一种培养从枝菌根真菌的接种菌的方法及装置.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101608159 B (45)授权公告日 2013.03.27 CN 101608159 B *CN101608159B* (21)申请号 200810067947.9 (22)申请日 2008.06.20 C12M 1/00(2006.01) C12M 1/36(2006.01) C12N 1/14(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 钟明基 地址 中国香港香港浸会大学 专利权人 李伟展 吴胜春 张桂宗 黄铭洪 (72)发明人 钟明基 李伟展 吴胜春 张桂宗 黄铭洪 (74)专利代理机构 深圳市顺天达专利商标代理 有限公司 。

2、44217 代理人 蔡晓红 CN 2441299 Y,2001.08.08, 全文 . CN 1207866 A,1999.02.17,权利要求3和附 图图 1. Moreira-Souza M et al.Arbuscular mycorrhizal fungi associated with Araucaria angustifolia(Bert.)O.Ktze. MYCORRHIZA .2003,第13卷(第4期),211-215. 贺超兴等 . 丛枝菌根真菌对番茄苗期生长及 矿质营养吸收的作用 .中国蔬菜 .2006,( 第 1 期 ),9-11. (54) 发明名称 一种培养从枝菌根。

3、真菌的接种菌的方法及装 置 (57) 摘要 本发明涉及接种菌培养， 提供了一种培养从 枝菌根真菌的接种菌的方法及装置。所述培养从 枝菌根真菌的接种菌的装置， 即气栽室， 包括一个 不透明的盒子及盒盖， 所述盒盖具有至少一个用 以固定寄主植物的孔， 盒内安装有为寄主植物的 根喷洒气雾的喷雾系统。 本发明通过一个不透明、 盒盖打孔、 内置喷雾系统的气栽室， 利用气栽法培 养从枝菌根真菌的接种菌， 提高了从枝菌根真菌 的接种菌的纯度， 便于贮藏和运输。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹丙洲 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。

4、12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种利用气栽室培养从枝菌根真菌的接种菌的方法， 其特征在于， 所述气栽室包括一个不透明的盒子及盒盖， 所述盒盖具有至少一个用以固定寄主植物 的孔， 盒内安装有为寄主植物的根喷洒气雾的喷雾系统 ； 所述方法包括以下步骤 ： A将从枝菌根真菌接种到所选定的寄主植物中 ； B将所述寄主植物固定到气栽室的盒盖上， 其根保持在气栽室内， 利用喷雾系统喷洒 气雾进行培养。 2.根据权利要求1所述的培养从枝菌根真菌的接种菌的方法， 其特征在于， 所述步骤A 中的接种包括 ： A1. 在一个填充有蛭石的塑料袋中， 使加入的。

5、从枝菌根真菌的接种菌与蛭石的表层混 合， 产生一个稀释后的接种菌均衡层 ； A2. 在上层蛭石的表面播种寄主植物的种子， 当寄主植物的根部进入所述接种菌均衡 层时， 接种菌繁殖到所述寄主植物上。 3.根据权利要求1或2所述的培养从枝菌根真菌的接种菌的方法， 其特征在于， 所述步 骤B中利用喷雾系统喷洒气雾的步骤包括 ： 喷雾系统每10秒钟向所述寄主植物的根喷洒一 次气雾。 权 利 要 求 书 CN 101608159 B 2 1/5 页 3 一种培养从枝菌根真菌的接种菌的方法及装置 技术领域 0001 本发明涉及接种菌培养， 更具体地说， 涉及一种培养从枝菌根真菌的接种菌的方 法及装置。 背景。

6、技术 0002 丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi， AMF)属于真菌类， 典型的例如摩 西球囊霉 (Glomus mosseae， GM)、 光壁无梗囊霉 (Acaulospora laevis， AL) 等。AMF 必须与 寄主植物的根一起生长， 其生长特点是， 菌丝在根部皮层的细胞间和细胞内生长， 可分离成 复杂的细胞内的分岔的丛枝， 该结构仅存在于繁殖有 AMF 的根中。已知菌根交感对寄主植 物有益， 菌根与寄主植物的共生关系在植物领域广泛存在， 包括许多农艺及生态学上的重 要植物。AMF 可从土壤中捕获并传输矿质营养物 ( 主要是磷 )， 从而提高。

7、植株生长速度。当 AMF 存在时， 植株对其他营养物， 例如锌、 铜等的吸收也会增加。除了提高生长速度， 一种耐 重金属的 AMF 可提高寄主植物对重金属的耐受能力。实验证明， 通过在田间应用耐重金属 的 AMF， 可使作物生长更加茂盛。 0003 目前， 主要通过土壤、 沙或营养液培养 AMF 的接种菌。但是这些方法面临的首要问 题是， 在培养过程中由于受到土壤或营养液中微生物的污染而无法获得纯粹的接种菌， 不 便于贮藏和运输。 此外这些方法各自还存在一些弊端， 例如 ： 土栽尤其难以隔离土壤中的孢 子和菌根 ； 沙栽比土栽相对要好， 但仍存在上述问题 ； 而利用营养液培养时， 水下环境不利。

8、 于 AMF 的良好生长。 0004 因此需要一种新的培养 AMF 接种菌的方法， 从而提高 AMF 接种菌的纯度。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种培养 AMF 接种菌的装置， 旨在解决现有技术中培养的 AMF 接种菌的纯度较低的问题。 0006 本发明的目的还在于提供一种培养 AMF 接种菌的方法， 以更好地解决现有技术中 存在的上述问题。 0007 为了实现发明目的， 所述培养从枝菌根真菌的接种菌的装置， 即气栽室， 包括一个 不透明的盒子及盒盖， 所述盒盖具有至少一个用以固定寄主植物的孔， 盒内安装有为寄主 植物的根喷洒气雾的喷雾系统。 0008 优选地， 所述盒子用不透明。

9、材料制作而成， 或者由透明材料制作的盒子与包装在 外的不透明的塑料袋组合而成。 0009 优选地， 所述盒子的规格如下 ： 尺寸为 65*45*43cm， 容量为 60L。 0010 优选地， 所述盒盖用聚苯乙烯板或塑料板制作而成。 0011 优选地， 所述盒盖的厚度为 8mm。 0012 优选地， 所述盒盖上具有多个孔， 各孔之间以规则的栅格图形隔离。 0013 优选地， 所述喷雾系统包括离心泵、 喷嘴和计时器 ； 说 明 书 CN 101608159 B 3 2/5 页 4 0014 所述离心泵具有可调节的泵速控制器 ； 0015 所述喷嘴与离心泵相连， 用于向寄主植物喷洒气雾 ； 001。

10、6 所述计时器与离心泵相连， 用于控制喷洒气雾的时间间隔。 0017 为了更好地实现发明目的， 还提供了一种培养从枝菌根真菌的接种菌的方法， 包 括以下步骤 ： 0018 A. 将丛枝菌根真菌接种到所选定的寄主植物中 ； 0019 B. 将所述寄主植物固定到气栽室的盒盖上， 其根保持在气栽室内， 利用喷雾系统 喷洒气雾进行培养。 0020 优选地， 所述步骤 A 中的接种包括 ： 0021 A1. 在一个填充有蛭石的塑料袋中， 使加入的丛枝菌根真菌的接种菌与蛭石的表 层混合， 产生一个稀释后的接种菌均衡层 ； 0022 A2. 在上层蛭石的表面播种寄主植物的种子， 当寄主植物的根部进入所述接种。

11、菌 均衡层时， 接种菌的菌丝在所述寄主植物根部皮层的细胞间和细胞内生长。 0023 优选地， 喷雾系统每 10 秒钟向所述寄主植物的根喷洒一次气雾。 0024 本发明通过一个不透明、 盒盖打孔、 内置喷雾系统的气栽室， 利用气栽法培养从枝 菌根真菌的接种菌， 提高了从枝菌根真菌的接种菌的纯度， 便于贮藏和运输。 附图说明 0025 图 1 是本发明中培养 AMF 接种菌的装置 ( 即气栽室 ) 的结构示意图 ； 0026 图 2 是本发明中将 AMF 接种到所选定的寄主植物中的示意图 ； 0027 图 3 是本发明中培养 AMF 接种菌的方法流程图。 具体实施方式 0028 为了使本发明的目的。

12、、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例， 对 本发明进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明， 并 不用于限定本发明。 0029 本发明通过一个不透明、 盒盖打孔、 内置喷雾系统的气栽室， 利用气栽法培养从枝 菌根真菌的接种菌， 首先将 AMF 接种到所选定的寄主植物中， 然后将寄主植物固定到气栽 室的盒盖上， 其根保持在气栽室内， 利用喷雾系统喷洒气雾进行培养。 这种培养方法提高了 AMF 接种菌的纯度。 0030 图 1 是本发明中培养 AMF 接种菌的装置 ( 即气栽室 ) 的结构示意图。该气栽室包 括一个不透明的盒子 3 及盒盖 2， 。

13、该盒盖具有至少一个用以固定寄主植物的孔 1， 盒内安装 有为寄主植物的根喷洒气雾的喷雾系统。其中 ： 0031 (1) 盒子 3 不透明， 是为了防止阳光射入气栽室， 从而阻碍营养液中微藻的生长。 盒子 3 的材料及构成方式有多种， 在一个实施例中， 盒子 3 是由一定尺寸和容量的盒子和 不透明的塑料袋组合而成。在另一实施例中， 盒子 3 直接用不透明材料 ( 例如不透明的塑 料 ) 制成。盒子 3 的尺寸也有多种方案， 在一个典型实施例中， 其尺寸为 65*45*43cm， 容量 为 60L。 0032 (2) 盒盖 2 的材料及规格有多种方案。在一个实施例中， 盒盖 2 用 8mm 厚的聚。

14、苯乙 说 明 书 CN 101608159 B 4 3/5 页 5 烯板特制而成， 当然还可采用其他材料， 例如塑料板等。 0033 (3) 盒盖 2 上的孔 1 用于固定寄主植物， 使其根部位于气栽室内。孔 1 数量及尺寸 有 n 种方案。在一个实施例中， 盒盖 2 上有 24 个孔 1， 每个孔 1 的直径为 2.5cm， 且各孔之 间以规则的栅格图形隔离。 0034 (4) 喷雾系统包括离心泵 7、 喷嘴 4 和计时器 ( 图中未示出 )， 以及水管 5。盒底装 有营养液 6， 供离心泵 7 抽取并通过喷嘴 4 喷洒到寄主植物的根部。其中 ： 离心泵 7 是一个 单独的玻璃缸离心泵， 具。

15、有可调节的泵速控制器 ( 图中未示出 ) ； 喷嘴 4 与离心泵 7 相连， 用于向寄主植物喷洒气雾 ； 计时器与离心泵 7 相连， 用于控制喷洒气雾的时间间隔， 例如设 定为每 10 秒钟向所述寄主植物的根喷洒一次气雾。 0035 本发明中， 营养液 6 具有多种配比方案。该营养液 6 典型可为霍格兰氏营养液 (Hoagland s solution， HS)， 为了促进从枝菌根真菌和寄主植物间的共生关系的发展， 需 减少霍格兰氏营养液中可溶性磷的含量。营养液 6 可利用去离子水来制备， 因为其含有有 毒微量元素的可能性最低。在具体应用中， 一般可制备六份单独的常量营养素贮备液， 并 存放在。

16、 4条件下， 稀释到原始浓度的 30， 作为可施用的营养液。在使用前， 用 0.5 摩尔 (molar， 简作 m) 的氢氧化钠和 1.0m 的盐酸将营养液的 PH 值调整到 6.5， 因为低 PH 值将抑 制根的延展， 并导致枝叶坏死， 而高 PH 值导致植株难以将营养摄取， PH 值在 6.5 对大多数 植物都比较合适。 0036 在一个实施例中， 六份单独的常量营养素贮备液分别是 ： 磷酸二氢钾 (KH2PO4)、 硝酸钾 (KNO3)、 硝酸钙 (Ca(NO3)2)、 二胺四乙酸铁钠 (NaFeEDTA)、 氯化钠 (NaCl)、 硫酸 镁 (MgSO4)。而微量元素则包括硼酸 (H3。

17、BO3)、 四水氯化锰 (MnCl24H2O)、 七水硫酸锌 (ZnSO47H2O)、 五水硫酸铜 (CuSO45H2O)、 二水钼酸钠 (Na2MoO42H2O) 等， 其含量如下表 所示 ： 0037 说 明 书 CN 101608159 B 5 4/5 页 6 0038 应当说明的是， 上述示出的营养液 6 的成分及含量仅为其中一个典型实施例， 并 不用以限定本发明的保护范围。 0039 上述内容主要描述了本发明中气栽室的结构。 需要注意的是， 气栽室应定期维护， 才能充分保证培植的成功率。 具体包括 ： 气栽室内的植株残叶和昆虫等要清除， 并要把植株 的根剪切至可维持一周时间位于营养液。

18、上方2cm的位置 ； 每周要检查营养液的PH值是否需 要调整， 每两周更换一次新的营养液 (PH6.5) ； 如发现被海藻污染， 要对气栽室进行彻底清 洗， 可利用次氯酸 (HClO) 进行清洗。此外， 再次填充营养液之前， 先用去离子水进行冲洗。 0040 图2是本发明中将AMF接种到所选定的寄主植物中的示意图。 本发明中， AMF与寄 主植物的共生关系是特定的， 因此可选择以下几种寄主植物 ： 甜玉米、 苏丹草和红三叶草。 之所以选择这三种座位寄主植物， 是因为它们只需简单栽种， 就可获得很快的生长速度， 并 且具有广泛的根系统。 当然， 本发明还可选择其他的植物作为寄主植物， 上述示例并。

19、不用以 限定本发明的保护范围。 0041 接种是在一个圆形塑料袋中进行的， 如图 2 所示， 该圆形塑料袋的尺寸为 ： 直径 4cm， 高 22cm。在实际应用中， 可通过热密封器将标准的塑料袋裁剪而成。 0042 该塑料袋的3/4填充有蛭石8， 加入的AMF接种菌10与蛭石8的表层混合在一起， 产生了一个稀释后的接种菌均衡层。还有一部分蛭石位于上层， 该层厚度为 3-6mm， 将前述 选择的寄主植物的种子 9 轻轻播撒并覆盖在该上层蛭石的表面。塑料袋上的排水孔 11， 在 实际应用中， 可通过简易工具 ( 例如圆珠笔 ) 在底部打孔即可。 0043 图 3 是本发明中培养 AMF 接种菌的方。

20、法流程图， 具体过程如下 ： 0044 在执行本发明的所有步骤之前， 需要选择寄主植物。本发明中， AMF 与寄主植物的 共生关系是特定的， 因此可选择以下几种寄主植物 ： 甜玉米、 苏丹草和红三叶草。之所以选 择这三种座位寄主植物， 是因为它们只需简单栽种， 就可获得很快的生长速度， 并且具有广 泛的根系统。 当然， 本发明还可选择其他的植物作为寄主植物， 上述示例并不用以限定本发 明的保护范围。 0045 在步骤 S301 中， 在一个填充有蛭石的塑料袋中， 使加入的 AMF 接种菌 10 与蛭石 8 的表层混合， 构建一个稀释后的接种菌均衡层。 0046 在步骤S302中， 在上层蛭石8。

21、的表面播种寄主植物的种子9， 在寄主植物生长过程 中， 接种菌的菌丝在寄主植物根部皮层的细胞间和细胞内生长， 从而繁殖到寄主植物上。 0047 在步骤 S303 中， 30 天后， 将寄主植物移出并固定到气栽室中， 其根保持在气栽室 内。具体地， 植株可用聚酯纤维包扎， 并固定于盒盖 2 上的孔 1 中。 0048 在步骤 S304 中， 喷雾系统每隔一段时间 ( 例如每 10 秒钟 ) 向寄主植物的根喷洒 一次气雾， 进行培养， 为期 3 个月。 0049 在步骤 S305 中， 将培养好的植株取出。可对该植株进行各种观测实验， 例如， 将随 机抽样的根样本保存在 50的酒精中， 用 “氯唑。

22、黑 E” 染色以检查 AMF 的繁殖率， 用解剖显 微镜进行观察。当从气栽室对根进行采伐时， 整个植株被移出， 且用聚酯纤维将孔塞紧， 多 余的水分通过根排出， 然后置于一个干净的吸水毛巾上。 裁剪的根接种菌的制作是 ： 利用一 个已灭菌的剪刀， 将根剪切为 1cm 的小段。除了裁剪的接种菌外， 修剪的根接种菌也是接种 菌的另外一种可行的形式， 与裁剪的接种菌作为参照对比， 其具有提高繁殖体密度的优点。 修剪之后， 通过丝网， 用去离子水对泥浆进行过滤性的清洗。留存的片段， 置于室温中干净 说 明 书 CN 101608159 B 6 5/5 页 7 的吸水毛巾上风干三天。然后， 在执行其他试验前， 将其放入干净的塑料袋， 并存储于 4 摄 氏度的黑暗环境中。至此， 所有培养工序完成。 0050 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 101608159 B 7 1/3 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101608159 B 8 2/3 页 9 图 2 说 明 书 附 图 CN 101608159 B 9 3/3 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 101608159 B 10 。