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1、(10)授权公告号 CN 101717755 B (45)授权公告日 2012.06.27 CN 101717755 B *CN101717755B* (21)申请号 200810148898.1 (22)申请日 2008.10.09 C12N 9/08(2006.01) (73)专利权人 哈尔滨仁皇药业股份有限公司 地址 150300 黑龙江省哈尔滨市阿城区仁皇 路 16 号 (72)发明人 李绍铭 (74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理 有限责任公司 11139 代理人 孙皓晨 费碧华 CN 1908005 A,2007.02.07, WO 00/47624 A1,2000.08.。
2、17, 张耀庭等 . 应用磺基水杨酸法测定蛋白含 量 .中国生物制品学杂志 .2001, 第 14 卷 ( 第 4 期 ),247 248. Juan Guevara,Jr. et al.Quantitative aspects of silver deposition in proteins resolved in complex polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS .1982, 第 3 卷 ( 第 4 期 ),197 205. (54) 发明名称 复合蛋白沉淀剂、 其制备方法及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种复合蛋白沉淀剂及其制备 方法。本发明复。
3、合蛋白沉淀剂由以下重量份的组 分组成 ： 5- 磺基水杨酸 1 1.5 份、 硫酸钾 75 85 份和蒸馏水 15 25 份。本发明复合蛋白沉淀 剂能有效的选择性的沉淀动物血液中的杂蛋白， 其沉淀率达 99以上， 可应用于超氧物歧化酶的 制备， 从而提高提取和分离超氧物歧化酶的效率。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 宋智刚 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种复合蛋白沉淀剂， 其特征在于， 由以下重量份的组分组成 ： 5- 磺基水杨酸 1 1.5 份、 硫酸钾。
4、 75 85 份和蒸馏水 15 25 份。 2.按照权利要求1的复合蛋白沉淀剂， 其特征在于， 各组分的重量份是 ： 5-磺基水杨酸 1.2 份、 硫酸钾 80 份、 蒸馏水 20 份。 3. 一种制备权利要求 1 所述复合蛋白沉淀剂的方法， 包括 ： 按下述重量份称取各组分 ： 5- 磺基水杨酸 1 1.5 份、 硫酸钾 75 85 份和蒸馏水 15 25 份 ； 将上述各组分充分混 合均匀， 即得。 4. 权利要求 1 或 2 所述复合蛋白沉淀剂在制备超氧物歧化酶中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101717755 B 2 1/3 页 3 复合蛋白沉淀剂、 其制备方法及应用 技术领域 。
5、0001 本发明涉及一种蛋白沉淀剂， 尤其涉及一种 SOD 生产专用的蛋白沉淀剂、 本发明 还涉及该蛋白沉淀剂的制备方法及应用， 属于生物制药领域。 背景技术 0002 超氧物歧化酶(Superoxide dismutaee简称SOD)是一种新型酶制剂， 是生物体内 重要的抗氧化酶， 广泛分布于各种生物体内， 如动物， 植物， 微生物等。SOD 具有特殊的生理 活性， 是生物体内清除自由基的首要物质。 超氧物歧化酶原来从牛血中制取， 现多从猪血中 提取， 商品名为 Orgotdin。目前， 国内外超氧化物歧化酶 (SOD) 的生产主要经过采血、 取血 球、 丙酮沉淀、 热处理、 透析、 上柱、。
6、 浓缩、 冷冻干燥而成。采用上述制备工艺的生产车间要 达到制药业标准， 工艺非常复杂， 要使用大量的机械设备、 容器、 和各种仪器装置， 还要使用 大量的乙醇， 氯仿、 丙酮等有害的化学试剂， 此外， 丙酮和乙醇还不能使用一个回收装置， 所 以出品率极低， 每公斤血液只能生产出 0.01-0.03 克 SOD， 甚至更少， 而且活力标准大多为 3500u/mg 左右。 0003 如果将现有的超氧物歧化酶的生产工艺进行简化， 需要提供一种能够充分的将动 物血液中蛋白质沉淀下来的蛋白沉淀剂， 以便提高超氧物歧化酶的提取和分离效率。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，。
7、 提供一种蛋白沉淀剂， 该蛋 白沉淀剂能够有效将动物血液的蛋白质沉淀下来， 解决了从动物血液中提取 SOD 时， 蛋白 质沉淀率低、 提取分离效果差等问题。 0005 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 ： 0006 一种复合蛋白沉淀剂， 由以下重量份的各组分组成 ： 0007 5- 磺基水杨酸 1 1.5 份、 硫酸钾 75 85 份和蒸馏水 15 25 份。 0008 优选的， 各组分的重量份是 ： 5- 磺基水杨酸 1.2 份、 硫酸钾 80 份和蒸馏水 20 份。 0009 为了达到更好的效果， 所述的 5- 磺基水杨酸和硫酸钾的规格优选为分析纯。 0010 本发明所要。
8、解决的另一个技术问题是提供一种制备复合蛋白沉淀剂的方法。 0011 本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的 ： 0012 一种制备复合蛋白沉淀剂的方法， 包括 ： 0013 按下述重量份称取各组分 ： 5- 磺基水杨酸 1 1.5 份、 硫酸钾 75 85 份和蒸馏 水 15 25 份 ； 将上述各组分充分混合均匀， 即得。 0014 本发明蛋白沉淀剂可以选择性的将动物血液中的杂蛋白沉淀， 对于杂蛋白的沉淀 率高达 99以上， 而不将超氧物歧化酶沉淀， 提高提取和分离超氧物歧化酶的效率， 可应用 于超氧物歧化酶的制备和纯化。 具体实施方式 说 明 书 CN 101717755。
9、 B 3 2/3 页 4 0015 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0016 实施例 1 复合蛋白沉淀剂的制备 0017 按下述重量份称取各组分 ： 5- 磺基水杨酸 ( 分析纯 )0.1kg、 硫酸钾 7.5kg( 分析 纯 ) 和蒸馏水 ( 分析纯 )1.5kg ； 将上述各组分充分混合均匀， 即得。 0018 实施例 2 复。
10、合蛋白沉淀剂的制备 0019 按下述重量份称取各组分 ： 5- 磺基水杨酸 ( 分析纯 )0.15kg、 硫酸钾 ( 分析 纯 )8.5kg 和蒸馏水 2.5kg ； 将上述各组分充分混合均匀， 即得。 0020 实施例 3 复合蛋白沉淀剂的制备 0021 按下述重量份称取各组分 ： 5- 磺基水杨酸 ( 分析纯 )0.12kg、 硫酸钾 ( 分析 纯 )8.0kg 和蒸馏水 2.0kg ； 将上述各组分充分混合均匀， 即得。 0022 试验例 1 本发明复合蛋白沉淀剂应用效果试验 0023 1. 取 100kg 牛凝血块放入搅拌罐中室温搅拌， 搅拌时加入实施例 1 所制备的复合 蛋白沉淀剂 。
11、1L， 持续搅拌 20 分钟 ； 先用 80 目滤网过滤， 然后用板框过滤器过滤， 收集滤液 ； 0024 2. 取滤液用高速管式离心机离心 ( 转速 16000rpm)， 取上清液， 备用 ； 0025 3. 将上清液用板式膜超滤器进行第一次超滤， 膜孔径为 50000D， 取滤出液， 备用 ； 0026 4. 将步骤 3 所得到的滤出液经板式膜超滤器进行第二次超滤， 膜孔径为 30000D， 取截流液， 备用。 0027 5. 取截流液进行冷冻干燥， 首先在零下 20 17的温度条件下冻干 6 8h ； 然 后在零下 10 7温度条件下持续冻干 2h ； 冻干结束后， 升温至 20， 收集。
12、冻干粉， 装入无 菌袋中， 密封， 得SOD成品， 零下4保存。 经检测， 本发明方法的收率为50万个活力单位的 SOD/kg 血块， 酶活性为 4000 12000u/mg。 0028 试验例 2 本发明复合蛋白沉淀剂应用效果试验 0029 1. 取 100kg 猪凝血块放入搅拌罐中室温搅拌， 搅拌时加入实施例 2 所制备的复合 蛋白沉淀剂 1L， 持续搅拌 15 分钟 ； 先用 60 目滤网过滤， 然后用板框过滤器过滤， 收集滤液 ； 0030 2. 取滤液用高速管式离心机离心， 取上清液， 备用 ； 0031 3. 将上清液用板式膜超滤器进行第一次超滤， 膜孔径为 50000D， 取滤出。
13、液， 备用 ； 0032 4. 将步骤 3 所得到的滤出液经板式膜超滤器进行第二次超滤， 膜孔径为 30000D， 取截流液， 备用。 0033 5.取截流液进行冷冻干燥， 将冻干温度零下42， 首先在零下2017的温度条 件下冻干68h ； 然后在零下107温度条件下持续冻干2h ； 冻干结束后， 升温至20， 收集冻干粉， 装入无菌袋中， 密封， 得 SOD 成品， 零下 4保存 ； 经检测， 本发明方法的收率为 50 万个活力单位的 SOD/kg 血块， 酶活性为 4000 12000u/mg。 0034 试验例 3 本发明复合蛋白沉淀剂应用效果试验 0035 1. 取 100kg 羊凝。
14、血块放入搅拌罐中室温搅拌， 搅拌时加入实施例 3 所制备的复合 蛋白沉淀剂 1L， 持续搅拌 25 分钟 ； 先用 120 目滤网过滤， 然后用板框过滤器过滤， 收集滤 液 ； 说 明 书 CN 101717755 B 4 3/3 页 5 0036 2. 取滤液用高速管式离心机离心， 取上清液， 备用。 0037 3. 将上清液用板式膜超滤器进行第一次超滤， 膜孔径为 50000D， 取滤出液， 备用 ； 0038 4. 将步骤 3 所得到的滤出液经板式膜超滤器进行第二次超滤， 膜孔径为 30000D， 取截流液， 备用。 0039 5.取截流液进行冷冻干燥， 将冻干温度零下42， 首先在零下2017的温度条 件下冻干68h ； 然后在零下107温度条件下持续冻干2h ； 冻干结束后， 升温至20， 收集冻干粉， 装入无菌袋中， 密封， 得 SOD 成品， 零下 4保存。 说 明 书 CN 101717755 B 5 。