丝样材料前体、丝样材料及它们的制备方法 【技术领域】
本发明涉及丝样材料前体、由该前体制造的丝样材料，以及它们的制备方法。背景技术
家蚕(Bombyx mori)于室温下在极短的时间内从纤维化前的液态丝生成高强度和高弹性的丝线。众所周知，这种丝线作为高级织物享有盛誉。另外，因为丝线可由微生物分解，所以不引起环境污染。尽管丝的一级结构和丝线的二级结构(以下称为Silk II型结构)已经确定，但前述液态丝的结构(以下称为Silk I型结构)以及基于其的纤维化的构造尚不清楚，而且，还不能得到高强度的合成丝样纤维。
举例来说，周等人已经报道了家蚕丝的一级结构(周等，NucleicAcids Research，28，2413-2419(2000))。根据这篇报道，在家蚕丝结构的重复结构域中，(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser)n区域和Gly和Ala的连锁中，Tyr和/或Val出现的区域交替出现。进而，这种有序的重复区域和约30个残基的无序区域重复。
另外，通过风干液态丝得到的丝膜地结构，即Silk I型结构由X射线衍射在原子水平研究，还进行了各种模型共聚物的合成和结构解析，但是，还不能正确地将其表征。Silk I型结构的代表性模型包括已为人们熟知的Lotz等提出的“Crankshaft模型”和Fossey等提出的“Out-of-Register模型”。前者基于X射线数据分析、电子束分析和构象能计算的结果；后者基于详细的构象能计算的结果。
但是，这两种结构模型不能解释所有的X射线数据。此外，在这两种模型中，因为形成的全部是分子间氢键，所以从Silk I型结构到Silk II型结构转变中，需要分子间氢键断裂，以及进一步形成氢键。这意味着这两种模型不能确切说明蚕从液态丝生成丝线的机理。
如上述，以往，由于没有明确正确的Silk I型结构，没有搞清蚕从液态丝生成丝线的正确的机理，因此不能合成丝线。本发明的发明人通过使用基于固体核磁共振的新的分析方法对Silk I型结构进行集中研究，结果成功地正确确定了Silk I型结构，并且基于该发现完成了本发明。
因此，本发明的第一个目的是提供含有液态丝的丝样材料前体。
本发明的第二个目的是提供上述丝样材料前体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供能从上述丝样材料前体合成的丝样材料。
本发明的第四个目的是提供含有丝的丝样材料的制备方法。发明内容
本发明提供丝样材料前体和该前体的制备方法，以及对该前体纺丝得到的丝样材料和该丝样材料的制备方法，所述丝样材料前体的特征在于其是由通式-[(GA1)j-((GA2)k-G-Y-(GA3)l)m]n-表示的共聚物，其中(GA1)j部分具有重复的β-转角II型结构，其沿分子轴顺序形成分子内氢键。附图说明
图1是说明本发明的丝样材料前体的Silk I型结构的图。虚线代表氢键。
图2(a)～(c)说明图1所示的Silk I型固体结构的丝样材料前体形成的分子间结构。另外，图2(b)中的虚线代表分子内氢键，而图2(a)和图2(c)中的虚线代表分子间氢键。具体实施方式
本发明的丝样材料前体(以下简称为前体)的通式-[(GA1)j-((GA2)k-G-Y-(GA3)l)m]n-的高分子末端没有特别地限定。上式中的G是甘氨酸，Y是具有不对称碳原子的氨基酸，其能够赋予前体以水溶性。其具体的实例是L-谷氨酸、L-赖氨酸，特别是L-酪氨酸。另外，“L-”代表左旋光学异构体。A1是丙氨酸，但也可以用丝氨酸代替每个第三丙氨酸。A2和A3是丙氨酸，但它们的一部分可以用缬氨酸替代。
尽管式-[(GA1)j-((GA2)k-G-Y-(GA3)l)m]n-以嵌段共聚的形式表示，但本发明的前体并不限制于嵌段共聚。j是大于等于6的整数，k和l是0～5的整数，m是1～7的整数，n是大于等于10的整数。
另外，上式中的Y可以包括两种或两种以上的氨基酸，但优选是L-酪氨酸一种。前体的水溶性的程度取决于Y的含量而变化，其含量优选为小于等于20％(摩尔)。另外，n是大于等于10的数，从可能纺丝的角度而言，优选共聚物的分子量大于等于30000。
本发明的“β-转角II型结构”是如图1所示的结构，其中氨基酸残基以螺旋状卷曲转角的形式重复，整体成为线状的高分子。与Silk II型结构和以前的模型不同，上述β-转角II型结构使本发明的上述通式代表的前体具有分子内氢键(图1和图2(b)的虚线部分)，而且该分子内氢键沿分子轴顺序形成。
以下详述本发明的丝样材料前体的制备方法。在本发明的前体的制备期间，首先确定与甘氨酸一起使用的其他氨基酸的种类和使用量。较好地只用一种，也可以使用多种。另外，根据所期望的水溶性的程度确定Y的用量。Y的使用量优选小于等于全部氨基酸的20％(摩尔)。当Y的量太多时，得到的前体的稳定性变差，从而使纤维化变得困难。此外，在主链中引入Y是必要的。而且，通过在由A1表示的丙氨酸序列的每个第三A1中引入丝氨酸，可以调节共聚物的硬度。
本发明的前体可以通过固相肽合成方法，或者通过用大肠杆菌(Escherichia coli)的基因工程方法来合成。特别地，通过后一方法合成高分子量的共聚物时，首先确定合成的通式，然后，化学合成编码目的序列的寡核苷酸后，用它们制备该通式的重复单元，如果需要，通过将其引入克隆载体适宜地聚合，然后转移入大肠杆菌，通过大肠杆菌表达，优选是基因工程制备方法。类似的制备方法由Prince J，T等，Biochemistry 34，10879(1995)公开。
图1显示用甘氨酸和L-丙氨酸合成的共聚物的，沿分子轴形成氢键的Silk I型结构。另外，图2显示图1所示的共聚物以固体状态形成的规则的分子间结构。图2(a)～(c)分别是其分子间结构的c轴投影图、a轴投影图和b轴投影图。但是，本发明的前体中，除了具有上述Silk I型的有序结构外，还包括无定形的前体。
在Silk I型结构的分子中，如图1和图2(b)所示，三个氨基酸残基位于一端的氨基(例如Ala(i+3))和位于另一端的羧基(例如Gly(i))的氧原子形成氢键，从而形成称为“β-转角II型结构”的环状结构。如图1所示，两个与此β-转角II型结构的分子内氢键有关的肽基分别被其它β-转角II型结构共用。Silk I型结构的分子中，分子全部形成该β-转角II型结构。在本说明书中，将该结构定义为“重复β-转角II型结构”。
另外，在固体状态，如图2(a)和2(c)所示，Silk I型结构中，沿a轴方向相邻的分子通过分子间氢键结合。如图1所示，它们的分子间氢键在与分子内氢键无关的肽基间形成。也就是说，在Silk I型固体结构中，通过碳原子，与分子内氢键有关的肽基和对分子间氢键有贡献的肽基，沿分子的分子链交替结合。
通过用稳定的同位素标记，使用REDOR法确定与分子内氢键有关的碳原子和氮原子之间的距离，确认Silk I型结构中实际的分子内氢键的形成。
上述“重复的β-转角II型结构”合理地解释了家蚕在室温下的短时间内从液态丝生成丝线的机理。
Silk I型结构的本发明的前体具有高的热稳定性，但是，如纺丝时那样在纤维轴方向上施加张力时，其快速向Silk II型结构转变。这从以下内容能够容易地理解，如图1和图2(b)所示，在Silk I型结构中，分子内氢键的键轴几乎与分子轴平行，与分子内氢键有关的肽基在相邻的分子间接近。
也就是说，Silk I型结构中，分子内氢键的键轴与分子轴几乎平行，通过将分子向其分子轴方向拉伸，该分子内氢键容易被切断，由于与该分子内氢键有关的肽基在相邻的分子间接近，在前述分子内氢键切断的同时，在垂直于分子轴的方向上形成新的分子间氢键。因此，由于上述分子内氢键的切断和新的分子间氢键的形成同时发生，在本说明书中将其记载为“分子内氢键的转变”。
在本发明中，将为了得到本发明的前体而通过大肠杆菌合成的共聚物溶解在含有LiBr的水溶液中，并通过透析将LiBr从所得溶液除去，从该水溶液中除去水，得到本发明的前体。在上述水分去除的过程中，通常从水溶液形成膜。另外，通过降低上述水溶液的浓度，可以使得到的膜状的本发明的前体是无定形的；在升高水溶液的浓度的情况下，可以得到Silk I型的。
通过拉伸上述得到的膜，或者用甲酸处理，可以得到具有Silk II型结构的膜。但是，在生产丝线的情况下，需要从前述膜形成前的水溶液中纺丝，或者通过将获得的膜状的上述前体溶解在六氟异丙醇等溶剂中进行纺丝。
纺丝条件根据前体的物理性质适当地确定。另外，通过选择纺丝头开口孔径的大小，可以从纤维状的前体生产线状的粗的丝样材料。为了生产强度大的丝样材料，需要将纺丝得到的材料拉伸。从生产成本和生产环境的角度而言，优选不用六氟异丙醇那样的溶剂。因此，优选设计能在水溶液中纺丝的前体，但是通过使用在溴化锂(LiBr)水溶液中混合醇和/或醚那样的有机溶剂的混合溶剂，采用通过透析除去LiBr的方法，也可以扩大前体的设计的容许范围。
通过构成丝样材料的共聚物成分的变化，所得的线状和膜状的本发明的丝样材料可以具有各种功能。另外，除了因为是蛋白质，可以被微生物分解之外，它还具有类似于天然丝的性质，而且是优质的具有环境适合性的纤维。
以下通过实施例说明本发明，但它们并不意图限制本发明。实施例实施例1：
进行了丝中的酪氨酸残基的结构和结构变化的比较检查。通过给予蚕幼虫50mg 13C标记的L-酪氨酸而对家蚕丝的蚕丝的L-酪氨酸残基进行13C同位素标记，然后进行固体高分辨13C NMR测定。结果证明，在液态丝和从其干燥形成的膜中，L-酪氨酸残基采取无规卷曲结构，但是在从蚕茧得到的丝纤维中，它们采用Silk II型结构。接着，对将上述膜溶解在六氟异丙醇(HFIP)中并纺丝得到的纤维和从蚕茧得到的丝线进行定向固体NMR测定，在所有情况下，均确认L-酪氨酸残基采用Silk II型结构，同时在各分子链中定向。另外，通过固体NMR证实，丝的主成分丙氨酸和甘氨酸残基在液态丝或从其干燥得到的膜中都采取Silk I型结构，但是，在丝纤维中它们采用Silk II型结构。实施例2：
使用固相肽合成仪合成下述化合物I、II、III和IV，这些化合物是家蚕丝的重复区域的代表性链部分，还测定了它们的水溶性。结果证实，I完全不溶于水，II、III和IV极易溶。通过这些试验，证实酪氨酸残基对丝的水溶性是必要的。合成的化合物：G(AG)2SG(AG)2 IG(AG)2YG(AG)2 IIGAGVGYG(AG)2 IIITGFDSESSWAYEYGSYGGNAVYPGFGSSGT IV其中，G是甘氨酸，A是丙氨酸，Y是酪氨酸，V是缬氨酸，T是苏氨酸，F是苯丙氨酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，W是色氨酸，N是天冬酰胺，P是脯氨酸，除了甘氨酸外，所有这些氨基酸都是L-型的。实施例3：
使用固相肽合成仪合成下述化合物。G(AG)2YG(AG)2 II(AG)6YG(AG)5 V(AG)7YG(AG)7 VI(AG)15 VII其中，A是L-丙氨酸，G是甘氨酸，Y是L-酪氨酸。结果是，样品II如实施例2中所述，是高度溶于水的。另外，将300mg样品V溶解在7ml 9M溴化锂水溶液中之后，通过透析除去溴化锂，通过固体高分辨13C NMR确认其结构主要是Silk I型的。
通过相同的操作，在样品VI的情况中得到同样的凝胶状物，证明其结构中Silk I型和Silk II共存。
另外，在样品VII的情况中，进行同样的操作，其在透析膜中沉淀。还发现得到的沉淀的结构为Silk I型。实施例4：
使用固相肽合成仪合成下述化合物。(AG)3YG(AG)3YG(AG)3YG(AG)3 VIII(AG)3YG(AG)2VGYG(AG)3YG(AG)3 IX(AGAGYG)5 X
将300mg化合物VIII、IX和X溶解在7ml 9M的溴化锂水溶液中，通过透析3天而除去溴化锂。在透析操作中，这些肽在透析膜内呈凝胶状形态，得到含有较多水分的目的物。它们具有与化合物VII(AG)15的处理过程明显不同的形态，该结果证实向共聚物中引入的L-酪氨酸残基有效地赋予其以亲水性质。而且，A是L-丙氨酸，G是甘氨酸，Y是L-酪氨酸。实施例5：
向1g精炼的去除了丝胶蛋白的丝心蛋白纤维中加入50ml 9MLiBr，并在40℃下溶解1.5小时。接着，将得到的溶液抽滤以除去不溶物，得到丝浓度为0.5％的9M LiBr水溶液。将这样得到的水溶液移入透析膜中，并用蒸馏水透析4天，得到浓度小于等于0.5％的丝的水溶液。接着，将得到的水溶液在2号方形培养皿上展开，并在室温下温和干燥，每个得到0.15g的无定形膜。这样得到的无定形膜在室温下(15℃～30℃)易溶于HFIP，约3.5小时即完全溶解。另外，拉伸从HFIP溶液中纺丝的纤维，得到Silk II型结构的丝。实施例6：
使用固相肽合成仪合成下下述化合物。(AG)6A[1-13C]G[1-13C]AG(AG)7 XI(AG)7[1-13C]A[1-13C]G(AG)7 XII(AG)6A[1-13C]GA[1-13C]G(AG)7 XIII(AG)6A[1-13C]GA[15N]G(AG)7 XIV(AG)7[1-13C]AG[15N]AG(AG)7 XV
将300mg每种化合物溶解在7ml 9M溴化锂水溶液中后，通过透析3天以除去溴化锂，各样品均在透析膜内沉淀。此时，通过IR光谱确认沉淀采取Silk I型结构。对化合物XI、XII和XIII的各样品进行二维固体13C NMR自旋扩散，对化合物XIV和XV的样品进行REDOR NMR测定。另外，[1-13C]G和[1-13C]A分别表示用13C标记一个碳原子的甘氨酸和丙氨酸，[15N]G和[15N]A分别表示用15N标记氮原子的甘氨酸和丙氨酸。
从样品XI的光谱及其解析确定，丙氨酸残基的扭转角(φ，)为-60°±5°和130°±5°。另外，从样品XII和XIII的光谱及其解析确定甘氨酸残基的扭转角(φ，)为70°±5°和30°±5°。
它们的扭转角的值从样品XIV和XV的REDOR测定的结果得到支持。丙氨酸和甘氨酸的交互共聚物在采取Silk I型结果的情况下，扭转角被调整到上述值时，共聚物的结构如图1所示。实施例7：
使用固相肽合成仪合成下述化合物。(AG)15 VII(AG)6A[1-13C]GAG[15N]AG(AG)6 XVI
与实施例5相同地，制备Silk I型结构样品。对样品XVI进行REDOR测定的结果确定，第14位甘氨酸残基的羰基碳和第17位丙氨酸残基的氨基氮间的距离为4.0±0.1。在用等量的样品VII稀释样品XVI得到的样品的情况下，该值相同，因此，不存在分子间的影响。另外，上述4.0±0.1的值与从图1的结构得到的相应原子间的距离一致，从而确认Silk I型结构形成了分子内氢键。实施例8：
向1g精炼的去除了丝胶蛋白的丝心蛋白纤维中加入50ml 9MLiBr，并在40℃下溶解上述丝心蛋白纤维1.5小时。接着，将得到的溶液抽滤以除去不溶物，得到浓度为0.5％的9M LiBr水溶液。将这样得到的水溶液移入透析膜中，并用蒸馏水透析4天，得到浓度小于等于0.5％的丝的水溶液。另一方面，将胰凝乳蛋白酶溶解在数毫升水中后，加入用磷酸钠将pH调节到7.8的丝水溶液(含4g丝)，在40℃下保温24小时。将沉淀物在10000rpm下离心分离，并通过0.03N盐酸终止酶反应。将得到的沉淀物洗净，得到CP部分(约55％原始丝心蛋白)。
其序列以前已经知道，主要由重复的AGAGSG组成(Strydom等，Biochem.Biophy.Res.Commun.，3932(1977))。
将该样品溶解在9M LiBr中后，透析、沉淀得到的样品通过IR确认为Silk I型。测定该样品和(AG)15的样品的13C固体高分辨NMR，丙氨酸和甘氨酸区的峰非常一致，丙氨酸-甘氨酸共聚物是丝的结晶部(AGAGSG)n的模型。同样地，用甲酸处理它们的样品，在Silk II型的情况下，丙氨酸和甘氨酸区的峰也非常一致。工业实用性
通过构成丝样材料的共聚物的成分的变化，本发明的丝样材料可以具有各种功能。另外，由于是蛋白质，可以通过微生物得以分解；就纤维而言，由于其能够具有与天然丝类似的性质，因此是质感高级且有利环境的好的纤维。序列表
序列表<110>东京农工大学长代表的日本国<120>丝样材料前体、丝样材料及它们的制备方法<160>10<210>1<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>1Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>2Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10<210>3<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>3Gly Ala Gly Val Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10<210>4<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>4Thr Gly Phe Asp Ser Glu Ser Ser Trp Ala Tyr Glu Tyr Gly Ser 1 5 10 15Tyr Gly Gly Asn Ala Val Tyr Pro Gly Phe Gly Ser Ser Gly Thr
20 25 30<210>5<211>24<212>PRT<213>人工序列<400>5Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20<210>6<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>6Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>7<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>7Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>8Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>9<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>9Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Tyr 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>10<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>10Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly 1 5 10Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly15 20 25Tyr Gly
30<210>11<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(14)<223>Xaa代表[1-13C].<222>(15)<223>Xaa代表[1-13C]A.<400>11Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Xaa 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>12<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(15)<223>Xaa代表[1-13C]A.<222>(16)<223>Xaa代表[1-13C]G.<400>12Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Xaa 1 5 10 15Xaa Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>13<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(14)<223>Xaa代表[1-13C]G.<222>(16)<223>Xaa代表[1-13C]G.<400>13Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Ala 1 5 10 15Xaa Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>14<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(14)<223>Xaa代表[1-13C]G.<222>(16)<223>Xaa代表[15N]G.<400>14Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>15<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(15)<223>Xaa代表[1-13C]A.<222>(17)<223>Xaa代表[15N]A.<400>15Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Xaa 1 5 10 15Gly Xaa Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly
20 25 30<210>16<211>30<212>PRT<213>人工序列<222>(14)<223>Xaa代表[1-13C]G.<222>(17)<223>Xaa代表[15N]A.<400>16Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Xaa Ala 1 5 10 15Gly Xaa Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly