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利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法.pdf

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文档编号：8792667

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610075027.6 (22)申请日 2016.02.02 C12N 5/077(2010.01) C12N 5/0775(2010.01) (71)申请人中国科学院广州生物医药与健康研究院地址 510530 广东省广州市萝岗区开源大道 190 号 (72)发明人米格尔埃斯特班米奇托托雷拉王东业陈树翰秦宝明 (74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 代理人华辉 (54) 发明名称利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法 (57) 摘要本发明提供了一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软。

2、骨组织的方法，包括如下步骤： (1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经 b) 转分化生成间充质干细胞； (2) 在软骨诱导分化培养基中培养 (1) 获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。本发明体外构建软骨组织，可以用于代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，为软骨组织的体外构建提供了一种有效的方法，具有巨大的应用价值。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图3页 CN 105624102 A 2016.06.01 CN 1。

3、05624102 A 1.一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法，包括如下步骤： (1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经 b)转分化生成间充质干细胞； (2)在软骨诱导分化培养基中培养(1)获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述a)中将人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为： 1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞； 2)重编程产生iPS细胞克隆； 3)挑取单克隆，继续培养获得诱导多能干细胞。 3.根据权利要求1所述的方法，。

4、其特征在于，所述a)中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞的方法为： 1)在微孔板中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞分化形成类胚体； 2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞； 3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子bFGF， EGF和PDGF的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述b)将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为： 1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞； 2)诱导产生前体iPS细胞克隆； 3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆继续增殖6天； 4) 换MS。

5、C培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述软骨诱导分化培养基为无血清特定培养液。 6.由权利要求1-5中任一条的方法得到的软骨细胞或软骨组织及其应用。 7.一种诱导多能干细胞获得间充质干细胞的方法，包括如下步骤： 1)在微孔板中将诱导多能干细胞分化形成类胚体； 2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞； 3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述诱导因子为bFGF， EGF和 PDGF。 9.由权利要求7或8的方法。

6、得到的尿液细胞来源的间充质干细胞及其应用。 10.一种在体外将尿液细胞来源的间充质细胞诱导分化为软骨细胞形成软骨组织的方法，其特征在于，使用诱导分化培养基为无血清特定培养液。权利要求书 1/1 页 2 CN 105624102 A 2 利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法技术领域 0001 本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法。背景技术 0002 骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节病，是中老年人的常见病、多发病。关节软骨缺损是骨关节炎引起关节功能障碍和疼痛的重要原因。

7、之一。关节软骨主要由散在分布的软骨细胞和大量细胞外基质组成。软骨细胞外基质总是处于合成与降解代谢的动态平衡中，这对于维持关节的结构功能稳定起着非常重要的作用。关节软骨细胞外基质主要由型胶原(typeIIcollagen)和可聚蛋白聚糖(aggrecan，又称蛋白聚糖)组成，它们占正常关节软骨净重的90以上。型胶原主要以三螺旋结构形式存在，可以和其它胶原构成关节软骨的网状骨架。蛋白聚糖与透明质酸(hyalurinan)相互交联形成毛刷样结构覆盖在网状结构II型胶原的表面，将软骨细胞深埋其中，在体外只有在蛋白聚糖降解后型胶原才开始缓慢降解。蛋白聚糖含大量亲水基。

8、团，能够吸引大量水和自由的金属离子，从而保证了关节软骨具有很好的弹性和抗压性，可以承受体重的巨大压力。因此关节软骨中的蛋白聚糖对于关节的功能具有非常重要的意义。 0003 在骨关节炎等以软骨退变为病理特点的关节疾病中，软骨细胞功能异常， ECM的降解大于合成被认为是引起软骨退变的主要机制。在ECM的降解过程中，蛋白聚糖的降解是目前所知道的关节软骨损伤过程中最早发生的代谢变化，甚至早于关节软骨出现病理改变。在骨关节疾病早期，蛋白聚糖被水解从而丢失，如持续存在，则引起关节软骨胶原纤维的降解和各种炎性信息因子的释放，引发瀑布效应，进而彻底打破关节软骨的代谢平衡，。

9、使其进入不可逆性的负代谢状态，最终导致关节软骨的损毁。因此，蛋白聚糖的代谢改变和信息调控是研究软骨基质代谢障碍的关键所在。 0004 因为关节软骨缺乏有效的分化、增殖能力，所以损伤后自身修复能力有限。迄今为止，国内外尚无彻底治疗骨关节炎的方法，软骨修复是目前治疗骨关节炎最热门且最有前景的方法。自体软骨细胞移植术(autologouschondrocyteimplantation,ACI)是再生医学中修复软骨损伤最好的方法之一，是目前临床治疗膝关节软骨较大面积缺损的主要方法。软骨细胞是软骨组织工程中最常用的细胞，但同时存在的一些问题限制了其广泛应用，如本身。

10、稀少的自体软骨细胞不能满足大面积软骨损伤所需的较多的细胞，切取移植用软骨可引发供区部位形成新的骨关节炎，另外软骨细胞生命周期有限，软骨细胞在体外扩增的去分化导致植入体内后不能形成软骨，纤维软骨修复以及机械性能较差，关节的修复部位整合不良等。因此，对软骨缺损的修复转向成体干细胞向软骨细胞诱导分化的研究。干细胞移植物可以代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，具有巨大的应用价值。 0005 间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)由于在体外有较强的增殖能力，在特定的培养条件下可分化为中胚层来源的组织细胞如：骨细胞、软骨细胞、脂肪。

11、细胞等，说明书 1/6 页 3 CN 105624102 A 3 可取自自体，故MSCs成为目前软骨组织工程新的种子细胞。目前已进入临床应用阶段的是骨髓间充质干细胞。另外，脂肪干细胞和脐血间充质干细胞等也得到了广泛研究。虽然应用骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的方法已应用于临床，并取得初步成功，但存在的问题也很多，包括纯化率较低且干细胞数量有限，因而不能满足实验及临床应用的需求，分化后的软骨细胞表现出表型不稳定的特点和衰老特性等。如何高质量地修复软骨缺损并获得很好远期疗效及如何调控MSCs定向分化为成熟软骨细胞仍然是其大规模应用于临床的首要问题。另外，取材时。

12、对机体的创伤较大，有取材点的疼痛，也限制了骨髓间充质干细胞在临床的应用。 0006 诱导多能干细胞(iPSCs)技术通过自体细胞外源导入Sox2， Klf4， Oct4， c-Myc诱导产生多能干细胞。 iPS细胞与胚胎干细胞具有同样的多能性，具有全分化潜能，可以无限增殖并分化成全身所具有的200余种细胞类型，从而有望形成机体的任何组织或器官。与胚胎干细胞相比， iPS细胞具有更广泛的医疗前景：由病人个体自己产生的iPS细胞能避免免疫排斥，避免了伦理道德和法律等一些相关的问题。发明内容 0007 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题，本发明提供一种利用人尿液。

13、细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法。 0008 一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法，包括如下步骤： (1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经b)转分化生成间充质干细胞； (2)在软骨诱导分化培养基中培养(1)获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。 0009 进一步地，所述a)中将人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为： 1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞； 2)重编程产生 iPS细胞克隆； 3)挑取单克隆，继续培养获得诱导多能干细胞。 0010 进一步地，所。

14、述a)中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞的方法为： 1)在微孔板中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞分化形成类胚体； 2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞； 3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子bFGF， EGF 和PDGF的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 0011 进一步地，所述b)将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为： 1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞； 2)诱导产生前体iPS 细胞克隆； 3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆继续增殖6天； 4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传。

15、代。 0012 进一步地，步骤(2)中所述软骨诱导分化培养基为无血清特定培养液。 0013 本发明的内容还包括上述任一条的方法得到的软骨细胞或软骨组织及其应用。 0014 本发明的内容还包括一种诱导多能干细胞获得间充质干细胞的方法，包括如下步骤： 1)在微孔板中将诱导多能干细胞分化形成类胚体； 2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞； 3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 0015 进一步地，步骤3)中所述诱导因子为bFGF， EGF和PDGF。说明书 2/6 页 4 CN 105624102 A 4 0016 进一步地，本发。

16、明的内容还包括由权利要求7或8的方法得到的间充质干细胞及其应用。 0017 进一步地，本发明的内容还包括一种在体外将尿液细胞来源的间充质细胞诱导分化为软骨细胞形成软骨组织的方法，使用诱导分化培养基为无血清特定培养液。 0018 本发明的人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为： 1)将表达转录调控因子OCT4、 SOX2、 NANOG、 KLF4和LIN28的非整合型附着体载体或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的培养皿中，用成纤维细胞培养基培养； 2) 转染后第2天，将培养基培养基更换为含PCALH的N2B27条件培养基，或含有。

17、其他小分子化合物的培养基，每2天更换新鲜培养基； 3)转染后第13天，培养基更换为mTeSR1，使克隆继续增殖； 4)转染后第21天，挑取单克隆，并转移到预先用matrigel包被的12孔板中，继续培养获得诱导多能干细胞。 0019 本发明中将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为：将表达转录调控因子OCT4、 SOX2、 NANOG、 KLF4和LIN28的非整合型附着体载体共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的培养皿中，用成纤维细胞培养基培养； 2)转染后第2天，将培养基培养基更换为含含MEK抑制剂PD0325901、 GSK3b抑制剂C。

18、HIR99021、 TGF-b/Activin/Nodal receptor抑制剂A-83-01和ROCK抑制剂HA-100and人白血病抑制因子LIF的N2B27条件培养基，每2天更换新鲜培养基； 3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆在不含抑制剂的N2B27条件培养基继续增殖6天； 4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。 0020 本发明中所述软骨诱导分化培养基为高糖DMEM无血清特定培养液，含胰岛素2mg/ L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10-7mol/L、 TGF- 310ng/ml。 0021 本发明提供了一种利用人尿液细胞。

19、构建软骨组织的方法，本发明创造一方面利用尿细胞重编程为iPSCs， iPS细胞体外定向分化为间充质干细胞，再从iPS细胞体分化的间充质干细胞构建软骨组织。本发明另一方面利用尿液细胞转分化为间充质干细胞，从转分化获得的间充质干细胞构建软骨组织。本发明体外构建软骨组织，可以用于代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，为软骨组织的体外构建提供了一种有效的方法，具有巨大的应用价值。附图说明 0022 图1.由人尿细胞重编程生成iPS细胞的过程 0023 图2.优化的iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法，流式细胞术鉴定iPSC-MSCs 表面标志基因为CD105。

20、， CD73， CD166， CD90阳性， CD34、 CD45， CD14阴性 0024 图3.iPS细胞来源的间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、及脂肪细胞的分化的能力 0025 图4.iPS细胞来源的间充质干细胞具有抑制T细胞增殖的能力 0026 图5.人尿液细胞经转录因子介导转分化为间充质干细胞 0027 图6.iPS细胞来源的软骨细胞表达型胶原、 aggrecan等软骨细胞基因 0028 图7.iPS细胞来源的软骨细胞分泌软骨细胞特征性细胞外基质aggrecan 具体实施方式说明书 3/6 页 5 CN 105624102 A 5 0029 下述实施例中所使用的实验方法如无。

21、特殊说明，均为常规方法； 0030 下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径获得。 0031 使用的细胞及其来源 0032 1)尿细胞：由本实验室参照2012年发表于NatureProtocols上，题为Generation ofhumaninducedpluripotentstemcellsfromurinesamples的方法，自行收集、分离并培养。 0033 主要材料和试剂 0034 1)细胞培养相关试剂 0035 a)washingbuffer:DPBS(含100U/ml青霉素,100 g/ml链霉素和500ng/ml两性霉素B) 0036 b)青霉。

22、素和链霉素双抗混合液： Penicillin/Streptomycin(Hyclone) 0037 c)两性霉素B(Sigma) 0038 d)DPBS(Gibco) 0039 e)Primocin(InvivoGen) 0040 f)Gelatin,0.1(wt/vol)solution(Millipore) 0041 g)Primarymedium:DMEM高糖培养基和F12(1:1),supplementedwith10(vol/ vol)FBS,100ofUml-1penicillin,100 gml-1streptomycin,theREGMSingleQuotkit supplem。

23、entsand2.5 gml-1amphotericinB. 0042 h)DMEM高糖培养基(Hyclone、 Corning、 Gibco) 0043 i)GlutaMax(Gibco) 0044 j)非必须氨基酸： nonessentialaminoacidsolution， NEAA(Gibco) 0045 k) -巯基乙醇： -Mercaptoethanol(Gibco) 0046 细胞培养相关小分子化合物 0047 1)维生素C(sodiumL-ascorbate,Sigma) 0048 2)GSK3 抑制剂： CHIR99021 0049 3)MEKK抑制剂： PD0325901。

24、 0050 4)组蛋白去乙酰化酶抑制剂： valproicacid， VPA(Sigma)； trichostatinA， TSA (Sigma) 0051 5)人白血病抑制因子： leukemiainhibitoryfactor， LIF(Millipore) 0052 6)TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01 0053 7)ROCK抑制剂： HA-100(Sigma) 0054 8)mTeSR1basalmedium(Stemcell) 0055 9)mTeSR15supplement(Stemcell) 0056 10)EDTA(GIBCO) 005。

25、7 细菌培养相关试剂和耗材 0058 1)常用的细菌感受态： Top10、 DH5 (北京天根)， Stbl3(复能基因)。 0059 2)限制性内切酶(Takara、 NEB)。 0060 3)T载体： pMD18-T(Takara)。 0061 4)连接酶： SolutionI(Takara)。说明书 4/6 页 6 CN 105624102 A 6 0062 5)质粒小提试剂盒(北京天根)，质粒大提试剂盒(北京天根)。 0063 【实施例1】一种利用尿细胞重编程为诱导多能性干细胞的方法 0064 本实施例涉及尿液细胞来源的非整合型附着体载体介导产生iPS细胞的方法，具体包括以下。

26、步骤(图1)： 0065 1)将表达转录调控因子OCT4、 SOX2、 NANOG、 KLF4和LIN28的非整合型附着体载体 (pEP4EO2SEN2K： 3.0 g， pEP4EO2SET2K： 3.2 g， pCEP4-M2L： 2.4 g)共同导入100万尿细胞，再将细胞分至3块预先用matrigel包被的10cm盘中，用fibroblast培养基培养； 0066 2)转染后第2天， fibroblast培养基更换为N2B27条件培养基(含MEK抑制剂 PD0325901,GSK3b抑制剂CHIR99021,TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-0。

27、1,ROCK 抑制剂HA-100and人白血病抑制因子LIF),每2天更换新鲜培养基； 0067 3)转染后第13天，培养基更换为mTeSR1，使克隆继续增殖； 0068 4)转染后第21天，挑取单克隆，并转移到预先用matrigel包被的12孔板中，使iPS 细胞得以扩增。 0069 5)iPS细胞的鉴定：包括iPS细胞多能性基因的表达、 iPS细胞中重编程载体的分析、 iPS细胞核型的测定、 iPS细胞畸胎瘤分析 0070 【实施例2】优化iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法 0071 我们优化了iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法(图2)包括： (1)iPS细胞形成。

28、类胚体(EBs)； (2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞； (3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养分化为间充质干细胞。 0072 我们使用AggreWell培养板从iPS细胞制备类胚体，这种培养板上有微孔，可以用来将iPS细胞聚集成类胚体。制备类胚体时，将单细胞悬液加入到AggreWell培养板中，然后通过离心使细胞均匀的分布在微孔中，经过至少24小时的培养后，使得每一个微孔中的细胞聚集成团，制备成类胚体。通过AggreWell培养板获得的类胚体在大小和形状上都非常一致，使得后续的分化实验具有更好的可重复性。类胚体悬浮培养9-11天后分化为中胚层细胞，再经过。

29、贴壁培养分化为间充质干细胞(iPSC-MSCs)。流式细胞术鉴定iPSC-MSCs表面标志基因为CD105， CD73， CD166， CD90阳性， CD34、 CD45， CD14阴性(图2)。并且我们鉴定了iPSC- MSCs向骨细胞、软骨细胞、及脂肪细胞的分化(图3)。结果显示，与成体MSCs相比，这些iPSC- MSCs有类似的体外功能特征， (标志基因的表达和三谱系分化能力)和更强大的增殖能力。并且iPSC-MSCs能有效得抑制T细胞的增殖，表明iPSC-MSCs具有免疫调节特征(图4)。 0073 【实施例3】一种利用尿细胞转分化为间充质干细胞方法 0074。

30、本实施例涉及尿液细胞经转录因子介导转分化产生间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤(图5)： 0075 1)将表达转录调控因子OCT4、 SOX2、 NANOG、 KLF4和LIN28的非整合型附着体载体 (pEP4EO2SEN2K： 3.0 g， pEP4EO2SET2K： 3.2 g， pCEP4-M2L： 2.4 g)共同导入100万尿细胞，再将细胞分至3块预先用matrigel包被的10cm盘中，用fibroblast培养基培养； 0076 2)转染后第2天， fibroblast培养基更换为N2B27条件培养基(含MEK抑制剂 PD0325901,GSK3b抑制剂CHIR9。

31、9021,TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01,ROCK 抑制剂HA-100and人白血病抑制因子LIF),每2天更换新鲜培养基； 0077 3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆在不含抑制剂的N2B27条件培养基继续增殖说明书 5/6 页 7 CN 105624102 A 7 6天； 0078 4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。 0079 【实施例4】间充质干细胞向软骨细胞的分化 0080 将尿细胞来源的间充质干细胞定向诱导分化为软骨细胞。在较高的细胞密度下, 以微团培养(micromassculture)方式,经高糖DM。

32、EM无血清特定培养液(含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10-7mol/L、 TGF- 310ng/ml)作用三周后诱导 MSCs分化为软骨细胞。细胞经过诱导液作用21天后Alcianblue染色阳性。诱导生成的细胞经qPCR检测表达型胶原、 aggrecan等软骨细胞基因(图6)。诱导生成的细胞微团经石蜡切片，免疫组化检测软骨特异性型胶原表达， Alcianblue染色检测蛋白多糖表达，型胶原免疫组织化学检测显阳性， Alcianblue染色为阳性(图7)。实验结果表明iPS细胞分化得到的间充质干细胞可以体外分化为软骨细胞，并能分泌软骨细胞特征性细胞外基质型胶原蛋白和aggrecan。因此iPS细胞来源的间充质干细胞可作为构建软骨组织的种子细胞。说明书 6/6 页 8 CN 105624102 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 105624102 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 105624102 A 10 图5 图6 图7 说明书附图 3/3 页 11 CN 105624102 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201610075027.6	申请日：	20160202
公开号：	CN105624102A	公开日：	20160601
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12N5/077,C12N5/0775	主分类号：	C12N5/077,C12N5/0775
申请人：	中国科学院广州生物医药与健康研究院
发明人：	米格尔·埃斯特班,米奇·托托雷拉,王东业,陈树翰,秦宝明
地址：	510530 广东省广州市萝岗区开源大道190号
优先权：	CN201610075027A
专利代理机构：	广州新诺专利商标事务所有限公司	代理人：	华辉
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内容摘要

本发明提供了一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法，包括如下步骤：(1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经b)转分化生成间充质干细胞；(2)在软骨诱导分化培养基中培养(1)获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。本发明体外构建软骨组织，可以用于代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，为软骨组织的体外构建提供了一种有效的方法，具有巨大的应用价值。

权利要求书

1.一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法，包括如下步骤：(1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经b)转分化生成间充质干细胞；(2)在软骨诱导分化培养基中培养(1)获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述a)中将人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为：1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞；2)重编程产生iPS细胞克隆；3)挑取单克隆，继续培养获得诱导多能干细胞。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述a)中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞的方法为：1)在微孔板中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞分化形成类胚体；2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞；3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子bFGF，EGF和PDGF的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述b)将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为：1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞；2)诱导产生前体iPS细胞克隆；3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆继续增殖6天；4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述软骨诱导分化培养基为无血清特定培养液。 6.由权利要求1-5中任一条的方法得到的软骨细胞或软骨组织及其应用。 7.一种诱导多能干细胞获得间充质干细胞的方法，包括如下步骤：1)在微孔板中将诱导多能干细胞分化形成类胚体；2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞；3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述诱导因子为bFGF，EGF和PDGF。 9.由权利要求7或8的方法得到的尿液细胞来源的间充质干细胞及其应用。 10.一种在体外将尿液细胞来源的间充质细胞诱导分化为软骨细胞形成软骨组织的方法，其特征在于，使用诱导分化培养基为无血清特定培养液。

说明书

技术领域

本技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种通过利用人的尿液细胞构建软骨组织的方法。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节病，是中老年人的常见病、多发病。关节软骨缺损是骨关节炎引起关节功能障碍和疼痛的重要原因之一。关节软骨主要由散在分布的软骨细胞和大量细胞外基质组成。软骨细胞外基质总是处于合成与降解代谢的动态平衡中，这对于维持关节的结构功能稳定起着非常重要的作用。关节软骨细胞外基质主要由Ⅱ型胶原(typeIIcollagen)和可聚蛋白聚糖 (aggrecan，又称蛋白聚糖)组成，它们占正常关节软骨净重的90％以上。Ⅱ型胶原主要以三螺旋结构形式存在，可以和其它胶原构成关节软骨的网状骨架。蛋白聚糖与透明质酸 (hyalurinan)相互交联形成毛刷样结构覆盖在网状结构II型胶原的表面，将软骨细胞深埋其中，在体外只有在蛋白聚糖降解后Ⅱ型胶原才开始缓慢降解。蛋白聚糖含大量亲水基团，能够吸引大量水和自由的金属离子，从而保证了关节软骨具有很好的弹性和抗压性，可以承受体重的巨大压力。因此关节软骨中的蛋白聚糖对于关节的功能具有非常重要的意义。

在骨关节炎等以软骨退变为病理特点的关节疾病中，软骨细胞功能异常，ECM的降解大于合成被认为是引起软骨退变的主要机制。在ECM的降解过程中，蛋白聚糖的降解是目前所知道的关节软骨损伤过程中最早发生的代谢变化，甚至早于关节软骨出现病理改变。在骨关节疾病早期，蛋白聚糖被水解从而丢失，如持续存在，则引起关节软骨胶原纤维的降解和各种炎性信息因子的释放，引发瀑布效应，进而彻底打破关节软骨的代谢平衡，使其进入不可逆性的负代谢状态，最终导致关节软骨的损毁。因此，蛋白聚糖的代谢改变和信息调控是研究软骨基质代谢障碍的关键所在。

因为关节软骨缺乏有效的分化、增殖能力，所以损伤后自身修复能力有限。迄今为止，国内外尚无彻底治疗骨关节炎的方法，软骨修复是目前治疗骨关节炎最热门且最有前景的方法。自体软骨细胞移植术(autologouschondrocyteimplantation,ACI)是再生医学中修复软骨损伤最好的方法之一，是目前临床治疗膝关节软骨较大面积缺损的主要方法。软骨细胞是软骨组织工程中最常用的细胞，但同时存在的一些问题限制了其广泛应用，如本身稀少的自体软骨细胞不能满足大面积软骨损伤所需的较多的细胞，切取移植用软骨可引发供区部位形成新的骨关节炎，另外软骨细胞生命周期有限，软骨细胞在体外扩增的去分化导致植入体内后不能形成软骨，纤维软骨修复以及机械性能较差，关节的修复部位整合不良等。因此，对软骨缺损的修复转向成体干细胞向软骨细胞诱导分化的研究。干细胞移植物可以代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，具有巨大的应用价值。

间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)由于在体外有较强的增殖能力，在特定的培养条件下可分化为中胚层来源的组织细胞如：骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，可取自自体，故MSCs成为目前软骨组织工程新的种子细胞。目前已进入临床应用阶段的是骨髓间充质干细胞。另外，脂肪干细胞和脐血间充质干细胞等也得到了广泛研究。虽然应用骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎的方法已应用于临床，并取得初步成功，但存在的问题也很多，包括纯化率较低且干细胞数量有限，因而不能满足实验及临床应用的需求，分化后的软骨细胞表现出表型不稳定的特点和衰老特性等。如何高质量地修复软骨缺损并获得很好远期疗效及如何调控MSCs定向分化为成熟软骨细胞仍然是其大规模应用于临床的首要问题。另外，取材时对机体的创伤较大，有取材点的疼痛，也限制了骨髓间充质干细胞在临床的应用。

诱导多能干细胞(iPSCs)技术通过自体细胞外源导入Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc诱导产生多能干细胞。iPS细胞与胚胎干细胞具有同样的多能性，具有全分化潜能，可以无限增殖并分化成全身所具有的200余种细胞类型，从而有望形成机体的任何组织或器官。与胚胎干细胞相比，iPS细胞具有更广泛的医疗前景：由病人个体自己产生的iPS细胞能避免免疫排斥，避免了伦理道德和法律等一些相关的问题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题，本发明提供一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法。

一种利用人尿液细胞体外制备人工体外来源的软骨组织的方法，包括如下步骤：(1)将人尿液细胞经a)重编程生成诱导多能干细胞，并定向分化为间充质干细胞；或经b)转分化生成间充质干细胞；(2)在软骨诱导分化培养基中培养(1)获得的间充质干细胞，得到人工体外来源的软骨组织。

进一步地，所述a)中将人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为：1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞；2)重编程产生iPS 细胞克隆；3)挑取单克隆，继续培养获得诱导多能干细胞。

进一步地，所述a)中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞的方法为：1)在微孔板中将尿液细胞来源的诱导多能干细胞分化形成类胚体；2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞；3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子bFGF，EGF 和PDGF的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。

进一步地，所述b)将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为：1)将转录调控因子导入尿细胞或在含有小分子化合物的培养基中培养尿细胞；2)诱导产生前体iPS细胞克隆；3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆继续增殖6天；4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。

进一步地，步骤(2)中所述软骨诱导分化培养基为无血清特定培养液。

本发明的内容还包括上述任一条的方法得到的软骨细胞或软骨组织及其应用。

本发明的内容还包括一种诱导多能干细胞获得间充质干细胞的方法，包括如下步骤：1) 在微孔板中将诱导多能干细胞分化形成类胚体；2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞；3) 分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养在含诱导因子的含血清或无血清培养基中分化为间充质干细胞。

进一步地，步骤3)中所述诱导因子为bFGF，EGF和PDGF。

进一步地，本发明的内容还包括由权利要求7或8的方法得到的间充质干细胞及其应用。

进一步地，本发明的内容还包括一种在体外将尿液细胞来源的间充质细胞诱导分化为软骨细胞形成软骨组织的方法，使用诱导分化培养基为无血清特定培养液。

本发明的人尿液细胞经重编程生成诱导多能干细胞的方法为：1)将表达转录调控因子 OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28的非整合型附着体载体或其它转录因子的各种组合共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的培养皿中，用成纤维细胞培养基培养；2) 转染后第2天，将培养基培养基更换为含PCALH的N2B27条件培养基，或含有其他小分子化合物的培养基，每2天更换新鲜培养基；3)转染后第13天，培养基更换为mTeSR1，使克隆继续增殖；4)转染后第21天，挑取单克隆，并转移到预先用matrigel包被的12孔板中，继续培养获得诱导多能干细胞。

本发明中将人尿液细胞经转分化生成间充质干细胞的方法为：将表达转录调控因子 OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28的非整合型附着体载体共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的培养皿中，用成纤维细胞培养基培养；2)转染后第2天，将培养基培养基更换为含含MEK抑制剂PD0325901、GSK3b抑制剂CHIR99021、 TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01和ROCK抑制剂HA-100and人白血病抑制因子LIF的N2B27条件培养基，每2天更换新鲜培养基；3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆在不含抑制剂的N2B27条件培养基继续增殖6天；4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。

本发明中所述软骨诱导分化培养基为高糖DMEM无血清特定培养液，含胰岛素2mg/L、转铁蛋白3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF-β310ng/ml。

本发明提供了一种利用人尿液细胞构建软骨组织的方法，本发明创造一方面利用尿细胞重编程为iPSCs，iPS细胞体外定向分化为间充质干细胞，再从iPS细胞体分化的间充质干细胞构建软骨组织。本发明另一方面利用尿液细胞转分化为间充质干细胞，从转分化获得的间充质干细胞构建软骨组织。本发明体外构建软骨组织，可以用于代替被损害或者病变组织细胞，达到修复软骨的目的，为软骨组织的体外构建提供了一种有效的方法，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1.由人尿细胞重编程生成iPS细胞的过程

图2.优化的iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法，流式细胞术鉴定iPSC-MSCs表面标志基因为CD105，CD73，CD166，CD90阳性，CD34、CD45，CD14阴性

图3.iPS细胞来源的间充质干细胞具有向骨细胞、软骨细胞、及脂肪细胞的分化的能力

图4.iPS细胞来源的间充质干细胞具有抑制T细胞增殖的能力

图5.人尿液细胞经转录因子介导转分化为间充质干细胞

图6.iPS细胞来源的软骨细胞表达Ⅱ型胶原、aggrecan等软骨细胞基因

图7.iPS细胞来源的软骨细胞分泌软骨细胞特征性细胞外基质aggrecan

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径获得。

使用的细胞及其来源

1)尿细胞：由本实验室参照2012年发表于NatureProtocols上，题为Generationofhuman inducedpluripotentstemcellsfromurinesamples的方法，自行收集、分离并培养。

主要材料和试剂

1)细胞培养相关试剂

a)washingbuffer:DPBS(含100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素和500ng/ml两性霉素B)

b)青霉素和链霉素双抗混合液：Penicillin/Streptomycin(Hyclone)

c)两性霉素B(Sigma)

d)DPBS(Gibco)

e)Primocin(InvivoGen)

f)Gelatin,0.1％(wt/vol)solution(Millipore)

g)Primarymedium:DMEM高糖培养基和F12(1:1),supplementedwith10％(vol/vol) FBS,100ofUml-1penicillin,100μgml-1streptomycin,theREGMSingleQuot kitsupplementsand2.5μgml-1amphotericinB.

h)DMEM高糖培养基(Hyclone、Corning、Gibco)

i)GlutaMax(Gibco)

j)非必须氨基酸：nonessentialaminoacidsolution，NEAA(Gibco)

k)β-巯基乙醇：β-Mercaptoethanol(Gibco)

细胞培养相关小分子化合物

1)维生素C(sodiumL-ascorbate,Sigma)

2)GSK3β抑制剂：CHIR99021

3)MEKK抑制剂：PD0325901

4)组蛋白去乙酰化酶抑制剂：valproicacid，VPA(Sigma)；trichostatinA，TSA(Sigma)

5)人白血病抑制因子：leukemiainhibitoryfactor，LIF(Millipore)

6)TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01

7)ROCK抑制剂：HA-100(Sigma)

8)mTeSR1basalmedium(Stemcell)

9)mTeSR15×supplement(Stemcell)

10)EDTA(GIBCO)

细菌培养相关试剂和耗材

1)常用的细菌感受态：Top10、DH5α(北京天根)，Stbl3(复能基因)。

2)限制性内切酶(Takara、NEB)。

3)T载体：pMD18-T(Takara)。

4)连接酶：SolutionI(Takara)。

5)质粒小提试剂盒(北京天根)，质粒大提试剂盒(北京天根)。

【实施例1】一种利用尿细胞重编程为诱导多能性干细胞的方法

本实施例涉及尿液细胞来源的非整合型附着体载体介导产生iPS细胞的方法，具体包括以下步骤(图1)：

1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28的非整合型附着体载体 (pEP4EO2SEN2K：3.0μg，pEP4EO2SET2K：3.2μg，pCEP4-M2L：2.4μg)共同导入100万尿细胞，再将细胞分至3块预先用matrigel包被的10cm盘中，用fibroblast培养基培养；

2)转染后第2天，fibroblast培养基更换为N2B27条件培养基(含MEK抑制剂PD0325901, GSK3b抑制剂CHIR99021,TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01,ROCK抑制剂 HA-100and人白血病抑制因子LIF),每2天更换新鲜培养基；

3)转染后第13天，培养基更换为mTeSR1，使克隆继续增殖；

4)转染后第21天，挑取单克隆，并转移到预先用matrigel包被的12孔板中，使iPS 细胞得以扩增。

5)iPS细胞的鉴定：包括iPS细胞多能性基因的表达、iPS细胞中重编程载体的分析、 iPS细胞核型的测定、iPS细胞畸胎瘤分析

【实施例2】优化iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法

我们优化了iPS细胞向间充质干细胞定向分化的方法(图2)包括：(1)iPS细胞形成类胚体(EBs)；(2)类胚体悬浮培养分化为中胚层细胞；(3)分化为中胚层细胞的类胚体贴壁培养分化为间充质干细胞。

我们使用AggreWell培养板从iPS细胞制备类胚体，这种培养板上有微孔，可以用来将iPS 细胞聚集成类胚体。制备类胚体时，将单细胞悬液加入到AggreWell培养板中，然后通过离心使细胞均匀的分布在微孔中，经过至少24小时的培养后，使得每一个微孔中的细胞聚集成团，制备成类胚体。通过AggreWell培养板获得的类胚体在大小和形状上都非常一致，使得后续的分化实验具有更好的可重复性。类胚体悬浮培养9-11天后分化为中胚层细胞，再经过贴壁培养分化为间充质干细胞(iPSC-MSCs)。流式细胞术鉴定iPSC-MSCs表面标志基因为CD105， CD73，CD166，CD90阳性，CD34、CD45，CD14阴性(图2)。并且我们鉴定了iPSC-MSCs向骨细胞、软骨细胞、及脂肪细胞的分化(图3)。结果显示，与成体MSCs相比，这些iPSC-MSCs 有类似的体外功能特征，(标志基因的表达和三谱系分化能力)和更强大的增殖能力。并且 iPSC-MSCs能有效得抑制T细胞的增殖，表明iPSC-MSCs具有免疫调节特征(图4)。

【实施例3】一种利用尿细胞转分化为间充质干细胞方法

本实施例涉及尿液细胞经转录因子介导转分化产生间充质干细胞的方法，具体包括以下步骤(图5)：

1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28的非整合型附着体载体 (pEP4EO2SEN2K：3.0μg，pEP4EO2SET2K：3.2μg，pCEP4-M2L：2.4μg)共同导入100万尿细胞，再将细胞分至3块预先用matrigel包被的10cm盘中，用fibroblast培养基培养；

2)转染后第2天，fibroblast培养基更换为N2B27条件培养基(含MEK抑制剂PD0325901, GSK3b抑制剂CHIR99021,TGF-b/Activin/Nodalreceptor抑制剂A-83-01,ROCK抑制剂 HA-100and人白血病抑制因子LIF),每2天更换新鲜培养基；

3)转染后第17天，挑取单克隆，使克隆在不含抑制剂的N2B27条件培养基继续增殖6 天；

4)换MSC培养基培养9天后细胞得以扩增进行第一次传代。

【实施例4】间充质干细胞向软骨细胞的分化

将尿细胞来源的间充质干细胞定向诱导分化为软骨细胞。在较高的细胞密度下,以微团培养(micromassculture)方式,经高糖DMEM无血清特定培养液(含胰岛素2mg/L、转铁蛋白 3mg/L、丙酮酸100mg/L、地塞米松10^-7mol/L、TGF-β310ng/ml)作用三周后诱导MSCs分化为软骨细胞。细胞经过诱导液作用21天后Alcianblue染色阳性。诱导生成的细胞经qPCR 检测表达Ⅱ型胶原、aggrecan等软骨细胞基因(图6)。诱导生成的细胞微团经石蜡切片，免疫组化检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达，Alcianblue染色检测蛋白多糖表达，Ⅱ型胶原免疫组织化学检测显阳性，Alcianblue染色为阳性(图7)。实验结果表明iPS细胞分化得到的间充质干细胞可以体外分化为软骨细胞，并能分泌软骨细胞特征性细胞外基质Ⅱ型胶原蛋白和 aggrecan。因此iPS细胞来源的间充质干细胞可作为构建软骨组织的种子细胞。