浓度处理对生菜生长的影响有一定的差异，与清水 对照组相比，处理A2、B2均能显著增加温室生菜的株高、叶面积、地上部 鲜重、地上部干重、亩产量，且促进效果表现为A2＞B2，其中A2(以实施 例八所得的复合型液体微生物菌肥1:200的浓度)处理效果最好，分别使株 高、地上部鲜重、地上部干重、亩产量、叶面积比清水对照组增加了27.21％、 22.53％、61.49％、23.70％、15.88％，B2(华雨液体微生物菌肥1:200清水稀 释)处理效果次之，分别使株高、地上部鲜重、地上部干重、亩产量、叶面 积比清水对照组增加了23.0％、19.87％、52.06％、20.44％、13.19％，其他浓 度的处理结果与清水对照组相比差异不显著。
实验例二：
以制备实施例十得到的复合型微生物粉剂饲料添加剂进行对比实验。
试验方法：试验选用产期、胎次、品种相同、肤色相近的50日龄杜长大 三元杂交断奶仔猪75头，试验时间125天，随机分为三组，每组25头，平均 分为三圈饲养，每组的仔猪体重无明显差异(P＞0.05)。三组仔猪饲养于同 一幢猪舍内，环境条件相同，预饲期两周，预饲期内完成去势、驱虫、防疫 注射；试验设对照、添加制备实施例十得到的复合型微生物粉剂饲料添加剂 处理组、添加华牧微生物饲料添加剂粉剂产品(购自哈尔滨禾牧科技有限公 司)三个处理，对照组：全价料；试验组：全价料+0.3％华牧微生物饲料添 加剂粉剂产品；
自由采食，计量不限量，自动饮水器饮水。
指标统计：准确记录日增重、料重比、蛋白消化率、有机物消化率、腹 泻发生率、腹泻复发率，对试验数据行比较。
应用效果：全价料+0.3％制备实施例十得到的复合型微生物粉剂饲料添 加剂效果最好，全价料+0.3％华牧微生物饲料添加剂粉剂产品次之，其中制 备实施例十得到的复合型微生物粉剂饲料添加剂日增重比对照组提高 8.25％，料重比试验组比对照组降低5.32％；腹泻发生率明显低于对照组，低 23.1％，而且腹泻发生率0％，而对照组复发率为23％。差异均极显著P＜(0.01)； 蛋白消化率比对照组提高7％，有机物消化率比对照组提高6.32％。
本发明实施例十得到的复合型微生物粉剂饲料添加剂无毒、无副作用、 无污染、安全可靠，添加到肥育猪日粮中。一方面，该添加剂能有效提高饲 料的利用率，可以增加日增重，这除了固体型功能微生物产品本身含有大量 的活菌，被动物摄取利用，起到使饲料中部分不易吸收利用的物质得以降解 外，还与固体型功能微生物产品中的部分活性营养物质有关；另一方面，该 添加剂有明显的增强畜禽机体对疫病的抵抗力的作用，特别是肠道细菌性疾 病，这可能由于固体型功能微生物产品中有益菌与肠道内的有益菌一起并形 成了优势菌群，大量繁殖，通过竞争性抑制使有害菌的繁殖受到抑制，阻止 了细菌性疫病的发生，从而达到增强抗病力的作用。