技术领域
本发明涉及一种核酸扩增方法。
背景技术
近年来，因基因利用技术的发展，基因诊断、基因治疗等利用基因 的医疗受到瞩目，除此之外，在农业、畜牧业领域也已开发出多种将基 因用于鉴别品种、改良品种的方法。作为用于利用基因的技术，PCR(聚 合酶链式反应，PolymeraseChainReaction)法等核酸扩增技术正在广 泛普及。近年来，开发了能够在短时间内得到核酸扩增反应产物的PCR 装置(例如，专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-115208
发明内容
本发明的发明人等在使用了日本特开2012-115208中记载的PCR装 置的核酸扩增反应中，发现如果缩短热变性和退火/延伸时间，则有时 核酸扩增效率下降。于是，为了寻找其原因并解决问题，进行了深入研 究，结果发现通过在该PCR装置中使用人工核酸，能够有效地进行核 酸扩增。因此本发明的目的在于提供一种能够高效地核酸扩增的新的核 酸扩增方法。
本发明的一个实施方式是一种核酸扩增方法，包含如下工序：将核 酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩 增反应容器填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液相比比重小且 不与核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器的第2区域加热 到比上述第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的 工序，其中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于第2区域 的下方，第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方； 以及，将第2配置切换到第1配置的工序；并且，核酸扩增反应液含有 探针，探针含有人工核酸。探针与仅含有天然核酸的探针相比，可以与 模板核酸的结合力更大。人工核酸可以为LNA、3’-氨基-2’,4’-BNA、 2’,4’-BNACOC、2’,4’-BNANC、PNA、GNA或TNA。人工核酸可以是 LNA。探针可以是被标记过的探针。标记过的探针可以是进行了RI标 记、荧光标记或酶标记。
本发明的另一实施方式是一种核酸扩增反应装置，该核酸扩增反应 装置包含如下结构：安装部，可安装填充有核酸扩增反应液和与所述核 酸扩增反应液相比比重小且不与所述核酸扩增反应液混和的液体的核 酸扩增反应容器；第1加热部，将所述核酸扩增反应容器的第1区域加 热到第1温度；第2加热部，将所述核酸扩增反应容器的第2区域加热 到第2温度；以及，驱动机构，对第1配置和第2配置进行切换，所述 第1配置为所述第1区域在重力作用的方向位于所述第2区域的下方， 所述第2配置为所述第2区域在重力作用的方向位于所述第1区域的下 方；并且，核酸扩增反应液含有探针，探针含有人工核酸。
根据本发明，可提供一种能够有效地进行核酸扩增的新的核酸扩增 方法。
附图说明
图1是本发明的一个实施方式中使用的核酸扩增反应容器的截面 图。g表示重力方向。
图2是本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的立体图。 (A)表示关闭盖的状态，(B)表示打开盖的状态。
图3是本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装置的主体的 分解立体图。
图4是示意地表示本发明的一个实施方式中使用的升降式PCR装 置的主体的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。(A)表示第1配置， (B)表示第2配置。
图5是表示本发明的一个实施方式和比较例中的表示核酸扩增反应 产物量的荧光亮度测定值与热循环数的关系的图。
具体实施方式
本发明的目的、特征、优点及其构思根据本说明书的记载对本领域 技术人员而言是明确的，根据本说明书的记载，只要是本领域技术人员， 就能容易地再现本发明。以下记载的发明的实施方式和具体的实施例等 表示本发明优选的实施方式，是用于例示或说明而示出的，本发明不限 于这些。在本说明书中公开的本发明的意图和范围内，基于本说明书的 记载，可以进行各种改变和修饰，这对本领域技术人员而言是明确的。
(1)核酸扩增方法
本发明的核酸扩增方法的特征在于，包含如下工序：将核酸扩增反 应容器的第1区域加热到第1温度的工序，其中，上述核酸扩增反应容 器填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液相比比重小且不与上述 核酸扩增反应液混和的液体；将核酸扩增反应容器的第2区域加热到比 第1温度低的第2温度的工序；将第1配置切换到第2配置的工序，其 中，上述第1配置为第1区域在重力作用的方向位于上述第2区域的下 方，上述第2配置为第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下方； 以及，将第2配置切换到上述第1配置的工序；并且，核酸扩增反应液 含有探针，探针含有人工核酸。
核酸扩增反应液可含有核酸扩增反应用试剂和扩增对象的靶核酸。 作为靶核酸，例如，可举出由血液、尿、唾液、脑脊髓液、组织等被检 测物制备得到的DNA，或将由这些被检测物制备得到的RNA进行逆转 录的cDNA等。核酸扩增反应用试剂可含有用于扩增靶核酸的引物对、 缓冲液、聚合酶、dNTP、MgCl2和用于对靶核酸的扩增产物进行检测 的荧光标记等。DNA聚合酶没有特别限定，优选耐热性的酶、PCR用 酶，例如，Taq聚合酶、Tfi聚合酶、Tth聚合酶或者它们的改良型等大 量市售品，优选进行热启动的DNA聚合酶。dNTP、盐的浓度只要为对 于使用的酶而言适当的浓度即可，通常可以为如下浓度：使dNTP为 10～1000μM，优选100～500μM，使Mg2+为1～100mM，优选5～10mM， 使Cl-为1～2000mM，优选200～700mM，对总离子浓度没有特别限定， 可以为高于50mM的浓度，优选高于100mM的浓度，更优选高于 120mM的浓度，进一步优选高于150mM的浓度，进一步优选高于 200mM的浓度。上限优选500mM以下，更优选300mM以下，进一步 优选200mM以下。引物用寡聚核苷酸分别使用0.1～10μM，优选使用 0.1～1μM。
本发明中，核酸扩增反应液含有包含人工核酸的探针。本说明书中， 人工核酸是指可通过氢键能够与DNA、RNA的碱基键合的天然核酸分 子以外的核酸分子。本发明中使用的人工核酸的种类没有特别限定，但 特别优选与仅由天然核酸构成的探针相比，使探针与互补链的Tm值变 高、与模板核酸的结合力提高的人工核酸，优选使核酸的核糖环的2’ 位的氧原子与4’位的碳原子进行亚甲基交联的2’,4’-BNA(2′-O,4′-C- 甲醇交联核酸，2′-O,4′-C-methano-bridgednucleicacid，别名LNA(锁 核酸，LockedNucleicAcid))。以下示出LNA的化学式。
上述式中，碱基可举出T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)、G(鸟嘧啶)、 A(腺嘌呤)、U(尿嘧啶)、I(肌苷)等作为例子，没有特别限定。也 可以是用甲基化、乙酰化等修饰而得到的碱基。另外，也可以使用对 LNA进行修饰而得的LNA类似物，可例示3’氨基-2’,4’-BNA、 2’,4’-BNACOC、或2’,4’-BNANC等。或者使用PNA(核酸肽，Peptide NucleicAcid)、GNA(GlycolNucleicAcid)、或TNA(苏糖核酸，Threose NucleicAcid)、或对它们进行修饰的类似物。LNA类似物以及PNA、 GNA、TNA和它们的类似物也与LNA同样地不限定碱基。
探针所含有的人工核酸的数量没有特别限定，可根据靶核酸、探针 的排列等而任意设定。一个探针可以具有多种人工核酸。
含有人工核酸的探针优选为了检测靶核酸的扩增而进行了标记。标 记的种类没有特别限定，可以根据目的从TaqMan(注册商标)MGB 探针(AppliedBiosystems)等荧光标记、SYBRGreen(注册商标)等 嵌入剂、以32P为代表的放射性同位素(RI)等放射性物质标记、以生 物素、异羟基洋地黄毒甙元为代表的酶标记等可得到的标记中任意地选 择。含有人工核酸的探针的制造方法也没有特别限定，可用公知的方法 制造。
这里，Tm值是指双链的核酸的50％解离成单链的核酸的温度，即 解链温度(MeltingTemperature)。Tm值的计算方法没有特别限定， 通常可以单独使用或组合使用GC％法、最邻近碱基对法、或Wallace 法进行计算。
通过使用含有这样的人工核酸的探针，与使用仅含有天然核酸的探 针的情况相比，扩增的引发更快，在相同的循环数下可更多地得到核酸 扩增反应产物，还能够更多地得到最终产物。换言之，如果将变性温度、 退火温度、延伸温度设为一定值，则通过使用含有人工核酸的探针，与 使用了仅含有天然核酸的探针的情况相比，能够在更短时间内得到相同 量的扩增产物。
核酸扩增反应液还可以含有表面活性剂。表面活性剂没有特别限 定，可例示NP40、TritonX-100、Tween20等。表面活性剂的浓度没有 特别限定，优选不阻碍核酸扩增反应的浓度，可以为0.001％～0.1％以下， 优选为0.002％～0.02％，最优选为0.005％～0.01％。表面活性剂可以从 上述的酶的储液带入，也可以与上述的酶的储液相独立地将表面活性剂 溶液添加到核酸扩增反应液。
对于液体130，通过使用不与反应液140混和的物质，将反应液140 加入容器150时，反应液140与液体130相分离，因此在液体130中可 使反应液140形成为液滴状。这样，反应液140在液体130中能够以液 滴状保持。
液体130优选比重小于反应液140的液体。这种情况下，将反应液 140加入液体130时，由于反应液140的液滴比重大于液体130，所以 受重力作用向重力作用的方向移动。另外，液体130也可以为比重大于 反应液140的液体。这种情况下，由于反应液140的液滴比重小于液体 130，受重力作用朝向与重力作用的方向相反的方向移动。
液体130优选含有油，例如，可使用硅油或矿物油。这里，硅酮是 指作为主骨架具有硅氧烷键的低聚物或聚合物。本说明书中，将硅酮中 的在用于热循环处理的温度带中为液体状态的物质特别称为硅油。另 外，在本说明书中，将由石油精制且在用于热循环处理的温度带中为液 体的物质称为矿物油。这些油对热的稳定性高，例如还易于得到粘度为 5×103Nsm-2以下的制品，因此适用于升降型的PCR。
作为硅油，可例示ShinetsuSilicone公司制的KF-96L-0.65cs、 KF-96L-1cs、KF-96L-2cs、KF-96L-5cs、DowCorningToray公司制的 SH200CFLUID5CS、或者MomentivePerformanceMaterialsJapan 合同会社制的TSF451-5A、TSF451-10等二甲基硅油。作为矿物油，可 例示含有碳原子数14～20左右的烷烃作为主成分。即，例示出正十四烷、 正十五烷、正十六烷、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正二十四烷。
液体130可以含有添加剂。作为添加剂，例如，可使用X-22-160AS、 X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、KF-6017、KF-8005 (以上，ShinetsuSilicone公司)等改性硅油，SR1000、SS4230、SS4267、 YR3370(以上，Momentiv公司)等硅酮树脂，XS66-C1191(Momentive 社)等氟改性硅酮树脂等，除此之外，TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、 XF42-C5197(以上，Momentive公司)等改性硅油。添加剂的浓度没 有特别限定，可考虑容器的结构、材质、形状等来决定。例如，优选为 1％(v/v)～50％(v/v)，更优选为2％(v/v)～20％(v/v)，进一步优 选为5％(v/v)。
以下，作为本发明的核酸扩增方法的一个实施方式，对基于往返 PCR(2个梯度温度PCR)的核酸扩增方法进行说明。往返PCR是通 过对反应液实施反复进行高温和低温的2个梯度的温度处理从而扩增反 应液中的核酸的方法。在高温处理中发生双链DNA的解离，在低温处 理中发生退火(引物与单链DNA结合的反应)和延伸反应(以引物为 起点合成DNA的互补链的反应)。
本发明的方法中，使用填充有核酸扩增反应液和与核酸扩增反应液 相比比重小且不与上述核酸扩增反应液混和的液体的核酸扩增反应容 器将核酸扩增反应容器的第1区域加热到第1温度，将核酸扩增反应容 器的第2区域加热到比第1温度更低的第2温度。这里，从第1区域到 第2区域形成温度变低的温度梯度。将第1温度设为适于双链DNA的 解离的温度，将第2温度设为适于退火和延伸反应的温度，将第1区域 在重力作用的方向位于上述第2区域的下方的第1配置保持一定时间进 行双链DNA的解离，将第2区域在重力作用的方向位于第1区域的下 方的第2配置保持一定时间进行退火和延伸反应。通过将该第1和第2 配置切换一定次数来扩增核酸。因为核酸扩增反应液和液体的比重不 同，所以核酸扩增反应液在第1配置中位于第1区域，在第2配置中位 于第2区域。
通常，往返PCR中的高温为80℃～100℃之间的温度，低温为50℃ ～70℃之间的温度。一般在各温度下的处理进行规定时间，保持高温的 时间比保持低温的时间短。例如，可以设为高温为1秒～10秒左右，低 温为10秒～60秒左右，也可以根据反应条件而设为与比上述时间更长的 时间，但优选保持低温的时间短的情况，可以为18秒以下，优选为12 秒以下，更优选为6秒以下。
此外，适当的时间、温度和循环数(反复高温和低温的次数)根据 使用的试剂的种类和用量而不同，所以优选在考虑试剂的种类、核酸扩 增反应液的量而决定适当的方案的基础上进行反应。
另外，在本实施方式中，作为核酸扩增方法，可以使用在两种温度 下进行核酸扩增反应的往返PCR进行说明，也可以使用在热变性、退 火和延伸反应中改变温度的PCR法(3个梯度温度PCR)。此时，除退 火温度以外设定延伸反应温度，之后以规定时间维持于延伸反应温度即 可。
(2)核酸反应扩增容器
作为本发明的一个实施方式，以下对本发明的方法中使用的核酸扩 增反应容器进行说明。本发明的方法中使用的核酸扩增反应容器含有核 酸扩增反应液和与核酸扩增反应液比重不同且不与核酸扩增反应液混 和的液体，具有封闭的容器，核酸扩增反应液为液滴状且液体含有油和 添加剂。
图1是核酸扩增反应容器100的截面图。图1表示在核酸扩增反应 容器中装入了反应液的状态。
本发明中使用的核酸扩增反应容器100包含容器150和密封部120 而构成。核酸扩增反应容器100的大小、形状没有特别限定，例如，可 以考虑不与核酸扩增反应液140(以下均称为反应液140)混和的液体 130的量、热导系数、容器150和密封部120的形状、或操作的容易程 度中的至少一个而设计得到。液体130和核酸扩增反应液140可选自 “(1)核酸扩增方法”中记载的物质。
核酸扩增反应容器100的容器150可以由透明的材质形成。因此， 可以从核酸扩增反应容器100的外部对容器150内的反应液140的移动 进行观察，或者可以用于实时PCR等的从容器150的外部进行测定等 的用途。应予说明，本说明书中称为“透明”的情况是指能够确保从容 器150的外部对容器150内的反应液140进行观察的程度的可视性，只 要满足该条件，可以不必使核酸扩增反应容器100的整体为透明。
核酸扩增反应容器100的用途没有特别限定，例如用于实时PCR 这样的伴有荧光测定的用途时，容器150优选由自发荧光小的材质形成。 容器150优选为可耐受PCR中的加热的材质。而且，容器150的材质 优选为核酸、蛋白质的吸附少且不阻碍基于聚合酶等的酶反应的材质。 作为满足这些条件的材质没有特别限定，例如，可以为聚丙烯、聚乙烯、 环烯烃聚合物(例如，ZEONEX(注册商标)480R)、耐热玻璃(例如 PYREX(注册商标)玻璃)等、这些复合材料，优选聚丙烯。
在图1所示的核酸扩增反应容器100中，容器150形成为圆筒状， 中心轴向(图1中的上下方向)为长边方向。这里使用的容器150优选 为管，也可以为小型离心用管、用于PCR而设计得到的管，但通过具 有长边方向，即为细长的形状，例如，使用后述的升降型的加热循环器， 在容器150内的液体130中以形成温度不同的区域的方式对核酸扩增反 应容器100进行温度控制时，容易拉长不同温度区域之间的距离。由此， 易于对应容器150内的每个区域将液体130控制为不同的温度，所以能 够实现适于PCR的热循环。应予说明，升降型的加热循环器是指通过 在充满容器150的液体中形成至少2个温度区域，使与液体相分离的反 应液140在这些温度区域间往返移动而实现热循环的装置。
容器150的形状只要具有长边方向，就没有特别限定，用于升降型 PCR装置时，在大致圆筒形状中内径D与长边方向的长度L之比优选 为1:5～1.5:20的范围。而且，内径D更优选为1.5～2mm，长度L更优 选为10～20mm。
容器150具有开口部和密封开口部的密封部120，容器150中含有 反应液140和与反应液140比重不同且相分离的液体130。通过密封部 120密封开口部时，优选在容器150内不残留空气。因为如果在容器150 内残留气泡，则妨碍反应液140的移动。密封部120可由与容器150相 同的材质形成。密封部120的结构只要是能够密封容器150的结构即可， 例如，可以为螺旋帽、栓、嵌入等结构。在图1中，密封部120为螺旋 帽的结构。
(3)核酸扩增反应装置的装置构成
在本实施方式中，作为进行核酸扩增反应的核酸扩增反应容器，使 用管型的核酸扩增反应用管100。以下，将PCR作为核酸扩增反应的一 个例子，对适于核酸扩增反应用管100的升降式核酸扩增反应装置(以 下，均称为升降式PCR装置)的一个例子进行详细说明。应予说明， 对于升降式PCR装置，在日本特开2012-115208中进行了详细公开。
图2表示升降式PCR装置1的一个例子。图2(A)表示关闭升降 式PCR装置1的盖50的状态，图2(B)表示打开升降式PCR装置1 的盖50的状态，即表示在安装部11安装有核酸扩增反应用管100的状 态。图3是实施方式所涉及的升降式PCR装置1中的主体10的分解立 体图。图4是示意地表示实施方式所涉及的升降式PCR装置1中的主 体10的沿图2(A)的A-A线的截面的截面图。
如图2(A)所示，该升降式PCR装置1包含主体10和驱动机构 20。如图3所示，主体10包含安装部11、第1加热部12和第2加热部 13。在第1加热部12与第2加热部13之间设有隔离件14。在本实施方 式的主体10中，第1加热部12配置于底板17的一侧，第2加热部13 配置于盖50的一侧。在本实施方式的主体10中，第1加热部12、第2 加热部13和隔离件14被固定于凸缘16、底板17和固定板19。
安装部11为安装后述的核酸扩增反应用管100的结构。如图2(B) 和图3所示，本实施方式的安装部11是核酸扩增反应用管100以插入 方式安装的插口结构，成为核酸扩增反应用管100插入贯通第1加热部 12的第1加热块12b、隔离件14和第2加热部13的第2加热块13b的 孔的结构。安装部11的数量可以为多个，在图2(B)的例子中，在主 体10中设有20个安装部11。
该升降式PCR装置1包含将核酸扩增反应用管100相对于第1加 热部12和第2加热部13保持在规定的位置的结构。更具体而言，如图 4所示，可以将构成后述的核酸扩增反应用管100的流路110的第1区 域111通过第1加热部12进行加热，可以将构成后述的核酸扩增反应 用管100的流路110的第2区域112通过第2加热部13进行加热。本 实施方式中，决定核酸扩增反应用管100的位置的结构为底板17，如图 4(A)所示，通过将核酸扩增反应用管100插入直到与底板17接触的 位置，从而能够相对于第1加热部12和第2加热部13将核酸扩增反应 用管100保持在规定的位置。
第1加热部12在安装部11安装核酸扩增反应用管100时，将后述 的核酸扩增反应用管100的第1区域111的温度加热到第1温度。在图 4(A)所示的例子中，第1加热部12配置于主体10中，对核酸扩增反 应用管100的第1区域111进行加热的位置。
第1加热部12也可以包括产生热的机构和将产生的热传递给核酸 扩增反应用管100的部件。在图3所示的例子中，第1加热部12包括 第1加热器12a和第1加热块12b。在本实施方式中，第1加热器12a 为筒式加热器(Cartridgeheater)，通过导线15与未图示的外部电源连 接。第1加热器12a插入第1加热块12b，第1加热器12a发热，从而 对第1加热块12b进行加热。第1加热块12b为将从第1加热器12a产 生的热传递给核酸扩增反应用管100的部件。在本实施方式中为铝制的 块。
在安装部11安装核酸扩增反应用管100时，第2加热部13将核酸 扩增反应用管100的第2区域112加热到与第1温度不同的第2温度。 在图4(A)所示的例子中，第2加热部13配置于主体10中的对核酸 扩增反应用管100的第2区域112进行加热的位置。如图3所示，第2 加热部13包括第2加热器13a和第2加热块13b。第2加热部13加热 的核酸扩增反应用管100的区域和加热的温度与第1加热部12不同， 除此之外，与第1加热部12相同。
在本实施方式中，第1加热部12和第2加热部13的温度由未图示 的温度传感器和后述的控制部控制。优选第1加热部12和第2加热部 13的温度设定为以使核酸扩增反应用管100加热到所希望的温度。在本 实施方式中，通过将第1加热部12控制为第1温度，将第2加热部13 控制为第2温度，从而能够将核酸扩增反应用管100的第1区域111加 热到第1温度，将核酸扩增反应用管100的第2区域112加热到第2温 度。本实施方式中的温度传感器为热电偶。
驱动机构20为对安装部11、第1加热部12和第2加热部13进行 控制的机构，由此对第1区域和第2区域的配置进行控制。在本实施方 式中，驱动机构20包含未图示的马达和驱动轴，并且驱动轴和主体10 的凸缘16连接。本实施方式中的驱动轴相对于安装部11的长边方向垂 直地设置，若使马达动作，则主体10以驱动轴为旋转轴旋转。
本实施方式的升降式PCR装置1包含未图示的控制部。控制部对 后述的第1温度、第2温度、第1时间、第2时间和热循环的循环次数 中的至少一项进行控制。在控制部控制第1时间或第2时间的情况下， 通过控制部控制驱动机构20的动作，对将安装部11、第1加热部12 和第2加热部13保持为规定的配置的时间进行控制。即使针对控制的 每个项目设置不同的机构，控制部也可以对整个项目一并进行控制，本 实施方式的升降式PCR装置1中的控制部为电子控制，全面控制上述 项目。本实施方式的控制部包含未图示的CPU等处理器和ROM(只读 存储器，ReadOnlyMemory)、RAM(随机存储器，RandomAccess Memory)等存储装置。在存储装置中存储用于控制上述各项目的各种 程序、数据等。另外，存储装置具有将各种处理的处理中数据、处理结 果等暂时存储的工作区域。
如图3和图4(A)的例子所示，本实施方式的主体10在第1加热 部12和第2加热部13之间设有隔离件14。本实施方式的隔离件14为 保持第1加热部12或第2加热部13的部件。在本实施方式中，隔离件 14为隔热材料，在图4(A)的例子中，安装部11贯通隔离件14。
本实施方式的主体10包含固定板19。固定板19为保持安装部11、 第1加热部12和第2加热部13的部件。在图2(B)和图3所示的例 子中，将2张固定板19嵌合于凸缘16，从而固定第1加热部12、第2 加热部13和底板17。
本实施方式的升降式PCR装置1包含盖50。在图2(A)和图4(A) 的例子中，安装部11被盖50覆盖。盖50可以通过固定部51固定于主 体10。在本实施方式中，固定部51为磁铁。如图2(B)和图3的例子 所示，在主体10与盖50接触的面上设有磁铁。虽未在图2(B)和图3 中示出，但在盖50的主体10的磁铁接触的位置也设有磁铁，如果用盖 50覆盖安装部11，因磁力盖50将固定在主体10上。
应予说明，优选固定板19、底板17、盖50和凸缘16使用隔热材 料而形成。
(4)使用升降式PCR装置的热循环处理
图4(A)和图4(B)是示意地表示升降式PCR装置1的沿图2(A) 的A-A线的截面的截面图。图4(A)和图4(B)表示在升降式PCR 装置1中安装有核酸扩增反应用管100的状态。图4(A)表示第1配 置，图4(B)表示第2配置。以下，作为本发明的核酸扩增方法的一 个实施方式，对使用了使用核酸扩增反应用管100的情况下的实施方式 所涉及的升降式PCR装置1的热循环处理进行说明。
如图1的例子所示，实施方式中涉及的核酸扩增反应用管100包括 流路110和密封部120。在流路110中填充有反应液140和比重比反应 液140小且不与反应液140混和的液体130，并被密封部120密封。
流路110以反应液140与对置的内壁接近而进行移动的方式形成。 在此，流路110的“对置的内壁”是指流路110的壁面的位于相对的位 置关系的2个区域。“接近”是指反应液140与流路110的壁面的距离 近，且包含反应液140接触流路110的壁面的情况。因此，“反应液140 接近对置的内壁进行移动”是指“反应液140在相对于流路110的壁面 的位于相对的位置的2个区域的两方以距离近的状态移动”，即，反应 液140沿对置的内壁进行移动。
在图1的例子中，核酸扩增反应用管100的外形为圆柱状，在中心 轴方向(图1中的上下方向)形成流路110。就流路110的形状而言， 与流路110的长边方向垂直的方向的截面、即流路110的某区域中的与 反应液140移动的方向垂直的截面(以此作为流路110的“截面”)为 圆形的筒状。因此，在本实施方式的核酸扩增反应用管100中，流路110 的对置的内壁是包含构成流路110的截面的直径的流路110的壁面上的 2点的区域，反应液140沿对置的内壁在流路110的长边方向移动。
核酸扩增反应用管100的第1区域111为通过第1加热部12加热到 第1温度的流路110的部分区域。第2区域112为通过第2加热部13 加热到第2温度的与第1区域111不同的流路110的部分区域。在本实 施方式的核酸扩增反应用管100中，第1区域111为包含流路110的长 边方向的一个端部的区域，第2区域112为包含流路110的长边方向的 另一端部的区域。在图4(A)和图4(B)所示的例子中，包含流路110 的密封部120侧的端部的、由虚线围起的区域为第2区域112，包含远 离密封部120的一侧的端部的、由虚线围起的区域为第1区域111。
如图1所示，流路110包含液体130和反应液的液滴140。液体130 和反应液140根据(1)核酸扩增方法的记载进行准备。
以下，参照图4(A)和图4(B)对使用实施方式中涉及的升降式 PCR装置1的热循环处理进行说明。在图4(A)和图4(B)中，箭头 g的方向(图中的下方向)为重力作用的方向。本实施方式中，对作为 热循环处理的例子进行“(1)核酸扩增方法”中说明过的往返PCR(2 个梯度温度PCR)的情况进行说明。应予说明，以下说明的各工序表 示热循环处理的一个例子。也可以根据需要变更工序的顺序或将2个以 上的工序连续或并行地进行或者追加工序。
首先，将核酸扩增反应用管100安装于安装部11。在本实施方式中， 向填充有液体130的流路110导入反应液140后，将被密封部120密封 的核酸扩增反应用管100安装于安装部11。反应液140的导入可以利用 微量移液管、喷墨方式的分注装置等进行。在将核酸扩增反应用管100 安装于安装部11的状态下，第1加热部12在包含第1区域111的位置 与核酸扩增反应用管100接触，第2加热部13在包含第2区域112的 位置与核酸扩增反应用管100接触。
在此，安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置为第1配 置。如图4(A)所示，第1配置是核酸扩增反应用管100的第1区域 111位于重力作用的方向的流路110的最下部。在第1配置中，因为第 1区域111位于重力作用的方向的流路110的最下部，所以比重比液体 130大的反应液140位于第1区域111。在本实施方式中，将核酸扩增 反应用管100安装于安装部111后，用盖50覆盖安装部11，使升降式 PCR装置1开始工作。
接下来，通过第1加热部12和第2加热部13对核酸扩增反应用管 100进行加热。第1加热部12和第2加热部13将核酸扩增反应用管100 的不同区域加热到不同温度。即，第1加热部12将第1区域111加热 到第1温度，第2加热部13将第2区域112加热到第2温度。由此， 在流路110的第1区域111和第2区域112之间形成温度在第1温度和 第2温度之间逐渐变化的温度梯度。这里，从第1区域111到第2区域 112形成温度变低的温度梯度。因为本实施方式的热循环处理为往返 PCR，所以第1温度设为适于双链DNA解离的温度，第2温度设为适 于退火和延伸反应的温度。
因为安装部11、第1加热部12和第2加热部13的配置为第1配置， 所以对核酸扩增反应用管100进行加热时，反应液140被加热至第1温 度。经过第1时间后，通过驱动机构20来驱动主体10，可将安装部11、 第1加热部12和第2加热部13的配置从第1配置切换到第2配置。第 2配置是使第2区域112在重力作用的方向位于流路110的最下部的配 置。换言之，在安装部11、第1加热部12和第2加热部13成为与第1 配置不同的规定的配置时，第2区域112是位于重力作用的方向的流路 110的最下部的区域。本实施方式的升降式PCR装置1中，驱动机构 20通过控制部控制驱动主体10旋转。若将驱动轴作为旋转轴并利用马 达驱动凸缘16旋转，则固定于凸缘16的安装部11、第1加热部12和 第2加热部13能够旋转。因为驱动轴为相对于安装部11的长边方向垂 直的方向的轴，所以若通过马达的动作使驱动轴旋转，则安装部11、第 1加热部12和第2加热部13能够旋转。在图4(A)和图4(B)所示 的例子中，使主体10旋转180°。由此，能够将安装部11、第1加热部 12和第2加热部13的配置从第1配置向第2配置切换。
在此，因为第1区域111和第2区域112在重力作用的方向的位置 关系变为与第1配置相反，所以反应液140通过重力作用从第1区域111 向第2区域112移动。在安装部11、第1加热部12和第2加热部13的 配置到达第2配置时，若驱动机构20的动作停止，则安装部11、第1 加热部12和第2加热部13的配置被保持在第2配置。在第2配置中， 经过第2时间后，再度旋转，直到到达规定的次数为止，通过这样边更 换第1位置和第2位置边进行旋转，从而进行核酸扩增反应。将对第1 位置和第2位置进行一次更换作为1个循环。
另外，在本实施方式中，作为PCR法使用往返PCR，如“(1)核 酸扩增方法”中所述，也可以使用在热变性、退火和延伸反应中改变温 度的PCR法(3个梯度温度PCR)。此时，除退火温度以外设定延伸反 应温度，使核酸扩增反应液维持于退火温度，之后以规定时间维持于延 伸反应温度即可。
[实施例]
以下，通过实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明不限定 于实施例。
使用上述的升降式PCR装置，使用含有人工核酸的探针作为实施 例，使用仅含有天然核酸的探针作为比较例，以肺炎支原体的质粒 DNA25拷贝为模板，进行核酸扩增反应。本实施例中，使用荧光标记 过的探针，人工核酸使用2’,4’-BNA(2′-O,4′-C-甲醇交联核酸， 2′-O,4′-C-methano-bridgednucleicacid，别名LNA(锁核酸，Locked NucleicAcid))。
反应液的组成、引物序列、实施例和比较例的探针的序列以及核酸 扩增反应条件如下。应予说明，下述记载的各成分的液量表示全部反应 液量10μL中的液量。
(反应液组成)
※5xbuffer的组成:MgCl2:25mM、Tris-HCl(PH9.0):250mM、 KCl:125mM
(引物序列)
正向引物：5’ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC3’(序列编号 1)
反向引物：5’CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC3’(序列编号 2)
(探针序列)
通常荧光探针(仅含有天然核酸的探针，比较例)
5’FAM-CGGGACGGAAAGACC-BHQ13’(序列编号3)
导入人工核酸的荧光标记探针(含有人工核酸的探针，实施例)
5’FAM-CGGGACGGAAAGACC-BHQ13’(序列编号4)
※下线部表示其核酸为人工核酸LNA
(核酸扩增反应条件)
热启动：98℃，10秒
(以上，1个循环)
热变性：98℃，4秒
退火和延伸：54℃，6秒
(以上，50个循环)
将结果示于图5。横轴表示循环数。纵轴表示荧光亮度测定值，荧 光亮度测定值表示核酸扩增反应产物的量。
由图5可知，使用了含有人工核酸的探针的情况，与使用了仅含有 天然核酸的的探针的情况相比，扩增的上幅更快，针对相同循环数，能 够更多地得到核酸扩增反应产物，也能够更多地得到最终产物。而且， 为了合成相同量的产物，使用了含有人工核酸的探针的情况与使用了仅 含有天然核酸的探针的情况相比能够以更少的循环数实现。
符号说明
1…升降式PCR装置，10…主体，11…安装部，12…第1加热部， 12a…第1加热器，12b…第1加热块，13…第2加热部，13a…第2加 热器，13b…第2加热块，14…隔离件，15…导线，16…凸缘，17…底 板，19…固定板，20…驱动机构，50…盖，51…固定部，100…核酸扩 增反应容器或核酸扩增反应用管，110…流路，111…第1区域，112…第 2区域，120…密封部，130…液体，140…核酸扩增反应液，150…容器。