技术领域
本发明涉及一种表位多肽及其应用，具体涉及一种结核分枝杆菌蛋白(Rv2629)特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)表位多肽及其应用，这些表位多肽能够引起结核病患者特异性细胞免疫应答，在结核病免疫诊断试剂及表位疫苗研发方面具有应用价值，属于分子生物学和免疫学领域。
背景技术
结核病是重要的公共卫生问题，是全世界范围内威胁人类健康的主要传染性疾病之一，具有发病率高和病死率高的特点。艾滋病的流行、排菌结核病患者的流动和部分人群生活贫困等原因使结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核分枝杆菌耐药、与人类免疫缺陷病毒共感染等问题使结核病治疗更是雪上加霜。结核诊断标志物的发现及新型结核病预防或治疗性疫苗的研发成为当前结核病控制的主要研究方向。
卡介苗(BCG)是目前唯一用于结核病预防的疫苗，但有研究表明，卡介苗仅对预防幼儿血行播散型结核、结核性脑膜炎等重症结核有意义，但对于成人肺结核及潜伏感染者无明显的保护作用，因此研究新型抗结核疫苗来取代或加强卡介苗的作用对于结核病的控制具有重要意义。
目前新型抗结核疫苗的类型主要有：活疫苗(如重组BCG)、亚单位疫苗(包括蛋白疫苗、表位疫苗、DNA疫苗等)、灭活疫苗等。与其他形式的抗结核疫苗相比，表位疫苗具有如下特点：①能够大规模合成纯度高、重复性好的多肽，成分单一、化学性质稳定，有利于获得特异的抗结核免疫；②去除天然抗原中的有害成分，包括致病相关肽段、自身交叉免疫反应原等；③可以对多肽的氨基酸残基组成进行理性设计，强化所需要的免疫应答，从而增强疫苗的功能和效应。
随着生物信息学的发展以及人们对抗原表位与MHC-Ⅰ类分子结合特性及MHC类抗原递呈途径认识的不断深入，涌现出许多预测表位的生物信息学手段。表位预测能极大的提高基于抗原表位的多肽疫苗设计的效率，增强实验的目的性，从而提高表位多肽疫苗研发的成功率。1998年结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M.tb)标准株H37Rv的全基因组测序工作的完成，为结核表位多肽疫苗的研究提供了极好的机遇。由此可见，首先通过生物信息学方法进行抗原表位预测，然后进一步应用生物化学、免疫学以及微生物学的方法加以验证，大大加快了寻找表位抗原的效率。
2012年6月27日公开的，专利申请号为CN201110362902.6，发明名称为“可用于结核分枝杆菌感染检测的表位多肽及其应用”的中国发明专利公开了几种结核分枝杆菌特异性抗原表位多肽，特别是抗原Rv3615c的抗原表位多肽，为8-11个连续的多肽片段，该抗原多肽虽然可以在结核患者中产生T细胞反应，但是这些多肽没有MHC分型，也没有进行CTL表位鉴定，在用做结核疫苗方面的特点并不明确，其亲和力、稳定性有待鉴定，体外免疫活性有待改进。
Rv2629蛋白是一种结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白，由Voskuil等利用基因芯片技术在缺氧条件所致的结核分枝杆菌潜伏感染模型中发现。Joakim等应用比较蛋白质组学分析方法也发现缺氧条件下的结核分枝杆菌荷兰株的Rv2629蛋白的表达量增加。Desta等在体外用多种结核分枝杆菌蛋白抗原刺激活动性结核患者全血，结果发现Rv2629蛋白能刺激活动性结核患者外周血淋巴细胞释放高浓度的γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)，具有良好的效应T细胞诱导能力，有望成为新型的候选疫苗及结核潜伏感染诊断标志物。
因此，提供一种具有较好的免疫原性，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的更有效的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂就成为该技术领域急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有较好的免疫原性，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的更有效的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的特异性CTL表位多肽。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种用于结核分枝杆菌检测的特异性CTL表位多肽，其氨基酸序列如SEQ NO.1，SEQ NO.4，SEQ NO.10，SEQ NO.12所示。
本发明的另一目的是提供一种上述表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
氨基酸序列如SEQ NO.1，SEQ NO.4，SEQ NO.10，SEQ NO.12所示特异性CTL表位多肽在制备结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒中的应用。
本发明的另一目的是提供一种含有上述表位多肽的结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种结核分枝杆菌特异性CTL检测试剂盒，其特征在于含有氨基酸序列如SEQ NO.1，SEQ NO.4，SEQ NO.10，SEQ NO.12所示特异性CTL表位多肽。
本发明的另一目的是提供一种上述表位多肽在制备新型结核病疫苗中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
所述的表位多肽在制备新型结核病疫苗中的应用。
本发明的另一目的是提供一种新型结核病疫苗。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种新型结核病疫苗，其特征在于含有氨基酸序列如SEQ NO.1，SEQ NO.4，SEQ NO.10和/或SEQ NO.12所示特异性CTL表位多肽。
有益效果：
本发明通过生物信息学软件的预测、HLA-A2限制性CTL表位的选择、部分表位多肽的改造、表位多肽的合成及活性比较、筛选，发明结核分枝杆菌蛋白Rv2629的4条9肽的HLA-A2限制性CTL表位Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315可作为结核病细胞免疫诱导剂，成为新型的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的候选表位，而目前尚无该种疫苗或检测试剂。
本发明人研究证明这4个多肽Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315是HLA-A2限制性CTL表位，与HLA-A2分子有较高的亲和力并具有较高的稳定性；诱导结核病患者PBMCs产生的IFN-γ水平显著高于正常对照组和结核潜伏感染组；刺激结核病组患者PBMCs生成分泌IFN-γ的CTL的能力也显著高于正常对照组、结核潜伏感染组；4个HLA-A2限制性表位多肽均能诱导产生对靶细胞具有杀伤活性的CTL，诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高；改造肽Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L刺激生成的CTL均能识别其母肽Rv2629-p190。
下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1-1为本发明候选表位诱导健康组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。
图1-2为本发明候选表位诱导潜伏感染者组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。
图1-3为本发明候选表位诱导结核感染者组人群CTL细胞分泌IFN-γ水平。
图2-1为本发明LDH法检测候选表位Rv2629-p190-2L诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。
图2-2为本发明LDH法检测候选表位Rv2629-p190-1Y2L诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。
图2-3为本发明LDH法检测候选表位Rv2629-p274诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。
图2-4为本发明LDH法检测候选表位Rv2629-p315诱导生成的CTL细胞的细胞毒性结果。
具体实施方式
实施例1：结核分枝杆菌特异性蛋白Rv2629的HLA-A2限制性CTL表位多肽的制备
一、利用生物信息学方法预测结核分枝杆菌特异性蛋白Rv2629的HLA-A2限制性CTL表位
结核分枝杆菌特异性蛋白Rv2629，其氨基酸组成如SEQ ID NO.13所示。
SEQ ID NO.13：
MRSERLRWLVAAEGPFASVYFDDSHDTLDAVERREATWRDVRKHLESRDAKQELIDSLEEAVRDSRPAVGQRGRALIATGEQVLVNEHLIGPPPATVIRLSDYPYVVPLIDLEMRRPTYVFAAVDHTGADVKLYQGATISSTKIDGVGYPVHKPVTAGWNGYGDFQHTTEEAIRMNCRAVADHLTRLVDAADPEVVFVSGEVRSRTDLLSTLPQRVAVRVSQLHAGPRKSALDEEEIWDLTSAEFTRRRYAEITNVAQQFEAEIGRGSGLAAQGLAEVCAALRDGDVDTLIVGELGEATVVTGKARTTVARDADMLSELGEPVDRVARADEALPFAAIAVGAALVRDDNRIAPLDGVGALLRYAATNRLGSHRS
1、SYFPEITHI超基序法远程预测CTL表位：
采用SYFPEITHI在线软件(Ver.1.0)预测由9个氨基酸残基组成的CTL表位；
具体方法：进入SYFPEITH I主页(http://www.syfpeithi.de/)，选择Epitope prediction进入CTL表位预测界面，选择HLA-A*0201进行预测，对分值≥20分的九肽作进一步分析；
2、BIMAS量化基序法预测CTL表位：
进入BIMAS主页(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，选定MHC类型HLA-A*0201，预测抗原肽长度(9)，输入氨基酸序列进行预测；
3、NetCTL预测CTL表位：
采用NetCTL在线软件(Ver.1.2)预测由9个氨基酸残基组成的CTL表位；
具体方法：进入NetCTL主页(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，选定supertype(A2、A3、B7supertype)，阈值(0.75)，输入氨基酸序列进行预测，选取COMB>0.75的九肽(SEQ NO.1-SEQ NO.9)；
4、综合分析SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL的预测结果，结果显示Rv2629蛋白在HLA-A2、HLA-A3和HLA-B7表型具有较多的CTL优势表位，通过分析表位预测结果和蛋白质二级结构，确定符合条件的12条候选表位多肽序列，其氨基酸序列SEQ NO.1-NO.12详细信息如表1所示，包括阳性对照SEQ NO.14(Rv1410c-p510-1Y9V)。
表1筛选获得的HLA-A2限制性CTL及阳性对照表位信息
表2候选HLA-A2限制性表位及阳性对照和阴性对照的亲和力检测结果
注：FI＞1.5高亲和力，1.0＜FI≤1.5中等亲和力，FI≤1.0低亲和力。
表3候选HLA-A2限制性表位及阳性对照和阴性对照的稳定性检测结果
注：DC50≥6h高稳定性，4h≤DC50＜6h中稳定性，DC50＜4h低稳定性。
表4候选表位及阳性对照和阴性对照诱导不同人群产生分泌IFN-γ的CTL细胞数量比较
表位 正常组 结核潜伏感染组 结核病组 阴性对照 3.40±1.95# 2.20±2.17 5.60±3.51▲
阳性对照 84.80±43.89# 75.80±48.46 314.40±179.15▲
Rv2629-P190-2L 8.40±6.58# 3.80±2.68 224.00±163.63▲
Rv2629-P190-1Y2L 11.00±3.32# 11.00±10.30 239.80±122.04▲
Rv2629-P315 0.80±0.84# 3.60±2.88 159.20±91.44▲
Rv2629-P274 1.80±1.30# 3.00±5.66 263.00±115.33▲
注：#P＞0.05，正常组VS.潜伏感染组；
▲P<0.01，结核组VS.正常组；
P<0.01，结核组VS.潜伏感染组。
二、表位多肽序列优化
在预测得到高分值野生型九肽后，我们用对Rv2629蛋白候选表位190-198位氨基酸残基(NO.9多肽)进行修饰改造，部分野生型九肽的特定位点进行氨基酸替换，包括第1位酪氨酸(Tyr)替换、第2位亮氨酸(Leu)替换和/或第9位缬氨酸(Val)替换，再次用三种软件进行预测，评分较修饰前明显升高，优化后的氨基酸序列SEQ NO.10-NO.12详细信息如表1所示。
三、表位多肽合成
候选表位多肽及阳性多肽委托杭州丹港生物科技有限公司用固相合成法合成，合成的多肽经高效液相色谱分析，纯度≥95％，低压冻干后保存于﹣80℃冰箱，使用前以DMSO及无菌蒸馏水溶解稀释。
四、表位多肽鉴定
1、候选HLA-A2限制性CTL表位多肽与T2细胞的亲和力鉴定
(1)收集T2细胞，用IMDM无血清培养基洗3次，调整细胞浓度至l×l06个/mL，1mL/孔，铺于24孔板中。实验组加入25μg/mL的候选多肽，同时设置已报道的结核分枝杆菌表位多肽Rv1410c-p150-1Y9V作为亲和力和稳定性实验的阳性对照，该表位多肽的详细信息如表1所示，PBS作为阴性对照，未加多肽刺激的T2细胞作为本底对照。以上各实验孔中加入3μg/mL的β2微球蛋白，于37℃、5％CO2培养箱中共孵育18个小时。
(2)收集孵育后的细胞，用冷PBS洗3次，加入2μL FITC标记的鼠抗人HLA-A2单克隆抗体，常温避光孵育30分钟。
(3)冷PBS洗3次，300μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测T2细胞表面的HLA-A2分子的平均荧光强度(MFI)。
结果用荧光系数(FI)表示：荧光系数(FI)＝(表位肽平均荧光强度-本底平均荧光强度)/本底平均荧光强度。FI≥1.5为候选肽与HLA-A2具有高亲合力；1.5＞FI≥1.0为中等亲合力；FI＜1.0为低亲合力。
T2细胞与12条候选表位多肽共孵育后，细胞表面HLA-A2分子的平均荧光强度均有不同程度的增高，其中，Rv2629-p332、Rv2629-p75、Rv2629-p190的FI值处于1.0-1.5之间，提示这3条候选表位多肽与HLA-A2分子具有中等的亲和性，其余4条候选多肽与HLA-A2分子的亲和力较低，FI值＜1.0。因此，选取亲和力较高的5条候选表位多肽Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315进行后续的稳定性试验。
结果如表2所示，其中Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274、Rv2629-p315的荧光系数(FI)大于1.5，提示这5条候选表位多肽与HLA-A2分子均有较高的亲和性。
2、候选表位多肽-MHC复合物稳定性分析
(1)收集T2细胞，用IMDM无血清培养基洗3次，调整细胞浓度至l×l06/mL，1mL/孔，铺于24孔板中。实验组加入25μg/mL的候选多肽，同时设置阳性对照，PBS作为阴性对照，未加多肽刺激的T2细胞作为本底对照。以上各实验孔中加入3μg/mL的β2微球蛋白，于37℃、5％CO2培养箱中共孵育18个小时。
(2)收集孵育后的细胞，用冷PBS洗3次以洗净未结合的多肽，加入10μg/mL BFA以阻断新合成的HLA-A2分子在T2细胞表面的表达。
(3)冷PBS洗3次，重新置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育。
(4)收集0、2、4、6小时的细胞，加入2μL FITC标记的鼠抗人HLA-A2单克隆抗体，常温避光孵育30分钟。
(5)冷PBS洗3次，300μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测T2细胞表面的HLA-A2分子的MFI。
结果用DC50(dissociation complex 50％)表示。DC50表示在t＝0时的荧光强度减弱到50％时所需的时间，即50％多肽-MHC复合物解离所需的时间。
与HLA-A2分子具有高亲和力的5条候选表位多肽进行后续的稳定性实验，结果如表3所示，根据实验结果，我们把预测的候选表位多肽分为下两组：(1)与HLA-A2分子高亲和力结合并形成稳定多肽-MHC复合物的多肽：Rv2629-P190-2L、Rv2629-P190-1Y2L、Rv2629-P315和Rv2629-P274；(2)与HLA-A2分子高亲和力结合但并不形成稳定多肽-MHC复合物的多肽：Rv2629-P190-1Y。
本发明人综合运用生物信息学软件预测了Rv2629蛋白的HLA-A2限制性CTL表位、选择部分表位多肽进行改造、人工合成表位多肽，应用流式细胞术对人工合成的表位多肽的亲和力和稳定性进行了鉴定，筛选出具有较高亲和力和稳定性的多肽4条，分别为Rv2629-P190-2L、Rv2629-P190-1Y2L、Rv2629-P315和Rv2629-P274，可作为结核病细胞免疫诱导剂，成为新型的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的候选表位。
实验例1：表位多肽的体外免疫活性检测
一、材料与方法
1、实验材料
1.1实验细胞系
T2细胞系由第三军医大学免疫教研室惠赠，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
1.2外周血标本
外周血标本由全军结核病研究所提供，分为正常对照组、LTBI组和结核病组，外周血的HLA表型分析由器官移植实验室用流式细胞仪检测所得，均为HLA-A2阳性。
1.3主要试剂
RPMI1640培养基：美国Gibco公司产品；
IMDM培养基：美国Gibco公司产品；
胎牛血清：美国Gibco公司产品；
谷氨酰胺：美国Sigma公司产品；
青霉素-链霉素：美国Gibco公司产品；
溶血素：美国BD公司产品；
人淋巴细胞分离液：瑞典GE公司产品；
吐温20(Tween 20)：美国AmResco公司产品；
ELISPOT方法检测人IFN-γ试剂盒：美国MABTECH公司产品；
ELISA方法检测人IFN-γ试剂盒：美国BD公司产品；
TMB底物试剂盒：美国BD公司产品；
BCIP/NBT底物液：美国MABTECH公司产品。
1.4主要仪器
二氧化碳恒温培养箱：型号：Thermo-3111，厂家：美国Thermo公司；
台式常温离心机：型号：Centrifuge 5418，厂家：美国Eppendorf公司；
台式高速冷冻离心机：型号：Centrifuge 5804R，厂家：美国Eppendorf公司；
生物洁净工作台：型号：THERMO-1285，厂家：美国Thermo公司；
电子天平：型号：TP-202，厂家：北京赛多利斯仪器系统有限公司；
倒置显微镜：型号：倒置37XC，厂家：上海永亨光学仪器制造有限公司；
酶标仪：型号：Multisk an Ascent，厂家：美国Thermo公司；
酶联免疫斑点图像自动分析仪：型号：S5.VerSa，厂家：美国CTL公司。
1.5主要试剂配制
1.5.1 T2细胞培养所需试剂配制
完全培养基：取44ml RPMI1640培养基，加入500μl 200mmol/L的谷氨酰胺、500μl双抗(青霉素-链霉素1:1000)、5ml胎牛血清，混匀。
1.5.2刺激人外周血生成CTL所需试剂配制
(1)培养基：取44ml RPMI1640培养基，加入500μl谷氨酰胺、500μl双抗(青霉素、链霉素1:1000)、5ml胎牛血清，混匀。
(2)重组人白介素-2(rhIL-2)：10μg重组人白介素-2冻干粉中加入100μl100mM的醋酸溶液，待其充分溶解，加入900μl含5％海藻糖的PBS缓冲液稀释成浓度为10μg/ml的储存液，分装20ul/管，﹣20℃保存，避免反复冻融，使用时用无菌PBS1∶10稀释储存液，终浓度为50U/ml。
2、实验方法
2.1细胞毒性T淋巴细胞体外诱导
(1)无菌抽取正常人、结核潜伏感染者、活动性结核病患者外周血4-5mL，加入含肝素钠抗凝采血管，上下颠倒5-6次，使抗凝剂与血液混匀。
(2)取混匀的4mL抗凝外周血缓缓加入到含4mL淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2500rpm离心20分钟。
(3)加入预热至37℃的RPMI1640培养液8ml，用滴管轻轻吹打混悬后，于室温2000rpm离心10分钟。
(4)弃去上清液，加入预热至37℃的RPMI1640培养液至6mL，重悬沉淀细胞，于室温1500rpm离心8分钟。
(5)弃去上清洗液，加入0.25mL预热至37℃的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，用滴管轻轻吹打混悬细胞。
(6)取10μL细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下计数，计数每mL悬液细胞数量，用预热至37℃的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞悬液至1×106细胞/mL，置于96孔板中培养，250μL/孔。
(7)设置PBS组、阳性对照组、实验组，第2天分别加入相对应的多肽25μg/mL，加入终浓度为50U/mL的重组人源IL-2(rhIL-2)，于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育。
(8)每次刺激后3天进行半量换液，收集培养上清同时补加rhIL-2。每7天进行一轮重复刺激，刺激过程：96孔板进行1000rpm离心5分钟，收集上清，加入新鲜的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，同时补加上述等量的相应多肽刺激物和rh IL-2。
(9)完成3轮刺激后，继续培养2-3天，收集细胞即作为效应CTL。
2.2ELISPOT法检测外周血刺激生成的CTL中分泌IFN-γ的T细胞数
(1)96孔滤膜板包被：
①用35％的乙醇15μL/孔湿润96孔膜板的膜底30s。
②用200μL无菌的去离子水洗板5次，1分钟/次。
③去离子水，稍稍控干孔内残留水分，每孔加入100μL IFN-γ单克隆捕获抗体(用PBS稀释为15μg/mL)，4℃冰箱过夜。
④弃去包被液，PBS洗板2次，1分钟/次，拍干。
⑤每孔加入200μL含2％BSA及1％海藻糖的PBS封闭液，置37℃封闭1小时。
⑥弃去封闭液，用RPMI1640培养液润洗一次，待用。
(2)细胞铺板：
①诱导的CTL作为效应细胞，T2细胞与25μg/mL的相应多肽在37℃共孵育4小时，作为刺激细胞，细胞浓度均调整为2×106/mL，实验孔和阳性对照孔每孔加50μL效应细胞和50μL刺激细胞；阴性对照孔每孔加50μL效应细胞和50μL等浓度的未刺激T2细胞。
②铺板完毕放于培养箱中，37℃、5％二氧化碳孵育18小时。
(3)免疫斑点检测
①将96孔滤膜板取出，弃培养上清，加入200uL预冷的冰水裂解细胞10分钟(-20℃放置5分钟，然后4℃放置5分钟)，用200μL 1×PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗板7次，1分钟/次，最后一次洗板后拍干。
②加IFN-γ检测抗体100μL/孔(用PBS 1:1000稀释为1μg/mL)，37℃孵育1小时，弃去液体，用200μL 1×PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗板5次，1分钟/次，最后一次洗板后拍干。
③加100μL(用PBS 1:1000稀释)37℃孵育30分钟，弃去液体，用200μL 1×PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗板5次，1分钟/次，最后一次洗板后拍干。
④每孔加入100μL BCIP/NBT底物液，放置于室温下避光显色7-15分钟至斑点生长至合适大小。
⑤可见板底出现蓝紫色斑点，用蒸馏水洗板3次中止反应，将板放入37℃培养箱中烘干。
⑥结果用CTL公司酶联斑点分析仪进行计数分析着色的斑点。
2.3ELISA法检测外周血刺激生成CTL过程中培养上清中IFN-γ的水平
(1)包被捕获抗体：用包被液将捕获抗体(Capture antibody)1：250稀释，每孔加100μL，包被96孔酶联板，置4℃过夜。
(2)弃包被液，用300μL/孔PBST洗板3次，最后一次洗板后拍干。
(3)每孔加200μL封闭液，室温封闭1小时。用PBST洗板3次，最后一次洗板后拍干。
(4)标本孔每孔加25μL培养上清，补充75μL封闭液至100μL；标准品孔分别加入浓度为600、300、150、75、37.5、18.8、9.4、0pg/mL的标准品100μL，每个浓度做2个平行孔，置于37℃孵育2h。用300μL/孔PBST洗板5次，最后一次洗板后拍干。
(5)用同一份稀释液(5％胎牛血清-PBS)1:250稀释生物素标记的抗人(Biotinylated Anti-human)IFN-γ，同时1:250稀释辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate)，每孔加100μL，室温孵育1小时。用300μL/孔PBST洗板7次，1分钟/次。最后一次洗板后拍干。
(6)配制底物液，混匀后立即每孔加100μl，室温避光显色30分钟。
(7)每孔加终止液(2mol/L H2SO4)50μL终止反应。
(8)在加入终止液后30分钟内用酶标仪读取波长为450nm处各孔吸光度值。
二、结果
1、ELISPOT法检测分泌IFN-γ的CTL细胞
从正常人、结核潜伏感染者和结核病患者外周血中分离得到PBMCs，进行CTL体外诱导培养17天后，用ELISPOT法来检测分泌IFN-γ的CTL的细胞数，以此来判断多肽诱导特异性CTL的能力。结果显示(表4：候选表位诱导不同人群产生分泌IFN-γ的CTL细胞数量比较)：候选表位多肽Rv2629-P190-2L、Rv2629-P190-1Y2L、Rv2629-P315和Rv2629-P274能刺激5名结核病患者的PBMCs生成特异性CTL并分泌大量的IFN-γ，诱导结核病患者组PBMCs生成的CTL数目显著高于正常对照组和结核潜伏感染者组，差异具有统计学意义，P值＜0.01。
2、ELISA方法检测CTL细胞分泌的IFN-γ水平
从正常人、结核潜伏感染者和结核病患者外周血中分离得到PBMCs，进行细胞毒性T淋巴细胞体外诱导培养，每次刺激后三天进行半量换液，同时留取培养上清，用ELISA方法来检测分泌IFN-γ的量，结果如图1-1至图1-3所示，随着刺激次数的增加，正常人、结核潜伏感染者和结核病患者的PBMCs培养上清中的IFN-γ分泌量均有不同程度的增加，但是在结核病患者组(图1-3)中IFN-γ分泌量和增加幅度明显高于其他两组(图1-1和图1-2)。
三、结论
Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315候选肽能够刺激结核病患者的PBMCs生成特异性CTL，不能刺激正常人和结核潜伏感染者生成特异性CTL。随着4个候选多肽刺激次数的增加，结核病患者组的IFN-γ分泌量逐渐增加并明显高于正常对照组和结核潜伏感染组。由此可见，Rv2629蛋白的4个候选表位多肽在结核病患者中具有较高的免疫原性。
实验例2：乳酸脱氢酶法(Lactate dehydrogenase，LDH)检测特异性CTL的细胞毒杀伤性实验
一、材料与方法
1、实验材料
1.1实验细胞系
T2细胞系由中国人民解放军第三军医大学免疫教研室惠赠，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养。
1.2外周血标本
外周血标本由全军结核病研究所提供，分为正常对照组、LTBI组和结核病组，外周血的HLA表型分析由器官移植实验室用流式细胞仪检测所得，均为HLA-A2阳性。
1.3主要试剂
RPMI1640培养基：美国Gibco公司产品；
IMDM培养基：美国Gibco公司产品；
胎牛血清：美国Gibco公司产品；
谷氨酰胺：美国Sigma公司产品；
青霉素-链霉素：美国Gibco公司产品；
溶血素：美国BD公司产品；
人淋巴细胞分离液：瑞典GE公司产品；
异硫氰酸荧光素标记的鼠抗人HLA-A2抗体(FITC Rat Anti-Humam IFN-γ)：美国BD公司产品；
LDH方法细胞毒性杀伤试剂盒：美国promega公司产品。
1.4主要仪器
二氧化碳恒温培养箱：型号：Thermo-3111，厂家：美国Thermo公司；
台式常温离心机：型号：Centrifuge 5418，厂家：美国Eppendorf公司；
台式高速冷冻离心机：型号：Centrifuge 5804R，厂家：美国Eppendorf公司；
生物洁净工作台：型号：THERMO-1285，厂家：美国Thermo公司；
电子天平：型号：TP-202，厂家：北京赛多利斯仪器系统有限公司；
酶标仪：型号：Multisk an Ascent，厂家：美国Thermo公司；
倒置显微镜：型号：倒置37XC，厂家：上海永亨光学仪器制造有限公司；
流式细胞仪：型号：FACSCalibur四色荧光分析仪，厂家：美国BD公司。
1.5主要试剂配制
1.5.1 T2细胞培养所需试剂配制
完全培养基：取44ml RPMI1640培养基，加入500μl 200mmol/L的谷氨酰胺、500μl双抗(青霉素-链霉素1:1000)、5ml胎牛血清，混匀。
1.5.2刺激人外周血生成CTL所需试剂配制
(1)培养基：取44ml RPMI1640培养基，加入500μl谷氨酰胺、500μl双抗(青霉素、链霉素1:1000)、5ml胎牛血清，混匀。
(2)重组人白介素-2(rhIL-2)：10μg重组人白介素-2冻干粉中加入100μl100mM的醋酸溶液，待其充分溶解，加入900μl含5％海藻糖的PBS缓冲液稀释成浓度为10μg/ml的储存液，分装20ul/管，﹣20℃保存，避免反复融冻，使用时用无菌PBS1∶10稀释储存液，终浓度为50U/ml。
2、方法
2.1细胞毒性T淋巴细胞体外诱导
(1)无菌抽取正常人、结核分枝杆菌潜伏感染者、活动性结核病患者外周血4-5mL，加入含肝素钠抗凝采血管，上下颠倒5-6次，使抗凝剂与血液混匀。
(2)取混匀的4mL抗凝外周血缓缓加入到含4mL淋巴细胞分层液的无菌离心管中，形成明显界面，在室温下2500rpm离心20分钟。
(3)加入预热至37℃的RPMI1640培养液8ml，用滴管轻轻吹打混悬后，于室温2000rpm离心10分钟。
(4)弃去上清液，加入预热至37℃的RPMI1640培养液至6mL，重悬沉淀细胞，于室温1500rpm离心8分钟。
(5)弃去上清洗液，加入0.25mL预热至37℃的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，用滴管轻轻吹打混悬细胞。
(6)取10μL细胞悬液加入血球计数板，在显微镜下计数，计数每mL悬液细胞数量，用预热至37℃的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基稀释细胞悬液至1×106细胞/mL，置于96孔板中培养，250μL/孔。
(7)设置PBS组、阳性对照组、实验组，第2天分别加入相对应的多肽25μg/mL，加入终浓度为50U/mL的重组人源IL-2(rhIL-2)，于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育。
(8)每次刺激后3天进行半量换液，收集培养上清同时补加rhIL-2。每7天进行一轮重复刺激，刺激过程：96孔板进行1000rpm离心5分钟，收集上清，加入新鲜的含10％胎牛血清的RPMI1640培养基，同时补加上述等量的相应多肽刺激物和rh IL-2。
(9)完成3轮刺激后，继续培养2-3天，收集细胞即作为效应CTL。
2.2靶细胞数目的优化
由于不同的靶细胞具有不同的乳酸脱氢酶含量，故必须进行靶细胞的最佳浓度的优化实验。
①收集生长状况良好的T2细胞，用含5％胎牛血清的RPMI1640培养基调整T2细胞浓度分别为1×104/mL、2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL，以没有加细胞的培养基作为背景对照，100μL/孔，铺于96孔板中，每组设置三个复孔。
②将上述96孔板置于-70℃30分钟，取出置于37℃培养箱中15分钟，以使细胞充分裂解。
③250g，离心4分钟。
④分别取上清50μL/孔转至新的96孔板中。
⑤向96孔板中加入底物液，50μL/孔，室温避光30分钟。
⑥加入50μL终止液，用注射器针头刺破较大的气泡。
⑦在酶标仪上检测492nm处的吸光度值。
确定靶细胞的浓度至少为空白对照组吸光值的2倍以上的浓度为最适靶细胞浓度。
2.3靶细胞的制备
将生长良好的T2细胞离心，用含5％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，调整细胞浓度为1×106/mL，铺于24孔板，2mL/孔，然后分别加入25μg/mL的阳性肽和各候选表位肽，阴性对照组加入等体积的PBS，置于37℃、5％二氧化碳孵育4小时后，离心洗涤后作为靶细胞。
2.4CTL细胞的特异性杀伤活性测定
①空载或荷肽的T2细胞作为靶细胞，用含5％胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为8×104/mL，每孔加入50μL，再加入50μL不同浓度的效应细胞，使实验组形成不同的效靶比(分别为100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1)。同时设置以下对照组：靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、效应细胞自发释放组、背景对照组、体积校正对照组，各对照组设4个复孔，每孔总体积100μL。
②将96孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。
③孵育结束前45分钟，加入10μL10×裂解液到靶细胞最大释放孔和体积校正孔中。
④培养结束后,离心培养板250g，4分钟。
⑤取出96孔板，每孔轻轻吸取50μL上清，置于另一新的96孔板对应的孔中。
⑥全部转移结束后，每孔迅速加入50μL乳酸脱氧酶底物混合液，室温避光孵育30分钟。
⑦孵育结束后,每孔添加50μL终止液
⑧30分钟内在酶标仪上读取490nm处的吸光度值，计算杀伤率。
杀伤率＝(实验组释放-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放)/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)×100％。
二、实验结果
实验结果如图2-1至图2-4所示，其中，图2-1为Rv2629-p190-2L诱导的CTL对靶细胞的最大杀伤率为53.91％用Rv2629-p190-2L诱导的CTL分别去识别荷载Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190的T2细胞，既能杀伤荷载母体肽的T2细胞，也能杀伤荷载改造肽的T2细胞；在上述两种效-靶细胞共孵育的体系中加入抗HLA-A2分子的单克隆抗体BB7.2，杀伤率明显降低。图2-2为Rv2629-p190-1Y2L诱导的CTL对靶细胞最大杀伤率为27.11％用Rv2629-p190-1Y2L诱导的CTL分别去识别荷载Rv2629-p190-1Y2L和Rv2629-p190的T2细胞，既能杀伤荷载母体肽的T2细胞，也能杀伤荷载改造肽的T2细胞；在上述两种效-靶细胞共孵育的体系中加入抗HLA-A2分子的单克隆抗体BB7.2，杀伤率明显降低。图2-3为Rv2629-p274诱导的CTL对靶细胞最大杀伤率为13.75％在效-靶细胞共孵育的体系中加入抗HLA-A2分子的单克隆抗体BB7.2，杀伤率明显降低。图2-4为Rv2629-p315诱导的CTL对靶细胞的最大杀伤率为23.91％在效-靶细胞共孵育的体系中加入抗HLA-A2分子的单克隆抗体BB7.2，杀伤率明显降低。
候选表位肽诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的提高而相应的提高，当效靶比为100∶1时，Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p315和Rv2629-p274诱导的CTL对靶细胞的杀伤率分别为53.91％、27.11％、23.91％和13.75％。由天然肽Rv2629-p190进行氨基酸替换而获得的改造肽Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L诱导产生的CTL既能杀伤荷载改造肽的T2细胞，也能杀伤荷载母体肽的T2细胞。
在效-靶细胞共孵育的体系中加入抗HLA-A2分子的单克隆抗体BB7.2，结果如图2-1至图2-4所示，杀伤率明显降低，甚至表现为负值，证明这4种候选表位多肽诱导产生的CTL的杀伤效果是HLA-A2限制性的。
三、结论
4个HLA-A2限制性表位多肽均能诱导产生对靶细胞具有杀伤活性的CTL，诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高；改造肽Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L刺激生成的CTL均能识别其母肽Rv2629-p190。
本发明应用生物信息学技术预测出Rv2629蛋白的HLA-A2限制性CTL表位，对这些CTL表位进行人工合成并进一步进行免疫学鉴定，发现这些CTL优势表位可以被结核患者特异性识别，具有较好的免疫原性，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的更有效的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂。
Rv2629编码一种假想蛋白，是结核分枝杆菌缺氧相关的潜伏期抗原。本发明综合运用生物信息学软件预测了Rv2629蛋白，显示该蛋白是一个T细胞表位占优势的抗原。
本发明选择HLA-A2限制性CTL表位、进行部分表位的改造以及表位肽的人工合成和鉴定，发现Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315与HLA-A2分子有较高的亲和力并具有较高的稳定性；体外免疫活性检测、鉴定这4个候选表位多肽显示，随着多肽刺激次数的增加，正常对照组、结核潜伏感染组和结核病组外周血单个核细胞(PBMCs)培养上清中的IFN-γ分泌量均有不同程度的增高，但结核病组IFN-γ分泌量和增加幅度显著高于其他两组；这4个候选表位多肽刺激结核病组患者PBMCs生成分泌IFN-γ的CTL的能力显著高于正常对照组、结核潜伏感染组(P＜0.01)；这4个候选表位多肽诱导产生的CTL的杀伤活性随着效靶比的增加而相应的提高，当效靶比为100∶1时，Rv2629-p190-2L诱导的CTL对靶细胞的杀伤性最高，杀伤率可达到53.91％，Rv2629-p190-1Y2L和Rv2629-p315诱导的CTL对靶细胞的杀伤效果相近，处于中等水平，杀伤率分别是27.11％和23.91％，而Rv2629-p274诱导的CTL对靶细胞也有一定的杀伤效果，但杀伤率相对较低，仅为13.75％；经过交叉刺激试验，Rv2629-p190-2L和Rv2629-p190-1Y2L均能识别其母肽Rv2629-p190，说明本发明改造的多肽刺激生成的CTL仍可识别其野生型抗原；在效-靶细胞反应体系中加入抗HLA-A2单抗，杀伤活性消失，说明这种特异性杀伤具有HLA-A2限制性，证明这4个候选表位多肽是HLA-A2限制性CTL表位。
本发明提供的4个9肽片段Rv2629-p190-2L、Rv2629-p190-1Y2L、Rv2629-p274和Rv2629-p315在结核病患者中具有较高免疫原性，可以被结核患者特异性识别，可诱导结核病患者特异性细胞免疫应答，可能成为新型的抗结核表位疫苗或免疫诊断试剂的候选表位。
本发明中：1、CTL细胞亚群在抗胞内寄生菌如结核分枝杆菌、病毒、某些真菌感染及抗肿瘤免疫中起着十分重要的作用。MHC-I类表位多肽可以与CTL细胞亚群特异性结合、识别从而诱导相应的CTL克隆产生免疫应答，发挥杀死结核分枝杆菌等胞内致病原的作用；2、肽段与MHC-I分子结合的亲和力和稳定性检测是CTL表位疫苗设计中至关重要的环节，也是基于表位开发疫苗的瓶颈问题。本发明专利申请中，设计的正是MHC-I类表位多肽，可以针对性地激活CTL细胞，从而发挥杀死结核分枝杆菌的作用，而且本发明对这些表位多肽的亲和力、稳定性及体外免疫活性进行了鉴定，结果表明：本发明的表位多肽具有较高的亲和力、稳定性及体外免疫活性，因而，本发明的多肽更能成为有效的、新型的结核疫苗。