技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种牙髓干细胞的培养方法，尤其是涉及一种乳牙牙髓干细胞的培养方法。
背景技术
2003年Miura等在脱落乳牙的牙髓组织中发现了一种多潜能干细胞，与骨髓间充质干细胞和恒牙牙髓干细胞相比，其具有更高的增殖率、细胞群倍增能力、克隆形成能力及高度分化能力，将其命名为乳牙牙髓干细胞(stemcellsfromdeciduousteeth，SHED)。人乳牙牙髓干细胞是间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)的一种，具有自我复制能力和多向分化潜能的间充质干细胞，可以诱导分化成为牙本质、成骨细胞、软骨细胞、成脂细胞、神经细胞、肝细胞、肌细胞等。
人类有20颗乳牙，在乳恒牙交替期会逐渐自然脱落，因此牙髓组织来源非常易得，且无创伤。牙髓组织源于自体组织，无免疫排斥反应，具有较高的安全性。鉴于以上所述生物学特性，牙髓干细胞在治疗骨和牙组织再生修复、神经系统疾病及肌肉萎缩、免疫系统疾病、皮肤外伤、肝脏疾病等方面有广阔的应用前景。
申请号为201210514497.X的中国专利公开了一种牙髓干细胞的规模化生产工艺。文中有如下表述：步骤(1)中，牙髓组织是在无菌条件下挑选的，用缓冲液冲洗后剪碎；牙髓组织的消化采用5-10倍体积的0.1％-0.6％胶原酶，于37℃培养箱中振荡培养30-180min后用含胎牛血清的细胞培养液终止消化，所述细胞培养液选自商品化的含10-20％胎牛血清的D-MEM、DMEM培养基及无血清培养基。然而该方法酶解时间过长，组织消化过度,牙髓干细胞细胞获取数量少。而且该方法采取含胎牛血清的DMEM培养，胎牛血清具有污染源性，批次间稳定性差，不利于细胞用于动物模型中。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，本发明所述培养方法培养的细胞形态良好，呈现梭形、簇团性生长趋势，细胞活性高，简单经济，可获得大量高纯度乳牙牙髓干细胞，且能保持乳牙牙髓干细胞良好的干细胞特性。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种乳牙牙髓干细胞的培养方法，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10-20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，加入细胞悬液重悬细胞并调整细胞密度，于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养，当细胞生长至80％-90％融合时，用含胰蛋白酶的消化液消化细胞后传代培养；其中所述细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子组成。
本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法采用I型胶原酶在37℃酶解消化牙髓组织10-20min可获得较多细胞数量。同时本发明所述培养方法全程采取无血清培养培养及传代，避免采用胎牛血清的DMEM培养基培养。
在一些实施方案中，本发明所述培养方法所述I型胶原酶的加入量为牙髓组织的10-20倍体积。
在一些优选实施方案中，本发明所述培养方法中所述I型胶原酶的浓度为0.3％～0.5％。即3g/L～5g/L。
本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法，所述乳牙可以取自家属同意的儿童因滞留而拔除的没有牙体牙髓病变及坏死的乳切牙，拔除后立即放于4℃遇冷的装有含有双抗的PBS离心管中保存，24小时内取出使用。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为100U/mL，链霉素工作浓度为0.1mg/mL。
本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法所述牙齿预先用含双抗的PBS溶液反复冲洗三次，将牙齿包在无菌纱布中用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织。
本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法中所述牙髓组织根据牙髓组织大小，用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm3。
在一些实施方案中，所述培养方法还包括对单个离散细胞进行清洗的步骤。
在一些优选实施方案中，所述培养方法所述清洗具体为离心后用PBS清洗沉淀，离心收集沉淀。在一些具体实施例中，所述离心为1000rpm-2000rpm离心3-5min。
在一些实施方案中，所述培养方法所述单个离散的细胞的直径≤70μm。在一些实施例中，所述获得单个离散细胞的方法具体为吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤。
在一些实施方案中，所述培养方法所述细胞密度为2×103/cm2-5×103/cm2。以2×103/cm2-5×103/cm2的细胞密度接种，细胞在P1代比原代细胞数目可以扩增20倍。
在一些实施方案中，所述培养方法所述细胞悬液中所述表皮生长因子的终浓度为10ng/mL。
在一些实施方案中，所述培养方法所述细胞悬液中所述碱性成纤维生长因子的终浓度为10ng/mL。
在一些实施方案中，所述培养方法所述培养过程中每隔三天换一次细胞悬液。
在一些实施方案中，所述培养方法所述胰蛋白酶的浓度为0.125％。
在一个具体实施例中，以申请号为201210514497.X公开的方法培养的细胞作为对比例，观察实施例1的方法培养7天的细胞，细胞活性高，细胞活力达到90％以上；细胞增殖快，收获细胞数量大，原代分离7-8天即可长至80-90％；仅需要传代一次在3-5天内便可使细胞数目扩增20倍以上。
在一个具体实施例中，观察细胞表面标记物表达情况。结果显示本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法培养的乳牙牙髓干细胞第1代、第6代、第10代的细胞的表面标记物没有明显改变。乳牙牙髓干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时间充质干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代以后的乳牙牙髓干细胞，细胞形态均一，纯度在98％以上。
在一个具体实施例中，观察P3代细胞诱导成脂分化情况。结果显示，本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法培养的乳牙牙髓干细胞细胞经过诱导后，进行油红O染色，可见明显的脂滴形成。
在一个具体实施例中，观察P3代细胞诱导成骨分化情况。结果显示，与对照组相比，本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法培养的乳牙牙髓干细胞细胞有明显的钙结节。表明成骨细胞形成。
本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法，取牙髓组织，剪碎后加入I型胶原酶，37℃，200rpm消化10-20min，无血清培养基终止消化，吹打离散细胞团块获得单个离散的细胞，加入细胞悬液重悬细胞并调整细胞密度，于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养，当细胞生长至80％-90％融合时，用含胰蛋白酶的消化液消化细胞后传代培养；其中所述细胞悬液由无血清培养基、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子组成。本发明所述培养方法操作简单、安全有效。实验表明，与现有方法相比，本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法培养细胞形态良好，呈现梭形，簇团性生长趋势；细胞活性高，细胞经细胞计数仪鉴定，细胞活力达到90％以上；细胞增殖快，收获细胞数量大，原代分离7-8天即可长至80-90％；仅需要传代一次在3-5天内便可使细胞数目扩增20倍以上；且能很好保持乳牙牙髓干细胞的形态和良好的干细胞特性，适用于乳牙牙髓干细胞的大量培养。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例2细胞活力检测图；
图2示实施例3培养的细胞状态图，其中图a为申请号为201210514497.X公开的方法培养7天的细胞图，图b为实施例1所述方法培养7天的细胞图，放大倍数均为40倍；
图3示实施例4细胞扩大培养细胞总数统计图；
图4示实施例5第1代细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为第1代对照细胞组，图d-f为实施例1所述方法培养的第1代实验细胞组；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为HLA-DR及CD59表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图；
图5示实施例5第6代细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为第6代对照细胞组，图d-f为实施例1所述方法培养的第6代实验细胞组；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为HLA-DR及CD59表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图；
图6示实施例5第10代细胞表面标志物的表达结果图，其中图a-c为第10代对照细胞组，图d-f为实施例1所述方法培养的第10代实验细胞组；图a为FSC及SSC表达情况图，图b为HLA-DR及CD59表达情况图，图c为CD45及CD90表达情况图，图d为FSC及SSC表达情况图，图e为HLA-DR及CD59表达情况图，图f为CD45及CD90表达情况图；
图7示实施例6P3代细胞诱导成脂分化结果图，其中图a为申请号为201210514497.X公开的方法培养28天的对照组细胞油红O染色后脂滴形成情况图，图b和图c为实施例1所述方法培养28天的实验组细胞油红O染色后脂滴形成情况图；放大倍数均为40倍；
图8示实施例7P3代细胞诱导成骨分化结果图，其中图a为申请号为201210514497.X公开的方法培养21天的对照组细胞VonKossa染色图，图b为实施例1所述方法培养21天的实验组细胞VonKossa染色图；放大倍数均为40倍。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、人乳牙牙髓干细胞的培养
(1)经家属同意后，收集临床上儿童因滞留而拔除的乳切牙，要求没有牙体牙髓病变及坏死。拔除后立即放于4℃遇冷的装有含有双抗的PBS离心管中，24小时内取出使用。
(2)取出牙齿，利用含双抗的PBS溶液反复冲洗三次，将牙齿包在无菌纱布中用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织。根据牙髓组织大小，用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm3，置于50mL离心管中。
(3)加入10倍体积的5g/LI型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37℃、200R消化10-20min左右。
(4)加入等体积的无血清培养基终止消化，反复吹打离散细胞团块，通过70μm的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000rpm-2000rpm离心3-5min。
(5)丢弃上清，用30mLPBS清洗沉淀1次，1000rpm-2000rpm离心3-5min。
(6)沉淀用无血清培养基重悬，取20μL细胞悬液，按照细胞悬液(V)：0.4％台盼蓝(V)＝3:1比例混合，在细胞自动计数仪中计算细胞活力。
(7)以0.5×104/cm2～1×104/cm2接种至六孔板中，每孔加入2mL无血清培养基，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度均为10ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。
(8)每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能观察到克隆的形成，当细胞生长至80％-90％汇合时，0.125％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。
实施例2、细胞活力检测
以申请号为201210514497.X公开的方法培养的细胞作为对比例(对照组)，按照实施例1的方法(样品组)分离细胞，收集分离细胞在细胞自动计数仪中计算细胞活力。结果如图1。
由图1结果可见本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法得到的牙髓干细胞的活力可达到90％以上。
实施例3、细胞形态观察
以申请号为201210514497.X公开的方法培养的细胞作为对比例(对照组)，观察实施例1的方法(样品组)培养7天的细胞的细胞形态，结果见图2。
结果显示，本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法培养的细胞在原代培养7天后，细胞汇合度可以达到80％以上，而对比例中细胞汇合度在50％左右，明显低于本发明的培养方法。
实施例4、细胞扩大培养
以申请号为201210514497.X公开的方法培养的细胞作为对比例(对照组)，按照实施例1的方法培养细胞，当细胞生长至80％-90％汇合时，0.125％胰蛋白酶消化细胞，1000rpm-2000rpm离心3-5min，收集细胞沉淀，用Lonza完全培养基重悬细胞，并取20μL细胞悬液进行细胞计数，计得原代细胞总量，并调整细胞密度为2×103/cm2-5×103/cm2，接种于6孔板细胞培养皿中。用20mlLonza完全培养基培养，再加入表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为10ng/mL)，混匀细胞悬液，放于37℃、湿度为95％的二氧化碳培养箱中培养。当P1代细胞生长至80％-90％汇合时，按照上述相同的步骤收集细胞，并对P1代细胞进行计数。结果如图3。
由图3结果可见，1×105原代细胞传代，本发明所述乳牙牙髓干细胞的培养方法(样本组)培养的细胞扩增了近20倍，而对照组中，细胞总数只扩增了6倍左右。
实施例5、细胞表面标记物检测
分别取实施例1的方法培养的第1、6、10代细胞，用流式细胞仪检测不同代数之间的细胞表面标志。消化收集细胞，计数后每管加入2×105细胞数，染色缓冲液洗1次，1000rpm离心5min；弃上清，用染色缓冲液吹打混匀细胞；加入CD45、CD59、CD90及HLA-DRA抗体各2μL，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应15-20min；染色缓冲液洗一次，1000rpm离心5min；直接标记的细胞弃上清，避光加入500μL的上样缓冲液，混匀，用200目筛网过滤细胞样品，流式细胞仪检测细胞表面抗原，结果见图4、图5和图6。
由图4-6结果可见，流式细胞仪检测细胞的表面标志，观察到第1代、第6代、第10代的细胞的表面标记物没有明显改变。乳牙牙髓干细胞表面标志CD45(白细胞阳性)、HLA-DR(MHC-II类分子)为均呈现阴性，同时乳牙牙髓干细胞表面标记物CD59、CD90均呈现阳性。第三代以后的乳牙牙髓干细胞细胞形态均一，纯度在98％以上。
实施例6、P3代细胞诱导成脂分化鉴定
方法为：细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养。成脂诱导培养基包括基础培养基DMEM、10％胎牛血清、0.5mMIBMX、1μM地塞米松、100μM吲哚美辛、5μg/ml胰岛素、2mm/L谷氨酰胺等。每三天换液。四周后进行油红O染色，鉴定脂滴形成情况，结果见图7。
图7结果显示，培养四周后，镜下观察可知对照组未经诱导，没有出现脂滴，而实验组，即实施例1所述培养方法培养的细胞经过诱导后，进行油红O染色，可见明显的脂滴形成。
实施例7、P3代细胞诱导成骨分化鉴定
方法为：细胞培养至第2代时，按照1×103细胞/cm2接种于六孔板中，加入完全培养基，24h后，加入成脂诱导培养基进行培养24h后，加入成骨诱导培养基进行诱导培养，每隔2-3天换液，21天后进行VonKossa染色，结果见图8。
图8结果显示，与对照组相比，诱导组有明显的钙结节，这是成骨细胞形成的特征。