植物抗病毒相关蛋白GmSN1及其编码基因和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610837228.5 (22)申请日 2016.09.21 (71)申请人 东北师范大学 地址 130024 吉林省长春市人民大街5268 号 申请人 吉林省农业科学院庞劲松 (72)发明人 庞劲松贺红利杨向东寻红卫 杨静张伟牛陆邢国杰 刘晓梅董英山刘宝 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (54)发明名称 植物抗病毒相关蛋白GmSN1及其编码基因和 应用 (57)。

2、摘要 本发明公开了一种植物抗病毒相关蛋白 GmSN1及其编码基因和应用。 本发明提供的蛋白 质， 命名为GmSN1蛋白， 是如下 （a） 或 （b） ：（a） 由序 列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； （b） 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗 病毒病相关的由序列1衍生的蛋白质。 编码所述 GmSN1蛋白的基因 （命名为GmSN1基因） 也属于本 发明的保护范围。 本发明还保护一种培育转基因 植物的方法， 是将所述GmSN1基因导入目的植物 中， 得到对植物病毒病的抗性高于所述目的植物 的转基因植物。 本发明对于培育抗植物病毒病的 转基因。

3、植物具有重大的应用价值。 权利要求书1页 说明书9页 附图3页 CN 106632628 A 2017.05.10 CN 106632628 A 1.一种蛋白质， 是如下 （1） 或 （2） ： （1） 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； （2） 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 与植物抗病毒病相关的由序列1衍生的蛋白质。 2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。 3.如权利要求2所述的基因， 其特征在于： 所述基因为如下 （1） 或 （2） 或 （3） 或 （4） 的DNA 分子： （1） 编码区如序列表的序列2所示的DNA分子； （2） 序列。

4、表的序列3所示的DNA分子； （3） 在严格条件下与 （1） 或 （2） 限定的DNA序列杂交且编码植物抗病毒病相关蛋白的DNA 分子； （4） 与 （1） 或 （2） 限定的DNA序列至少具有90%以上同一性且编码植物抗病毒病相关蛋白 的DNA分子。 4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系或重组菌。 5.一种培育转基因植物的方法， 是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中， 得到对 植物病毒病的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 6.一种培育转基因植物的方法， 是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中， 得到对 植物病毒的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 7.如。

5、权利要求5或6所述的方法， 其特征在于： 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植 物。 8.权利要求1所述蛋白质、 权利要求2所述基因、 权利要求3所述基因或权利要求4所述 重组载体在培育对植物病毒病的抗性增高的转基因植物中的应用。 9.权利要求1所述蛋白质、 权利要求2所述基因、 权利要求3所述基因或权利要求4所述 重组载体在培育对植物病毒的抗性增高的转基因植物中的应用。 10.如权利要求8或9所述的应用， 其特征在于： 所述转基因植物的出发植物为单子叶植 物或双子叶植物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106632628 A 2 植物抗病毒相关蛋白GmSN1及其编码基因和应用 技术领域 0。

6、001 本发明属于农业生物技术领域， 涉及一种植物抗病毒相关蛋白GmSN1及其编码基 因和应用。 背景技术 0002 植物病毒是可以感染高等植物的病毒， 目前已知3700多种， 分属于7个目、 111科。 不同种类的植物病毒可以感染不同的宿主植物， 使被侵染植物出现不同的症状。 多数植物 病毒是单链RNA （ssRNA） 病毒， 也有的核酸成分为单链DNA、 双链DNA和双链RNA。 大豆花叶病 毒病是一种常见的大豆病害， 是由大豆花叶病毒 （Potyviridae, Soybean Mosaic Virus, SMV） 引起的， 该病毒为马铃薯Y病毒科马铃薯病毒属的一个种。 大豆花叶病毒与其。

7、它马铃薯 病毒属成员的共同点是种子带毒， 蚜虫为主要传毒介体。 大豆花叶病毒的体外保毒期在环 境为室温、 4和0以下分别为4-5 天、 15天和120天左右， 其致死温度为58-66， 稀释限 点为10-5。 0003 大豆花叶病毒可以通过种子在上下代和不同地域之间传播， 在田间又可通过汁液 摩擦接种及蚜虫进行非持久性传播。 大豆花叶病毒病危害重、 流行广， 难以控制。 该病于 1899年首次在中国东北发现， 相继又在美国、 朝鲜、 德国、 苏联等国家发现， 现已成为世界性 病害， 严重影响大豆产量和品质。 近年来该病在中国东北地区发生越来越严重， 一般流行年 造成减产25%-60%， 大流行。

8、年可造成绝产。 例如1978年中国皖北阜阳地区大豆花叶病猖獗， 造成150万亩大豆绝产。 0004 大豆花叶病毒在植株上的症状主要分花叶和坏死两大类。 花叶类症状表现为感染 初期嫩叶上出现明脉， 随着病程的发展， 陆续出现轻花叶、 花叶、 黄斑花叶、 叶片向下反卷， 有些还出现疱叶、 畸形叶、 皱缩、 矮化、 增厚发脆， 茎杆和豆荚上的茸毛消失， 产生 “光荚” 。 坏 死型症状主要表现为感染初期叶片上出现褐色小枯斑或叶脉坏死， 随后坏死部分扩大甚至 连成一片， 严重者导致叶片脱落。 某些品种感染特定株系后， 主茎生长点坏死， 形成所谓的 “顶枯” 。 大豆花叶病毒病不但影响大豆的产量， 还影。

9、响大豆的种子质量， 可造成病株籽粒出 现褐斑， 发病严重时病籽粒率高达50%以上， 严重降低大豆的商品价值。 斑纹的发生受大豆 品种和发病程度的影响。 大豆花叶病毒病在籽粒上形成的斑纹颜色与脐色一致或稍深， 有 时斑纹会遍布整个籽粒表面， 多数呈现放射状或带状。 吴宗璞将斑驳按颜色划分为淡褐斑、 深褐斑、 赤褐斑、 紫褐斑、 黑色斑、 灰兰斑和双色斑7种； 按形状分为河川状、 轮纹状、 放射状、 不规则斑块状、 花斑和脐一侧双条带斑6种。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种植物抗病毒相关蛋白GmSN1及其编码基因和应用。 0006 本发明提供的蛋白质， 来自大豆， 命名为GmSN1蛋白。

10、， 是如下 （1） 或 （2） ：（1） 由序列 表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2） 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病毒病相关的由序列1衍生的蛋白质。 说明书 1/9 页 3 CN 106632628 A 3 0007 为了使 （1） 中的蛋白质便于纯化， 可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。 0008 表1 标签的序列 标签残基序列 Poly-Arg5-6 （通常为5个）RRRRR Poly-His2-10 （通常为6个）HHHHHH FLAG8DYKDDDDK Stre。

11、p-tag II8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL 上述 （2） 中的蛋白质可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。 上述 （2） 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基 酸残基的密码子， 和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5 端和/或3 端连上 表1所示的标签的编码序列得到。 0009 编码所述GmSN1蛋白的基因 （命名为GmSN1基因） 也属于本发明的保护范围。 0010 所述基因具体可为如下 （1） 或 （2） 或 （3） 或 （4） 的DNA分子： （1） 编码区如序列表的序列2所示的DNA。

12、分子 （开放阅读框） ； （2） 序列表的序列3所示的DNA分子 （基因组DNA） ； （3） 在严格条件下与 （1） 或 （2） 限定的DNA序列杂交且编码植物抗病毒病相关蛋白的DNA 分子； （4） 与 （1） 或 （2） 限定的DNA序列至少具有90%以上同一性且编码植物抗病毒病相关蛋白 的DNA分子。 0011 上述严格条件可为： 50， 在7 SDS、 0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交， 在65， 0.1SSC， 0.1% SDS中漂洗。 上述严格条件也可为： 在6SSC， 0.5% SDS的溶液中， 在65下杂交， 然后用2SSC,0.1% SDS和1SSC。

13、,0.1% SDS各洗膜一次。 0012 含有所述GmSN1基因的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。 0013 可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。 所述表达载体还可包含 外源基因的3 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的 DNA片段。 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3 端。 使用所述基因构建重 组表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子， 它 们可单独使用或与其它的启动子结合使用； 此外， 使用本发明的基因构建重组表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增。

14、强子或转录增强子。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基 因。 为了便于进行鉴定及筛选， 可对所述重组表达载体进行加工， 如加入编码可产生颜色变 化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。 0014 所述重组表达载体具体可为将所述GmSN1基因插入pB7FWG2载体的重组位点之间 得到的重组质粒pB7FWG2-GmSN1。 0015 所述重组质粒pB7FWG2-GmSN1的构建方法具体如下： 合成序列表的序列2所示的 双链DNA分子； 以步骤合成的双链DNA分子为模板， 采用。

15、F1和R1组成的引物对进行PCR扩 说明书 2/9 页 4 CN 106632628 A 4 增， 得到PCR扩增产物； 步骤的PCR扩增产物与pDONOR221载体发生BP重组反应， 得到中 间质粒； 中间质粒与PB7FWG2载体发生LR重组反应， 得到重组质粒pB7FWG2-GmSN1， 重组质 粒pB7FWG2-GmSN1中， attB1位点和attB2位点之间为序列表的序列2所示的双链DNA分子； F1： 5 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3； R1： 5 - GGGGACCACTTTGTACAAGAAA。

16、GCTGGGTGAGGGCATTTGTCCTTGCC -3 。 0016 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述GmSN1基因导入目的植物中， 得到对植物病毒病的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 所述GmSN1基因具体可通过所 述重组表达载体导入所述目的植物。 所述方法中， 所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri 质粒、 植物病毒载体、 直接DNA转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植 物细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。 所述GmSN1基因具体可通过所述重组质粒 pB7FWG2-GmSN1导入所述目的植物中。 所述目的植物可为单子叶植物或双子叶。

17、植物。 所述双 子叶植物具体可为大豆， 如大豆栽培品种P03-8-23。 所述植物病毒病具体可为由大豆花叶 病毒强毒3号株系引起的植物病毒病。 0017 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述GmSN1基因导入目的植物中， 得到对植物病毒的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 所述GmSN1基因具体可通过所述 重组表达载体导入所述目的植物。 所述方法中， 所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri质 粒、 植物病毒载体、 直接DNA转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导等常规生物学方法转化植物 细胞或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。 所述GmSN1基因具体可通过所述重组质粒 pB。

18、7FWG2-GmSN1导入所述目的植物中。 所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。 所述双 子叶植物具体可为大豆， 如大豆栽培品种P03-8-23。 所述植物病毒具体可为由大豆花叶病 毒强毒3号株系。 0018 本发明还保护所述GmSN1蛋白、 所述GmSN1基因或所述重组载体在培育对植物病毒 病的抗性增高的转基因植物中的应用。 所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。 所述双子 叶植物具体可为大豆， 如大豆栽培品种P03-8-23。 所述植物病毒病具体可为由大豆花叶病 毒强毒3号株系引起的植物病毒病。 0019 本发明还保护所述GmSN1蛋白、 所述GmSN1基因或所述重组载体在培育对植物病毒。

19、 的抗性增高的转基因植物中的应用。 所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。 所述双 子叶植物具体可为大豆， 如大豆栽培品种P03-8-23。 所述植物病毒具体可为大豆花叶病毒 强毒3号株系。 0020 本发明对于培育抗植物病毒病的转基因植物具有重大的应用价值。 附图说明 0021 图1对两个转基因株系 （B6F7015和B6F7016） 的T2代植株进行PCR鉴定的部分结果。 0022 图2 GmSN1的表达水平检测。 0023 图3转基因植株的southern blot鉴定。 0024 图4 T1代转基因大豆的抗病鉴定结果， A为苗期， B为花期。 0025 图5为T2代转基因大豆的抗病鉴。

20、定结果 （花期） 。 具体实施方式 说明书 3/9 页 5 CN 106632628 A 5 0026 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 0027 pDONOR221载体： Invitrogen公司 “Multisite Gateway Pro Plus Kit for 2-,3- or 4-fragment recombination” 试剂盒中的组件， Cat.。

21、#12537-100， 公众可以从商 业途径获得。 0028 pB7FWG2载体： Plant system biology公司产品， http:/gateway.psb.ugent.be/ vector/show/pB7FWG2/search/index/， 公众可以从商业途径获得。 农杆菌EHA101： 参考文 献： Regeneration Study of Soybean Cultivars and Their Susceptibility to Agrobacterium tumifaciens EHA 101. Acta Agron Sin, 2003, 29(5): 664-66。

22、9. 大豆栽培品种P03-8-23， 中黄35和九农9号： P03-8-23由吉林省农业科学院大豆研究所 利用栽培九农27和平安1008杂交选育获得的大豆品系； 以上品种公众可以从吉林省农业科 学院大豆研究所获得。 0029 大豆花叶病毒强毒3号株系 （SMV SC-3） ： 参考文献： 郑翠明， 常汝镇， 邱丽娟， 吴宗 璞， 高凤兰。 大豆种质资源对SMV3号株系的抗性鉴定。 大豆科学， 2000， 19(4)： 299-306， 公众 可以从吉林省农业科学院植物保护研究所获得。 0030 实施例中所用到的各个培养基的配方见表2。 MS合成盐购自Sigma公司， 货号为 M5524。 B5。

23、合成盐购自Sigma公司， 货号为G5768。 0031 表2 培养基配方 GMCCMSIMSEMRM MS 合成盐 MS salt mixture11/2 B5 合成盐 B5 salt mixture11/101 2-(4-吗啉)乙磺酸 MES/gL13.900.590.590.59 6-苄基腺嘌呤 6-BAP/mgL11.67 1.67 赤霉素 GA3/mgL10.25 0.50 乙酰丁香酮 AS/mM0.20 L半胱氨酸 L-Cys/mgL1400.00 二硫苏糖醇 DTT/mgL1154.20 替卡西林 Tic/mgL1250.00250.00250.00 头孢霉素 Cef/mgL11。

24、00.00100.00100.00 L-天冬酰胺 L-Asp/mgL150.0050.00 谷氨酰胺 Glu/mgL150.0050.00 草丁膦 Glufosinate/mgL15.005.00 吲哚乙酸 IAA/mgL10.10 玉米素 ZR/mgL11 吲哚丁酸 IBA/mgL11 蔗糖Sucrose （w/v）2.003.003.003.002.00 琼脂Agar/gL14.508 .008.00 说明书 4/9 页 6 CN 106632628 A 6 植物凝胶Phytagar /gL13.003.00 pH5.805.405.705.705.60 实施例1、 GmSN1蛋白及其编码。

25、基因的发现 将中黄35 （大豆花叶病毒病抗病品种） 和九农9号 （大豆花叶病毒病感病品种） 分别播种 于装有灭菌土的纸杯中， 放入光照培养箱中培养， 每天光照16小时， 黑暗8小时， 温度25。 每个品种分为两组实验组和对照组， 实验组在第一片三出复叶摩擦接种大豆花叶病 毒， 对照组不接种大豆花叶病毒。 感病品种实验组叶片出现轻微花叶时， 进行取材， 取材部 位为刚发病的叶片， 对照组取与其对应位置的叶片。 这样共得到四个样本。 0032 从各个样本中提取RNA并进行Affymetrix芯片 （Affymetrix公司大豆芯片# 900525， 可从美国Affymetrix公司购得） 杂交， 。

26、筛选出各组合比较表达差异在2倍以上的基 因片段一批。 在此基础上依次获取全长基因并验证抗病毒功能。 0033 进行大量验证试验后， 发现一种蛋白， 如序列表的序列1所示， 将其命名为GmSN1蛋 白。 将编码GmSN1蛋白的基因命名为GmSN1基因， 其开放阅读框如序列表的序列2所示， 其基 因组DNA如序列表的序列3所示(序列表的序列3中， 自5 末端第265-346位核苷酸和第484- 668位核苷酸为外显子)。 0034 实施例2、 应用GmSN1基因培育抗病大豆 一、 重组质粒的构建 1、 合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。 0035 2、 以步骤1合成的双链DNA分子为模板， 。

27、采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增， 得 到PCR扩增产物。 0036 F1： 5 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3 ；（序列 表序列4） R1： 5 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGAGGGCATTTGTCCTTGCC-3 。（序列表序列5） F1中的下划线标注attB1位点， R1中的下划线标注attB2位点。 0037 3、 步骤2的PCR扩增产物与pDONOR221载体发生BP重组反应， 得到中间质粒。 0038 4、 中间质粒与pB7FWG2载体发生LR重组反应， 得。

28、到重组质粒pB7FWG2-GmSN1。 重组 质粒pB7FWG2-GmSN1中， attB1位点和attB2位点之间为序列表的序列2所示的双链DNA分子。 0039 二、 转基因植物的获得 1、 将重组质粒pB7FWG2-GmSN1导入农杆菌EHA101， 得到重组农杆菌。 0040 2、 用CCM液体培养基悬浮重组农杆菌， 得到OD600nm=0.50.8的菌悬液。 0041 3、 取大豆栽培品种P03-8-23的种子， 在含有氯气的密闭容器中灭菌12-16个小时。 0042 4、 完成步骤3后， 取种子， 种脐朝下置于GM培养基平板上， 23暗培养24小时。 0043 5、 完成步骤4后，。

29、 取种子， 用无菌解剖刀沿种脐切开， 并去掉腋芽， 在腋芽上方凹槽 处平行于中轴划34个切口， 然后置于步骤2得到的菌悬液中浸泡3040分钟。 0044 6、 完成步骤5后， 将种子移至铺有无菌滤纸的CCM培养基平板上， 23暗培养45 天。 0045 7、 完成步骤6后， 将种子转移至SIM培养基平板上， 25、 16h （光） /8h （暗） 培养， 每2 3周继代1次,共继代培养35次。 0046 8、 完成步骤7后， 将诱导出丛生芽的外植体上的子叶切去， 置于SEM培养基平板上， 说明书 5/9 页 7 CN 106632628 A 7 25、 16h （光） /8h （暗） 培养， 。

30、每23周继代1次， 共继代培养23次， 继代时去掉褐化的愈伤 组织。 0047 9、 完成步骤8后， 当再生芽生长至48cm时， 将再生芽切下后转移至RM培养基平板 上， 25、 16h （光） /8h （暗） 培养。 0048 10、 完成步骤9后， 当再生植株长出2条以上的根， 移至炼苗室驯化35天， 然后转 移至温室中生长， 得到T0代植株。 0049 11、 T0代植株单株自交， 获得T1代植株。 0050 12、 将T0代植株和T1代植株分别进行PCR鉴定， 方法如下： 提取基因组DNA， 将基因 组DNA作为模板， 采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增， 如果同时得到264bp。

31、和403bp的扩 增产物， 鉴定结果为阳性； 如果只得到了403bp大小的扩增产物， 则鉴定结果为阴性。 0051 F2： 5 -ATGAAGCTCGAGTTCGCAAA-3 ；（序列表序列6） R2： 5 -AGGGCATTTGTCCTTGCC-3 。（序列表序列7） 13、 T1代植株单株自交， 获得T2代植株。 0052 14、 取T2代植株， 按照步骤12的方法进行PCR鉴定。 0053 两个转基因株系(B6F7015和B6F7016)的T2代植株进行PCR鉴定的部分结果见图1。 0054 图1. 部分转基因株系PCR鉴定的结果。（1、 2为B6F7015株系的两个单株扩增产物， 3、。

32、 4为B6F7016株系的两个单株扩增产物） 15、 转基因植株外源基因表达水平检测： （1） 采用Trizol试剂 （Ambion， 15596-026） ， 按照说明书方法， 分别提取受体植株、 转基 因植株和阴性植株的总RNA； （2） 反转录： 采用SuperScript （Invitrogen， 11754-050） 反转录试剂盒， 按照说明书 方法得到cDNA。 0055 (3)检测基因表达水平： 采用TOYOBO实时定量PCR试剂盒(Toyobo,QPK-212)， 以 cDNA为模板， F2和R2为引物， PCR仪器为Abi StepOnePlus， 按照说明书方法进行实时定量。

33、 PCR检测GmSN1在各株系中的表达水平。 从图2中可见在两个转基因株系中GmSN1比受体植株 和阴性转基因植株分别高672和100倍。 0056 图2. GmSN1的表达水平检测 16、 转基因植株的southern blot鉴定。 0057 Southern杂交方法如下： (1)酶切基因组DNA： 分别提取两个转基因株系各3个单株、 受体植株和转基因阴性植株 的基因组DNA， 各取20 g 基因组DNA加入20 l Promega buffer H， 3 l EcoRI (Promega） ， 2 l 100X BSA， ddH2O 补足到200 l， 37酶切24小时。 然后冻干机冻干。

34、酶切样品， 加入50 l ddH2O溶解。 0058 (2)标记杂交探针： 在0.2ml PCR管中加入需要标记的DNA(一般使用1ug标记后分 几次使用)， 用双蒸馏水将体积稀释到15 l,放入沸水中变性10分钟， 快速放于冰上。 加入 Hexanucleotide Mix （10） 2 l， dNTP Labeling Mix 2 l， Klenow enzyme labeling grade 1 l； 混合后瞬时离心， 37反应24小时， 加入0.2M EDTA （pH8.0） 2 l， 终止反应， 或者 65加热10分钟终止反应。 0059 (3)电泳： 1%琼脂糖凝胶电泳酶切的大豆基。

35、因组DNA， 电压13V电泳36h。 分离后的琼 说明书 6/9 页 8 CN 106632628 A 8 脂糖凝胶在紫外灯下切胶， 切除胶孔， 留下溴酚蓝指示剂， 大概胶孔至溴酚蓝指示剂留下位 置长度不超过10cm， 否则无法装入杂交管。 在凝胶右上角切掉一个角作为标记。 记录凝胶尺 寸。 使用脱嘌呤试剂 （1.1% HCl） 处理凝胶810min， 保持凝胶晃动， 直至溴酚蓝从蓝色变为 黄色。 用去离子水清洗两次， 进行下一步。 使用变性液 （NaCl 8.766%， NaOH 2%） 处理脱嘌呤 后的凝胶30min， 保持凝胶晃动， 可发现溴酚蓝又变回蓝色。 用去离子水清洗两次， 使用中。

36、和 液 （Trizma base 0.0605%， NaCl 0.08766%， 用浓HCl调pH至7.5） ， 处理变性后的凝胶30min， 保持凝胶晃动。 用去离子水清洗两次。 0060 (4)转膜： 裁取两张滤纸， 使用大胶板搭桥， 尺寸33cm26cm。 再裁取比凝胶尺寸稍 大一点滤纸34张 （最好横竖纹与搭桥时滤纸横竖纹方向一致） ， 尼龙膜1张。 在尼龙膜的一 面右下角标注好样品、 酶切及时间， 并在右上角剪掉一角做标记， 与凝胶匹配。 此时， 有标注 的一面则是背面， 另一面上有DNA。 裁取大量与尼龙膜大小相同或稍大的吸水纸。 利用虹吸 作用， 从下到上依次是： 两张搭桥用滤纸。

37、、 凝胶、 尼龙膜、 34张滤纸、 吸水纸、 玻璃板、 重物。 每张滤纸或凝胶或膜之间不能有气泡， 用玻璃棒赶平， 加入转移液 （氯化钠 17.532%， 柠檬 酸钠0.0882%， 用固体NaOH调pH至7.0） ， 再用保鲜膜将凝胶四周包围， 并覆盖托盘， 减少转移 液挥发， 确保转移液只能通过凝胶、 尼龙膜、 滤纸等向上吸。 注意更换吸水纸。 0061 (5)杂交： 杂交： 使用紫外交联仪固定转移到尼龙膜上的DNA， 设定70000uJ/cm2。 膜 正面有DNA一面朝上进行紫外交联。 使用25ml空白杂交液 （SDS 7%, formamide (deionize) 50%, 5SSC。

38、, Blocking solution 2%, N-lauroylsarcosine 0.1%, Sodium Phosphate, pH7.0, 50mM） 42预杂交大于2小时。 含有探针的杂交液从冰箱中拿出， 沸水煮10min， 立即 放于冰上冷却， 进行变性。 加1 l标记好的Marker混入杂交液中。 回收空白杂交液， 冻入冰 箱， 换成含有探针的杂交液杂交过夜。 次日将含探针杂交液回收， 冻入冰箱， 加入洗液I （1 SSC, 0.1% SDS） ， 65 15min， 洗膜一次。 加入洗液II （0.5SSC, 0.1% SDS） ， 65 20min， 洗膜两次。 以上两步洗去。

39、多余探针。 以下步骤在常温下进行， 加入Washing buffer （马来酸 buffer： 马来酸0.1M， NaCl 0.15M， 用NaOH调pH至7.5； 加3 l/ml Tween-20） 适量， 轻度漂洗1 5分钟。 加入Blocking solution （blocking reagent 1%溶于100ml马来酸buffer） ， 杂交管 中反应， 两次30分钟/次， 封闭蛋白。 将Antibody （即离心检测试剂盒中3号试剂） 10000rpm 离心5min， 每次使用前都需要离心， 吸取上清1l 加入Blocking solution， 配制成 Antibody sol。

40、ution。 将上步中Blocking solution倒出， 加入Antibody solution， 杂交管 中反应60分钟。 换管， 将膜从Antibody solution中拿出， 换入Washing buffer （洗液I： 1 SSC， 0.1% SDS； 洗液II： 0.5SSC， 0.1% SDS） 中漂洗2次， 每次15分钟。 0062 (6)检测： 洗掉多余抗体， 将Washing buffer倒出， 加入Detection buffer(Tris- HCl 0.1M， NaCl 0.1M， 用HCl调pH至9.5)， 25分钟。 提前配制好CSPD solution， 取。

41、10 l CSPD原液， 用Detection buffer稀释至1.5ml， 铺好保鲜膜， 将杂交膜带有DNA的一面朝上放 置， 加入1ml CSPD solution， 通过左右上下调节保鲜膜快速将CSPD solution均匀涂满整 张膜， 充分反应5分钟后， 除去多余的CSPD solution， 回收用过一次的CSPD solution。 将杂 交膜置于37反应15分钟。 以增强发光反应， 要将膜裸露正面向上放置。 将膜正面朝下放在 保鲜膜上， 用保鲜膜包裹住尼龙膜， 用酒精棉擦平膜的正反面， 确保保鲜膜与尼龙膜间无气 泡产生， 之后于暗室中置于X-ray底片曝光30分钟以上。 将压。

42、好的片子依次放入显影液、 停 影液(低浓度醋酸溶液， 取2ml左右溶于自来水中即可)、 定影液。 之后用水冲洗， 挂着晾干。 说明书 7/9 页 9 CN 106632628 A 9 可见2个转基因植株系的植株中各带有1个拷贝的外源基因(southernblot结果见图3)。 将 杂交过的杂交膜放在双蒸水中漂洗25min， 用洗膜液(0.1SDS， 0.2M NaOH)在37中漂 洗两次， 每次15分钟， 再用2SSC漂洗5分钟， 保鲜膜包好， -20保存以备下次杂交或可以 直接预杂交。 0063 图3. 转基因植株的southern blot鉴定。 B6F7015和B6F7016株系的各选3。

43、个单株， 质粒载体为阳性对照， P03-8-23为转化受体阴性对照， Marker为分子量标准品。 0064 对于某一T1代植株来说， 如果该植株与其T2代植株均为鉴定阳性， 该T1代植株为 纯合的转基因植株， 该植株及其自交后代为转基因株系。 利用纯合的转基因基因株系开展 后续研究。 0065 三、 空载体质粒的获得： pB7FWG2载体中有自杀基因ccdB， 它在普通原核细菌 （包括大肠杆菌和农杆菌） 中表达 出致死蛋白杀死宿主， 只有在特殊菌株才能正常存活， 所以不能将它导入农杆菌用于转化 植物， 而是必须去掉ccdB基因之后才可以作为空载体质粒。 0066 用限制性内切酶Bsp1407。

44、I （FastDigest ， Fermentas） 酶切pB7FWG2载体， 回收大 片段， 用T4 DNA连接酶连接， 得到空载体质粒。 0067 四、 转空载体植物的获得： 用空载体质粒代替重组质粒pB7FWG2-GmSN1， 其它同步骤二， 得到转空载体植株。 0068 五、 转基因植物的抗花叶病毒病鉴定： 分别将两个转基因株系 （B6F7015和B6F7016） 的T1代植株和T2代植株， 转空载体对照的 T1代植株和T2代植株， 及大豆栽培品种P03-8-23， 进行大豆花叶病毒抗性鉴定， 每个株系对 20株T1代植株进行鉴定， 每个株系对60株T2代植株进行鉴定， 方法如下： 在。

45、大豆苗期 （第一片复叶展开） ， 采用汁液摩擦接种法接种大豆花叶病毒强毒3号株系 （SMV SC-3） ， 于开花前后进行抗性调查， 大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分标准见 表3， 大豆抗花叶病毒病抗性评价标准见表4， 抗性调查的结果见表5。 T1代和T2代B6F7015、 B6F7016和转化受体品种P03-8-23接种大豆花叶病毒强毒3号株系后的照片分别见图4及图 5。 0069 表3 大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分 病情级别症状描述 0无症状反应。 1轻花叶型， 植株生长正常， 叶片平展不皱， 有黄绿与暗绿相间的轻花叶。 3重花叶型， 植株生长基本正常， 叶片明脉微皱， 有明显。

46、黄绿相间的斑驳。 5皱花叶型， 植株生长接近正常， 不矮化， 叶片有波状斑或沿叶缘曲叶或泡状突起， 黄化型叶片有黄斑。 7皱缩型， 植株生长不正常， 略矮化及黄化， 叶片明显皱缩， 呈泡状畸形卷曲。 9矮化型： 植株极端矮化， 叶片僵化狭窄、 畸形卷曲， 严重的出现顶端坏死， 芽枯或黄萎。 病情指数 （DI） =(发病级别代表值该级别病株数)/ （调查总株数发病最高级别代 表值） 100 表4 大豆抗花叶病毒病抗性评价标准 病情指数抗性评价 0免疫 （IM） 0.120.0高抗 （HR） 说明书 8/9 页 10 CN 106632628 A 10 20.135.0中抗 （MR） 35.150。

47、.0中感 （MS） 50.170.0感 （S） 70.1100.0高感 （HS） 表5 抗性调查的结果 株系T1世代病情指数T2世代病情指数抗性评价 B6F70154.990.780.790.12HR/HR B6F70165.560.00.410.71HR/HR 转空载体植株20.996.988.815.26R/HR 大豆栽培品种P03-8-2324.143.516.192.16R/HR 连续2代接种鉴定结果表明： 在鉴定的2个转基因株系中， 转基因大豆株系B6F7015病情 指数为0.79-4.99%， B6F7016病情指数为0.41-5.56%。 尽管不同年份间鉴定结果存在显著性 差异，。

48、 但在同一年份中， 其病情指数均极显著低于对照品种P03-8-23 （病情指数为6.19- 24.14） ， 表现为高抗 （HR） 或接近免疫 （IM） 。 本研究结果表明， GmSN1在大豆中的过量表达可 以显著提高其抗病毒水平。 0070 图4.T1代GmSN1转基因植株抗花叶病毒病鉴定 图5. T2代GmSN1转基因植株抗花叶病毒病鉴定接种大豆花叶病毒15天之后。 0071 可见转GmSN1基因的植株没有出现任何感染大豆花叶病毒的病症。 而受体和空载 体转化植株都出现了叶片皱缩的大豆花叶病毒侵染病症。 说明书 9/9 页 11 CN 106632628 A 11 图1 图2 说明书附图 1/3 页 12 CN 106632628 A 12 图3 图4 说明书附图 2/3 页 13 CN 106632628 A 13 图5 说明书附图 3/3 页 14 CN 106632628 A 14 。