《一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法.pdf（6页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610012778.3 (22)申请日 2016.01.05 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广东省昆虫研究所 地址 510260 广东省广州市海珠区新港西路 105 号 (72)发明人 龚世平 李伟业 滑溜帅 葛研 王付民 侯方晖 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 一种马来穿山甲线粒体 Cox3 基因序列的扩 增引物及鉴定方法 (57) 摘要 本发明公开了一种马来穿山甲线粒体 Cox3 基因序列的扩增引。
2、物及鉴定方法。所述的扩增 引 物 为 ： F ： 5 -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ； R ： 5 -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 。提取待测穿山甲的 基因组 DNA， 然后利用所述扩增引物， 以待测穿山 甲的基因组 DNA 作为模板， 进行 PCR 扩增， 如果扩 增不出来片段， 则待测穿山甲不是马来穿山甲， 如 果能够扩增出扩增片段， 将扩增片段进行测序， 如 果扩增片段的核苷酸序列与 SEQ ID NO.3 所示的 序列相同或者相似度达到 95以上， 则为马来穿 山甲， 否则则不是马来穿山甲。 本发明能鉴定是否 是马来穿山甲物种， 为马来穿山甲的保护遗传学。
3、、 进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 序列表2页 CN 105543365 A 2016.05.04 CN 105543365 A 1.一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物， 其特征在于， 所述的扩增引物为： F： 5 -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ； R： 5 -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 。 2.一种马来穿山甲的鉴定方法， 其特征在于， 提取待测穿山甲的基因组DNA， 然后利用 权利要求1所述的扩增引物， 以待测穿山甲的基因组DN。
4、A作为模板， 进行PCR扩增， 如果扩增 不出来片段， 则待测穿山甲不是马来穿山甲， 如果能够扩增出扩增片段， 将扩增片段进行测 序， 如果扩增片段的核苷酸序列与SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似度达到95以上， 则为马来穿山甲， 否则则不是马来穿山甲。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105543365 A 2 一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法 技术领域： 0001 本发明属于生物化学与分子生物领域， 具体涉及一种马来穿山甲线粒体Cox3基因 序列的扩增引物及鉴定方法。 背景技术： 0002 马来穿山甲(Manisjavanica)隶属于鳞甲目、 穿山甲科、 。
5、穿山甲属， 主要分布于泰 国、 马来西亚、 缅甸、 印尼、 新加坡等地， 生活在低海拔森林及次生林中。 马来穿山甲的鳞片 具有很高的药用价值， 近年来， 过渡猎捕导致马来穿山甲野生资源日益减少， 已被IUCN列为 极危动物。 为了保护野生资源， 恢复马来穿山甲野生种群数量， 研究其种群遗传结构和野生 群体遗传变异水平非常必要。 0003 分子标记是在DNA水平上对遗传多样性的直接反映， 具有数量多， 多态性好， 遗传 稳定等优势， 是研究遗传变异的理想方法。 其中， 线粒体基因是一个非常有效的遗传标记， 与核基因相比,线粒体基因具有母系遗传、 结构简单、 进化速率快等独特的遗传特性， 被广 泛。
6、应用于物种鉴定和群体遗传多样性等研究。 因此， 线粒体基因是进行马来穿山甲物种鉴 定、 群体结构和遗传变异研究的有效工具。 发明内容： 0004 本发明的目的是提供一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方 法， 利用该扩增引物， 按照本发明的鉴定方法能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体Cox3 基因， 用于鉴定是否是马来穿山甲物种， 为马来穿山甲的保护遗传学、 进化遗传学及其物种 的分子鉴定提供基础。 0005 本发明的马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物， 其特征在于， 所述的扩增 引物为： 0006 F： 5 -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ， 核苷酸序。
7、列如SEQIDNO.1所示； 0007 R： 5 -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 ， 核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。 0008 本发明的另外一个目的是提供马来穿山甲的鉴定方法， 其特征在于， 提取待测穿 山甲的基因组DNA， 然后利用上述扩增引物， 以待测穿山甲的基因组DNA作为模板， 进行PCR 扩增， 如果扩增不出来片段， 则待测穿山甲不是马来穿山甲， 如果能够扩增出扩增片段， 将 扩增片段进行测序， 如果扩增片段的核苷酸序列与SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似 度达到95以上， 则为马来穿山甲， 否则则不是马来穿山甲。 0009 按照本发明的鉴定方法能够特异性的扩。
8、增出马来穿山甲线粒体Cox3基因， 用于鉴 定是否是马来穿山甲物种， 为马来穿山甲的保护遗传学、 进化遗传学及其物种的分子鉴定 提供基础。 具体实施方式： 0010 以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 说明书 1/2 页 3 CN 105543365 A 3 0011 实施例1： 0012 (1)马来穿山甲基因组DNA的提取 0013 剪取马来穿山甲肌肉组织于2mL离心管中， 将组织剪碎， 加800 L消化缓冲液， 10 L 蛋白酶K(20mg/mL)， 混匀后于55消化过夜。 消化清透后， 加入800 L饱和酚， 轻轻颠倒混匀 20min， 10000g离心10min。
9、， 抽提上清。 加入400 L饱和酚， 400 L氯仿/异戊醇(24:1)， 轻轻颠 倒混匀20min， 10000g离心10min， 抽提上清。 加入800 L氯仿/异戊醇(24:1)， 轻轻颠倒混匀 20min， 10000g离心10min， 抽提上清。 加入1mL预冷的无水乙醇， 于-20冷冻2h， 12000g离心 15min， 弃上清。 加预冷的70乙醇， 小心洗涤DNA沉淀两次， 12000g离心5min， 弃上清。 晾干 乙醇， 加入50 L超纯水溶解沉淀， 置于-20保存备用， 得到马来穿山甲基因组DNA。 0014 (2)PCR扩增Cox3基因片段 0015 上游引物F： 5。
10、 -ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ； 0016 下游引物R： 5 -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 。 0017 PCR扩增体系为25 L， 包括约10ng步骤(1)获得的马来穿山甲基因组DNA， 2.5 L10 PCRbuffer， 0.2mMdNTP， 上下游引物各0.2 M， 0.5UTaq聚合酶(Takara)。 PCR扩增条件 为： 首先94预变性5min， 然后进行30个循环， 每个循环包括94变性30sec， 55退火 30sec， 72延伸1min， 最后72延伸7min。 用浓度为2的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物， 如 果扩增出的片段长度符合预期大。
11、小， 则该扩增片段为Cox3基因片段。 PCR产物纯化后直接进 行测序， 获得Cox3基因片段的序列信息， 马来穿山甲的Cox3基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。 0018 (3)利用Cox3基因片段的序列信息进行物种鉴定 0019 当需要对疑似马来穿山甲的穿山甲样品进行鉴定时。 0020 首 先 提 取 待 测 穿 山 甲 的 基 因 组 D N A ， 然 后 利 用 上 游 引 物 F ： 5 - ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3 ； 下游引物R： 5 -CGAATCCGAAGTGGTGGT-3 ， 以待测穿山甲的基 因组DNA作为模板， 进行PCR扩增， 并将扩增片段进行测序， 如果扩增片段的核苷酸序列与 SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似度达到95以上， 则为马来穿山甲， 否则则不是马来 穿山甲。 说明书 2/2 页 4 CN 105543365 A 4 0001 序列表 1/2 页 5 CN 105543365 A 5 0002 序列表 2/2 页 6 CN 105543365 A 6 。