技术领域：
本发明涉及一类通式Ⅰ所示对GPR84具有激动作用的化合物及其制备方法，以及其在制备治疗败血症的药物中的用途。
背景技术：
G蛋白偶联受体是一大类膜蛋白受体，有367个人类基因编码相关蛋白，它几乎参与所有细胞生理功能的调节。目前，有许多已知的GPCRs配体如：气体、激素、神经递质、趋化因子等。此外，研究发现许多游离脂肪酸(free fatty acids FFA)为GPCRs的内源性配体，其主要是通过结合游离脂肪酸受体(Free fatty acid Receptors，FFARs)，激活下游一系列细胞通路，从而调节机体生理活动，研究表明FFAs对葡萄糖稳态、脂质的形成、免疫反应等有重要作用(Tomo Yonezawa,等Free Fatty Acids-Sensing G Protein-Coupled Receptors in Drug Targeting and Therapeutics.Current Medicinal Chemistry 2013,20(30),3855-3871)。
GPR84(G蛋白偶联受体84)亦是一类膜蛋白受体，由25-35个连续的氨基酸构成七个跨膜α螺旋结构，是最新发现的一类视紫红质样受体。gpr84首先是由Wittenberger用EST(Expressed Sequence Tag)方法克隆得到。人类gpr84位于12号染色体上，鼠类gpr84位于15号染色体上，GPR84主要表达在骨髓、外周血白细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)中(Timo Wittenberger*,H.C.S.a.S.H.,An Expressed Sequence Tag(EST)Data Mining Strategy Succeeding in the Discovery of New G-Protein Coupled Receptors.JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 2001,303(3),799-813)在LPS存在的条件下，中链脂肪酸可以通过GPR84显著上调巨噬细胞系RAW264.7细胞中IL-12p40亚基，IL12p40在细胞介导免疫中发挥了重要作用，它能保护Th1而抑制Th2(Wang,J等,Medium-chain fatty acids as ligands for orphan G protein-coupled receptor GPR84.The Journal of biological chemistry 2006,281(45),34457-64.)，说明GPR84具有维持Th1和Th2平衡功能，对于多发性硬化症、炎症性肠病、关节炎等自身免疫性及炎症性疾病有重要意义。此外，肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发生与慢性炎症密切相关，当巨噬细胞侵润脂肪组织时可通过分泌细胞因子促进炎症反应的发生，同时脂肪细胞中GPR84表达会增加，显示GPR84也参与了脂肪酸代谢和免疫系统间的交叉调节(Perseghin,G.；Petersen,K.；Shulman,G.I.,Cellular mechanism of insulin resistance:potential links with inflammation.International journal of obesity and related metabolic disorders:journal of the International Association for the Study of Obesity 2003,27Suppl 3,S6-11.)。
2006年Ling小组发现GPR84能被中链游离脂肪酸(MCFA)激活，不能被长链游离脂肪酸(LCFA)和短链游离脂肪酸(SCFA)激活，其中葵酸(C10：0)、蓖麻油酸(C11：0)、月桂酸(C12：0)激动活性最好，其活性分别是4μM、8μM、9μM(CHO-GPR84细胞，cAMP实验)。另外，他们还报道了一个相对较好激动活性的化合物二吲哚甲烷(diindolylmethane,DIM)，DIM EC50＝0.5μM([35S]-GTPγS结合实验)，0.7μM(cAMP实验)。Suzuki等研究发现2-或3-羟基MCFA(2-OH-C10，3-OH-C10，2-OH-C12，3-OH-C12)也具有GPR84的激活活性，此外筛选发现6-OAU对GPR84有较好的活性(EC50＝0.661μM)(Suzuki,M.等Oda,T.,Medium-chain fatty acid-sensing receptor,GPR84,is a proinflammatory receptor.The Journal of biological chemistry 2013,288(15),10684-91)。
由于GPR84正常生理表达量较低，只有在一定刺激下诱导其高表达，而其表达量的高低与炎症反应有很大的关系，是治疗炎症相关疾病非常好的靶标，但目前其具体作用机制仍然不明，且目前无很好的GPR84激动剂，阻碍了GPR84作用机制的研究，故急需设计合成一系列具有较好激动活性的化合物。
本发明涉及合成了一系列小分子化合物，对GPR84有很好的激动活性，相对于目前报道的对GPR84激动剂活性有了较大幅度的提高，从而为GPR84的作用机制研究提供较好的工具小分子，以及为抗败血症药物发现开辟新途径。
发明内容：
本发明的目的在于设计与合成一类新型的化合物，其可以作为GPR84的激动剂，从而为GPR84的作用机制研究提供较好的工具小分子，以及为抗败血症药物发现开辟新途径。
本发明的另一目的也在于提供上述化合物的制备方法。
本发明的又一目的是提供一种包含上述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明的又一目的是提供上述化合物的用途。
本发明所述一类通式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中R1为R1a、R1b或R1c；
R5a、R5b和R5c各自独立地为：甲基、异丙基、C2-C9烯基、C2-C4炔基、3-6元环烷基、氰基、羟基、无取代苯基、C1-C4烷基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；优选地，R5a、R5b和R5c各自独立地为：甲基、异丙基、C2-C9烯基、乙炔基、3-4元环烷基、氰基、羟基、无取代苯基、C1-C4烷基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；
n为0-16的整数；优选0-9的整数；
T、W和Y各自独立地为氧、氮或碳；优选为氮或碳；
R2为羟基、氨基、三氟甲基或C1-C3烷基；优选为羟基、氨基、三氟甲基或甲基；
R3不存在，或为氢、苄基或C1-C6烷基；优选地，R3不存在，或为氢或苄基；
R4不存在，或为氢或C1-C3烷基；优选地，R4不存在，或为氢或甲基；
Z为-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基。
在本发明的进一步实施方式中，通式Ⅰ中：
R1为R1a，其中R5a为甲基、异丙基、3-4元环烷基、无取代苯基、氰基、羟基、C1-C4烷基取代苯基、甲氧基取代苯基、或氟取代苯基；
R2为羟基；
n为0-14；
T、W和Y各自独立地为氧、氮或碳；
R3不存在，或为氢、苄基、C1-C3烷基；
R4不存在，或为氢或C1-C3烷基；
Z为-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基。
在本发明的进一步实施方式中，通式Ⅰ为如下通式II
R1为上述R1a、R1b或R1c；R2为羟基、甲基、氨基或三氟甲基；W和Y为氮；
R4为氢或C1-C3烷基；
Z为羟基或氨基。
在本发明的进一步实施方式中，通式Ⅰ为如下通式III
其中：
R1为上述R1a、R1b或R1c
W为氮或碳。
本发明通式Ⅰ优选为如下结构的化合物：
本申请所述通式I化合物可通过本领域常规方法制备，例如，如下所述方法：
路线一：
其中，R6a为甲基、异丙基、C2-C4炔基、3-6元环烷基、氰基、羟基、无取代苯基、C1-C3烷基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；
n为1-16；
化合物1溶于EtOH/H2O(2:1)中，加入KOH和KI，再缓慢滴加溴代物2，80℃反应6h，反应完后柱层析分离即得产物Ⅳa；
路线二：
其中，R6b为C2-C9烯基、C2-C4炔基、3-6元环烷基、或C1-C3烷基取代的苯基；
n为1-16；
将化合物3和TsCl溶于无水DCM中，加入吡啶，25℃反应3h，柱层析分离即得化合物4，再同化合物1溶于EtOH/H2O(2:1)中，加热回流6h，反应完后过柱分离即得产物Ⅳb；
路线三：
其中R7a为甲基、异丙基、C1-C3烷基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、或氟取代苯基；
n为1-15；
将Na溶于乙醇中，加入化合物5和化合物6，80℃反应6h，浓缩反应液，加入少量水，调节pH至酸性，即有白色固体析出，过滤，白色固体即为所要产物；
路线四：
其中R7b为甲基、乙基、或异丙基；
将化合物7溶于DCM中，加入CBr4、PPh3，，25℃反应14h，反应完后柱层析分离得化合物8；将化合物8溶于THF中，-78℃加入NaH，搅拌5分钟后，加入丙二酸二乙酯，逐渐升温至25℃，25℃反应6h，柱层析分离即得化合物9；将化合物9与NaCl溶于DMSO中，180℃反应3h，反应完后柱层析分离即得化合物10；将Na溶于乙醇中，加入化合物和化合物10，80℃反应6h，浓缩反应液，加入少量水，调节pH至酸性，即有白色固体析出，过滤，白色固体即为所要产物Ⅴb；
路线五：
其中R7c为甲基或异丙基；
n为7-12；
将化合物11溶于THF中0℃下加入NaH，搅拌10分钟后加入n-BuLi，搅拌10分钟，再加入溴代物，0℃下反应14h，柱层析分离得化合物12；再将化合物12溶于EtOH/H2O(2:1)中，加入NaOH，25℃反应14h，加盐酸调pH至4-5，有白色固体析出，过滤，白色固体即 为化合物13；将化合物13溶于THF中，加入羰基二咪唑，25℃反应14h，柱层析分离即得化合物14；将化合物14溶于90％H2SO4中，130℃下反应1h，柱层析分离得化合物15；将化合物15溶于28％氨水中，100℃下反应14h,加盐酸调pH至4-5，有白色固体析出，过滤，白色固体即为Ⅵa；
路线六：
其中n为4-10；
将镁屑加入乙醚中，滴入溴代物，反应1h后，加入化合物16，过柱分离得化合物17；将化合物17溶于DCM中，加入PCC，柱层析分离得化合物18；将化合物18溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐渐升温至25℃，25℃反应14h，柱层析分离即得Ⅵb；
路线七：
其中n为5-10；
将溴代物溶于甲苯中，加入三苯基膦，120℃反应14h得化合物19；将化合物19溶于DMSO/H2O(10:1)中，130℃反应3h，柱层析分离得化合物20(为Z和E两种构型混合物)；将化合物20溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐渐升温至25℃，25℃反应14h，柱层析分离即得Ⅵc(为Z和E两种构型混合物)；
路线八：
其中n为5-10；
化合物20的制取同路线七，将化合物20(为Z和E两种构型混合物)溶于乙醇中，加入Pd/C，H2氛围下反应16h,柱层析分离得化合物21；将化合物21溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐渐升温至25℃，25℃反应14h，柱层析分离即得Ⅵd；
路线九：
其中R4为氢或C1-C3烷基；
n为1-4；
将Na溶于乙醇中，加入化合物22和化合物23，80℃反应16h，浓缩反应液，加入少量水，调节PH至酸性，即有白色固体析出，过滤，白色固体即为化合物24；再将化合物24溶于EtOH/H2O中，加入KI、KOH和溴代物，80℃反应6h，浓缩，柱层析分离即得Ⅳc；
路线十：
其中R2为氨基、羟基、或甲基；
n为1-4；
Z为-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基；
将Na溶于乙醇中，加入化合物26和化合物25，80℃反应16h，浓缩反应液，加入少量水，调节pH至酸性，即有白色固体析出，过滤，白色固体即为Ⅳd；
路线十一：
n为1-4；
R4为氢或甲基；
将Na溶于乙醇中，加入化合物27和化合物23，80℃反应16h，浓缩反应液，加入少量水，调节pH至酸性，即有白色固体析出，过滤，白色固体即为化合物26-1；再将化合物26-1溶于EtOH/H2O中，加入KI、KOH和溴代物，80℃反应6h，浓缩，柱层析分离即得Ⅳd-1；
路线十二：
其中R6c为C1-C6烷基、或苄基；
X为I或Br；
将化合物LY228-6a溶于甲苯中，加入K2CO3，0℃下加入R6cX，110℃回流12h，浓缩柱层析既得Ⅳe；
路线十三：
n为1-9；
将化合物26溶于乙腈中，0℃下加入盐酸肼、三乙胺，移至室温搅拌30min，加入邻苯二甲酸酐，加热回流16h，浓缩反应液，加入DCM，过滤除去滤渣，滤液用5％氨水洗涤，浓缩有机相，干燥，即得化合物27；将化合物27溶于THF中，0℃下，缓慢滴入KHMDS，搅拌5分钟，加入碘甲烷，TLC监测反应完全后，淬灭反应，萃取浓缩柱分离得化合物28；将NH4Cl加入无水甲苯中，N2保护，0℃下缓慢滴加三甲基铝，待无甲烷气体冒出后缓慢滴加溶于甲苯的化合物28，80℃搅拌15h，冷却至室温，加入少量硅胶，搅拌10分钟，过滤，浓缩滤液，加入盐酸甲醇，搅拌12h，浓缩即得粗品29；将Na溶于甲醇中，加入粗品29和化合物22-1，加热回流12h，浓缩，加入少量水至固体溶解，再调pH至酸性有白色固体析出，过滤，将滤渣柱分离即得Ⅳf；
路线十四：
n为1-9；
将镁屑加入乙醚中，滴入溴代物，反应1h后，加入化合物30，柱分离得化合物31，再将其溶入NaOCH3/MeOH中，加热回流16h，得化合物32；将32溶于DCM中，-78℃滴加BBr3，缓慢升至25℃，反应12h，TLC监测反应完全后，淬灭反应，柱分离即得Ⅶ；
路线十五：
其中
R7c为甲基或异丙基；
n为6-12；
将化合物11溶于THF中0℃下加入NaH，搅拌10分钟后加入n-BuLi，搅拌10分钟，再加入溴代物，0℃下反应14h，柱层析分离得化合物12；将化合物23加入水中，70℃下搅拌待化合物23全部溶解，加入K2CO3和化合物12，105℃下敞口反应，待溶剂完全蒸干，停止加热，冷却至室温，加入水将固体溶解，溶液呈白色乳状，加盐酸(1N)调pH至酸性，有白色粘稠固体析出，倒去上层清液，固体用水(5ml)，洗三次，再经柱层析分离即得Ⅷa；将化合物33溶于少量水中，再缓慢滴入溶于THF/H2O(5:2)的Ⅷa，加热回流6h，再加入盐酸，回流12h，浓缩柱分离即得Ⅷb。
路线十六：
其中n为1-4；
将化合物34溶于THF中，与二羰基咪唑反应生成化合物35；将六甲基硅烷溶于THF中，-78℃滴加正丁基锂制备六甲基硅锂再加入二乙基锌和化合物35、36,反应，柱层析分离得到化合物37；再将化合物37溶于乙醇中，加入醋酸铵，25℃反应3h后，浓缩加入甲苯回流3h，柱层析分离即得黄色固体VIII。
路线十七：
将化合物38溶于乙醇中，加入胺，100℃下回流16h,得到化合物39；将Na溶于甲醇中，加入粗品化合物39和丙二酸二乙酯，加热回流12h，浓缩，加入少量水至固体溶解，再调pH至酸性有白色固体析出，过滤，将滤渣柱分离即得IX。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明不局限于这些实施例。
化合物制备实施例
下述制备实施例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx 300M仪器测定，NMR定标：δH 7.26ppm(CDCl3)，2.50ppm(DMSO-d6)，3.15ppm(CD3OD)；试剂主要由上海化学试剂公司提供；TLC薄层层析硅胶板由山东烟台会友硅胶开发有限公司生产，型号HSGF 254；化合物纯化使用的正相柱层析硅胶为山东青岛海洋化工厂分厂生产，型号zcx-11，200-300目。
制备实施例一(化合物编号LY214-5)
化合物1(100mg，0.69mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq),再缓慢加入2-1(310mg，0.26ml，3.0eq)，80℃反应6h，TLC监测反应，反应完后，加入稀盐酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤、浓缩柱层析分离(DCM：MeOH＝30:1)得LY214-5(白色固体，12mg，8％)。(DMSO-d6)δ12.1(s，2H)，5.11(s,1H)，3.08(t，J＝6.0Hz，2H)，1.61(m，2H)，1.36(m，2H)，1.28(m，2H)，0.87(t，J＝6.3Hz，3H)
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例二(化合物编号LY224-a)
将3-1(0.1ml，1.02mmol，1eq)溶于无水DCM(5ml)，加入吡啶(104mg，1.3mmol，1.3eq)再冷却至0℃，缓慢滴加加入溶于无水DCM(5ml)TsCl(214mg，1.12mmol，1.1eq)，升至20℃，搅拌12h，TLC监测反应，反应完全后，浓缩柱层析分离(DCM：MeOH＝30:1)得4-1(无色油状液体，145mg，56％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝5.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),4.05(t,J＝7.2Hz,2H),2.50(m,2H),2.45(s,3H),2.08(m,2H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).
化合物1(67mg，0.47mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，再缓慢加入4-1(145mg，0.52mmol，1.1eq)，80℃反应6h，TLC监测反应，反应完后，加入稀盐酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤、浓缩柱层析分离(DCM：MeOH＝30:1)得LY224-a(白色固体，44mg，42％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.36(s,1H), 5.12(s,1H),3.18(t,J＝6.3Hz,2H),2.52-2.55(m,2H),2.21–2.03(m,2H),1.03(t,J＝7.5Hz,3H).
制备实施例三(化合物编号LY224-b)
取Na(250mg)溶于乙醇(8ml)中，加入5(500mg，4.9mmol，1eq)，待固体溶解后，缓慢滴入溶于乙醇(5ml)6-1(1.1g，5.89mmol，1.2eq)，有白色固体析出，加热回流3h，冷却、过滤，取滤液，浓缩滤液，加入3ml H2O将固体溶解，缓慢滴入稀盐酸(2M)至PH为3-5，有白色固体析出，过滤，取滤渣，加入5ml甲醇，搅拌1h，过滤，取滤渣，干燥即为LY224-b(白色固体，1.0g，91％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.64(s,2H),5.02(s,1H),2.52(t,J＝7.5Hz,2H),1.62(q,J＝6.6Hz 2H),1.25(m,10H),0.84(t,J＝6.6Hz,3H).
用同样方法合成以下化合物：
制备实施例四(化合物编号LY244)
将7-1(0.5ml，3.68mmol，1eq)，溶于无水DCM(20ml)中，加入三苯基膦(1.2g，4.41mmol，1.2eq)、四溴化碳(1.4g，4.41mmol，1.2eq)，20℃搅拌12h，TLC监测反应完全后，浓缩反应液，柱层析分离(纯PE)得8-1(无色油状液体，310mg，59％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),4.05(s,2H),2.50(m,2H),2.45(q,J＝8.1Hz,3H),2.08(m,2H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).
将丙二酸二乙酯(91mg，0.63mmol,1eq)溶于THF(10ml)中，冷却至-78℃，加入NaH(19.7mg，0.82mmol,1.1eq)，搅拌10分钟，缓慢滴入8-1(100mg，0.69mmol，1.1eq)逐渐升至20℃搅拌12h，TLC监测反应完全后，加入水(5ml)淬灭反应，EA(10ml)萃取三次，再加水(5ml)反萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤柱层析分离得9-1(无色油状液体，52mg，41％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.10(m,4H),4.25–4.10(m,4H),3.67(t,J＝6.9Hz,1H),3.17(d,J＝7.8Hz,2H),2.60(q,J＝13.8Hz,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H),1.20(t,J＝7.2,6H).
将9-1(130mg，0.63mmol，1eq)溶于DMSO(2ml)中，加入NaCl(74mg，1.26mmol，2eq)，160℃下加热3h，加入水(5ml)加EA(5ml)萃取三次,再加水(5ml)反萃三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤柱层析分离得10-1(无色油状液体，56mg，43％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.12(m,4H),4.14(q,J＝14.4Hz,2H),2.91(t,J＝8.4 Hz,2H),2.59(t,J＝8.4Hz,2H),2.54(q,J＝13.8Hz,2H),1.28((t,J＝7.2Hz,3H),1.22((t,J＝7.2Hz,3H).
取Na(250mg)溶于乙醇(8ml)中，加入2(212mg，2.08mmol，1.1eq)，待固体溶解后，缓慢滴入溶于乙醇(5ml)10-1(390mg，1.89mmol，1eq)，有白色固体析出，加热回流3h，冷却、过滤，取滤液，浓缩滤液，加入3ml的H2O将固体溶解，缓慢滴入稀盐酸(2M)至PH为3-5，有白色固体析出，过滤，取滤渣，加入5ml甲醇，搅拌1h，过滤，取滤渣，干燥即为LY244(白色固体，147mg，35％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.50(s,2H),7.12(m,4H),5.06(s,1H),2.95–2.88(t,J＝7.5Hz,2H),2.78–2.69(t,J＝8.1Hz,2H),2.60–2.53(q,J＝7.5Hz,2H),1.15(t,J＝7.5Hz,1H).
制备实施例五(化合物编号LY237、LY238-d)
将11(1ml，7.7mmol，1eq)加入无水THF(20ml)中，冷却到0℃，加入NaH(203mg，8.5mmol，1.1eq)，搅拌5分钟，再加入正丁基锂(5.3ml，8.5mmol，1.6M，1.1eq)，搅拌五分钟，再加入溴代物(1.3ml，7.7mmol，1eq)，0℃下搅拌12h，溶液变为黄色乳状液体，TLC监测反应完全后，加入水(10ml)淬灭反应，EA(10ml)萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤柱层析分离得12-1(黄色油状液体，647mg，34％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.19(q,J＝15Hz,2H),3.42(s,2H),2.53(t,J＝7.2Hz,2H),1.28(m,14H),0.87(t,J＝6.3Hz,3H).1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),3.43(s,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.23(m,14H),0.85(t,J＝6.3Hz,3H).
将12-1(647mg，2.67mmol，1eq)溶于EtOH/H2O(10/10ml)，加入NaOH(139mg，3.47mmol，1.3eq)，20℃搅拌12h，加入EA(10ml)洗涤两次，取水相，加入稀盐酸(1M)调PH至3-5，有白色固体析出，过滤，真空干燥既得13-1(白色固体，410mg，72％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),3.43(s,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.23(m,14H),0.85(t,J＝6.3Hz,3H).
将13-1(100mg，0.47mmol，1eq)溶于无水THF(10ml)中，加入羰基二咪唑(106mg，0.65mmol，1.4eq)，20℃搅拌12h，加入H2O(10ml)EA(10ml)萃取三次，合并有机相浓缩，加入甲醇(3ml)，静置，有白色针状晶体析出，过滤，即得14-1(白色针织晶体，28mg，16％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ12.30(s,1H),5.91(s,1H),3.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.47t,J＝7.8Hz,2H),1.65(m,4H),1.26(m,24H),0.88(t,J＝6.7,5.7Hz,6H).
取14-1(14mg，0.037mmol，1eq)溶于90％的H2SO4(5ml)，130℃搅拌1h，加入EA(5ml)萃取，浓缩层析分离得LY238-d(白色固体，6mg，67％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.96(s,1H),5.57(s,1H),5.30(s,1H),2.46(t,J＝7.5Hz,2H),1.62(m,2H),1.26(m,12H),0.87(d,J＝6.3Hz,3H).
将LY238-d(26mg，0.1mmol，1eq)溶于30％氨水(5ml)，100℃回流14h，加入稀盐酸(1M)调PH至3-4，有白色固体析出，过滤，干燥即为LY237(白色固体，20mg，83％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.85(s,1H),10.27(s,1H),5.58(s,1H),5.33(s,1H),2.33(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(q,J＝6.6Hz,2H),1.24(m,12H),0.85(t,J＝6.0Hz,3H).
用同样的方法制备下列化合物：
制备实施例六(化合物编号LY250)
取镁屑(58mg，2.4mmol，2eq)加入无水乙醚(5ml)中，在氮气氛围下缓慢滴加溴庚烷(231mg，1.2mmol，1eq)，50℃回流反应45分钟，再缓慢加入溶于无水乙醚(10ml)的16(200mg，1.2mmol，1eq)，滴加完毕后，50℃回流3h，TLC监测反应完后，缓慢滴加水(5ml)淬灭反应，加入EA(10ml)萃取三次，合并有机相饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩，柱层析(PE:EA＝10：1)分离得17-1(无色油状液体，200mg，60％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.51(d,J＝2.1Hz,2H),6.37(t,J＝2.4Hz,1H),4.64–4.54(m,1H),3.78(s,6H),1.57(m,2H),1.26(m,12H),0.85(t,J＝6.6Hz,3H).
将17-1(220mg，0.79mmol，1eq)溶于无水DCM(10ml)中，加入PCC(507mg，2.36mmol，3eq)和硅胶(880mg)，20℃反应14h，TLC监测反应完后，过滤，浓缩，柱层析(PE:EA＝10：1)分离得18-1(白色固体，161mg，73％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.09(d,J＝2.1Hz,2H),6.63(t,J＝2.1Hz,1H),3.83(s,6H),2.87(t,J＝7.5Hz,2H),1.77–1.62(m,2H),1.30(m,12H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).
将18-1(157mg，0.56mmol，1eq)溶于无水DCM(5ml)中，冷却到-78℃，缓慢滴加三溴化硼(2M 0.85ml，1.68mmol，3eq)，缓慢升至20℃，搅拌14h，TLC监测反应完后缓慢滴加水(5ml)淬灭反应，加入EA(10ml)萃取三次，合并有机相饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩，柱层析(PE:EA＝3：1)分离得LY250(无色油状液体，100mg，71％)。1H NMR(300MHz,cd3od)δ6.87(d,J＝2.1Hz,2H),6.47(m,1H),2.90(t,J＝7.2Hz,2H),1.66(m,2H),1.32(m,10H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H).
制备实施例七(化合物编号LY234)
将溴辛烷(1ml，5mmol，1eq)溶于甲苯(20ml)中，加入三苯基膦(1.6g，6mmol，1.2eq)，120℃回流12h，浓缩反应液，加入正己烷(20ml)，有白色粘稠固体析出，倾倒出液体，加入PE/EA(20ml/10ml)洗涤三次，用倾倒法除去液体，真空干燥得19-1粗品直接后投。
将19-1(460mg，1.01mmol，1.2eq)溶于DMSO/H2O(5ml/0.5ml)中，加入18(139mg，0.84mmol，1eq)、碳酸钾(232mg，1.68mmol，2eq)，130℃回流12h，TLC监测反应完后加入EA(5ml)萃取三次，有机相用H2O(5ml)反萃取三次，合并有机相饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩，柱层析(PE:EA＝50:1)分离得20-1(无色油状液体，230mg，89％)。(E/Z＝1.2)E 1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.50(d,J＝2.1Hz,2H),6.34(t,J＝2.4Hz,1H),6.31(d,J＝15.6Hz,1H),6.28(m,1H),3.79(s,3H),2.19(q,J＝13.2Hz,2H),1.44(m,2H),1.28(m,8H),0.88(t,J＝6.6Hz,4H)。Z 1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.43(d,J＝2.1Hz,1H),6.23(t,J＝6.4Hz,1H),6.34(d,J＝11.4Hz,1H),5.67(m,1H),3.79(s,3H),2.33(q,J＝14.1Hz,2H),1.44(m,2H),1.44(m,2H),1.28(m,8H),0.88(t,J＝6.6Hz,4H).
将20-1(476mg，1.8mmol，1eq)溶于无水DCM(10ml)中，冷却到-78℃，缓慢滴加三溴化硼(2M 2.7ml，5.4mmol，3eq)，缓慢升至20℃，搅拌14h，TLC监测反应完后缓慢滴加水(10ml)淬灭反应，加入EA(15ml)萃取三次，合并有机相饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩，柱层析(PE:EA＝3：1)分离得LY234(黄色油状液体，320mg，76％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)Eδ6.48–6.30(m,3H),6.30–6.09(m,2H),2.16(m,2H),1.42(m,10H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H)。Zδ6.48–6.30(m,3H),6.35(m,1H),5.63(m,1H),2.29(m,2H),1.42(m,10H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H).
制备实施例八(化合物编号LY236)
19-1、20-1的制备同制备实施例七；
将20-1(100mg，0.38mmol)溶于EtOH(10ml)中，加入Pd/C(10mg)，氢气氛围下20℃反应14h，TLC监测反应完后，氮气置换，过滤，浓缩滤液，柱层析(PE:EA＝50:1)分离得21(无色油状液体，54mg，54％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.35(d,J＝2.1Hz,2H), 6.31–6.28(t,J＝2.1Hz,1H),3.78(s,6H),2.54(t,J＝7.5Hz,2H),1.58(m,4H),1.28(m,6H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).
将21(264mg，0.19mmol，1eq)溶于无水DCM(5ml)中，冷却到-78℃，缓慢滴加三溴化硼(2M 0.27ml，0.54mmol，3eq)，缓慢升至20℃，搅拌14h，TLC监测反应完后缓慢滴加水(5ml)淬灭反应，加入EA(10ml)萃取三次，合并有机相饱和食盐水洗涤、干燥、浓缩，柱层析(PE:EA＝3:1)分离得LY236(黄色固体，16mg，70％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.24(d,J＝2.1Hz,2H),6.22–6.13(m,1H),4.73(s,2H),2.48(t,J＝7.8Hz,2H),1.56(m,2H),1.26(m,12H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).
制备实施例九(化合物编号LY290-b)
将1.2g Na缓慢溶于17ml甲醇中，待Na反应完后，加入溶于甲醇(17ml)的23(3.8g，0.05mol，1eq)，再加入22-2(8.7g，0.05mol，1eq)，有白色固体析出，加热回流16h，冷却至50℃，加入盐酸(1M，25ml)调PH至酸性，白色固体逐渐溶解，过滤除去不容固体，冷却至0℃，静置12h，有晶体析出，过滤，固体用冰水洗涤，干燥即为24-1(2.08g，白色固体，26.3％)。
化合物24-1(100mg，0.60mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq)，再缓慢加入25-1(381mg，1.80mmol，3.0eq)，80℃反应6h，TLC监测反应，反应完后加入稀盐酸(1M，10ml)，再加入EA(15ml)萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤、浓缩柱层析分离(DCM:MeOH＝30:1)得LY290-b(白色固体，17mg，9.8％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.31(s,2H),7.26(m,J＝7.2,2H),7.21–7.11(m,3H),3.13(t,J＝6.6,2H),2.59(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.60(m,4H).
制备实施例十(化合物编号LY274-a)
化合物26-2(100mg，0.70mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.6mg，0.07mmol，0.1eq)，再缓慢加入25-1(445mg，2.1mmol，3.0eq)，80℃反应6h，TLC监测反应，反应完后加入稀盐酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤、浓缩柱层析分离(DCM：MeOH＝30:1)得LY274-a(白色固体，10mg，5.2％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.26(m,2H),7.19(m,3H),6.02(s,4H),5.12(s,1H),3.00(t,J＝6.6Hz,2H),2.59(q,J＝6.6Hz,2H),1.62(m,4H).
用同样的方法得到下面化合物：
制备实施例十一(化合物编号LY328)
将600mg Na缓慢溶于5ml甲醇中，待Na反应完后，加入溶于甲醇(5ml)的23(760mg，0.01mol，1eq)，再加入27(2.00g，0.01mol，1eq)，有棕色固体析出，加热回流16h，冷却至50℃，加入盐酸(1M，25ml)调PH至酸性，白色固体逐渐溶解，过滤除去不溶固体，冷却至0℃，静置12h，有晶体析出，过滤，固体用冰水洗涤，干燥即为26-1(1.00g，白色固体，51.0％)
化合物26-1(100mg，0.50mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq),再缓慢加入25-1(318mg，1.50mmol，3.0eq)，80℃反应6h，TLC监测反应，反应完后加入稀盐酸(1M，10ml)，再加入EA(15ml)萃取3次，合并有机相用饱和食盐水洗涤、干燥、过滤、浓缩柱层析分离(DCM:MeOH＝30:1)得LY328(白色固体，80mg，67.2％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ13.50(s,1H)，7.32–7.22(m,2H),7.17(m,3H),6.58(s,1H),3.16(t,J＝9.6Hz,2H),2.60(q,J＝6.9Hz,2H),1.67(m,4H)
制备实施例十二(化合物编号LY242)
取LY228-6a(100mg，0.44mmol，1.0eq)溶于甲苯中，加入K2CO3(120mg，0.88mmol，2.0eq)，0℃下缓慢滴入碘甲烷(62.04mg，0.44mmol，1.0eq)，回流3h，TLC监测反应，反应完后，浓缩反应液，柱层析分离(DCM:MeOH＝30:1)得LY242(白色固体，21mg，19.8％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.24(s,1H),3.30(s,3H),3.09(t,J＝6.9Hz,2H),1.78–1.54(m,2H),1.44–1.30(m,2H),1.25-1.28(m,4H),1.01–0.71(t,J＝5.4Hz,3H).
用同样的方法制取下列物质：
制备实施例十三(化合物编号LY238-c)
将26-1(2ml，10mmol，1eq)溶于乙腈(20ml)中，0℃下加入盐酸肼(760mg，11mmol，1.1eq)、三乙胺(1.6ml，11mmol，1.1eq)，移至室温搅拌30min，加入邻苯二甲酸酐(1.5g，10.1eq，1.01eq)，加热回流16h，冷却至室温，浓缩反应液，再加入DCM(10ml)，搅拌充分溶解，过滤除去滤渣，滤液用5％氨水(10ml)洗涤三次，再用饱和食盐水(10ml)洗涤有机相，合并有机相，浓缩，干燥，即得27-1(黄色油状液体，1.35g，96％)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ2.33(t,J＝7.2Hz,2H),1.72–1.59(m,2H),1.45(m,2H),1.29(s,10H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H).
将27-1(480mg，3.46mmol，1.0eq)溶于THF(10ml)中，0℃下缓慢滴入KHMDS(10ml，10mmol，3eq)，搅拌5分钟，加入碘甲烷(0.42ml，3.46mmol，2eq)，TLC监测反应完全后，加水(5ml)淬灭反应，加入EA(5ml)萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩柱层析(PE：EA＝30:1)分离得28-1(黄色油状液体，150mg，28.4％)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.66–1.55(m,2H),1.39(m,1H),1.31(d,J＝4.5Hz,3H),1.29(s,10H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H).
将NH4Cl(94.4mg，1.76mmol，1.8eq)加入无水甲苯(10ml)中，N2保护，0℃下缓慢滴加三甲基铝(0.9ml，1.67mmol，1.7eq)，移至室温搅拌，待无甲烷气体冒出后缓慢滴加溶于甲苯的28-1(150mg，0.98mmol，1eq)，80℃搅拌15h，冷却至室温，加入少量硅胶(300mg)，搅拌10分钟，过滤，浓缩滤液，加入盐酸甲醇(2ml，2N)，搅拌12h，浓缩即得粗品29-1(118mg，黄色固体)；
将Na(200mg)溶于甲醇(10ml)中，加入29-1(118mg，0.69mmol，1eq)和22-1(70.4mg，0.414mmol，0.6eq)，加热回流12h，冷却至室温，浓缩反应液，加入少量水至固体溶解，再加入盐酸(1N)调PH至酸性，有白色固体析出，过滤，取滤渣，将滤渣柱层析(DCM:MeOH＝20:1)分离即得LY238-c；(白色固体，41mg，26.8％)；1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.58(s,2H),5.06(s,1H),2.62(m,1H),1.63(m,2H),1.32(m,2H),1.19(m,8H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H),0.84(t,J＝6.9Hz,3H).
制备实施例十四(化合物编号LY225-b)
将镁屑(118mg，4.92mmol，3eq)加入乙醚(10ml)中，加入少量碘(10mg)，滴入溴辛烷(3ml，1.64mmol，1eq)，待引发后50℃反应1h，加入溶于DCM(5ml)的30(300mg，1.64mmol,1eq)，室温搅拌2h，溶液变成橙色，TLC监测反应完全后，加入水(5ml)淬灭反应，加入DCM(5ml)，萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，柱层析(PE:EA＝30:1)分离得31-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ2.93–2.81(t,J＝7.8Hz,2H),1.88–1.70(m,2H),1.43–1.15(m,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).
取Na(600mg)加入甲醇(15ml)中，待Na溶解后加入31-1(300mg，1.15mmol，1eq)，加热回流16h，TLC监测反应，待其反应完全后，冷却至室温浓缩反应液，再加入水(5ml)，加入EA(5ml)萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，柱层析(DCM:MeOH＝50:1)分离得32-1(白色固体，204mg，74.7％)；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.83(s,6H),2.55(t,J＝7.5Hz,2H),1.81–1.65(m,2H),1.33(m,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).
将32-1(100mg，0.395mmol，1eq)溶于DCM(5ml)中，-78℃下缓慢滴加BBr3(296mg，1.18mmol，3eq)，缓慢升至25℃,反应12h，TLC监测反应完全后，加入甲醇(3ml)淬灭反应，浓缩反应液，柱层析(DCM：MeOH＝20:1)分离即得LY225-b；(白色固体，18mg，20.2％)；1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.19(s,2H),2.38(t,J＝7.5Hz,2H),1.59(m,2H),1.25(m,10H),0.84(t,J＝7.5Hz,3H).
制备实施例十五(化合物编号LY240、LY224-c)
12-2制备同12-1；
将23(350mg，1.54mmol，1.5eq)加入水(0.5ml)中，70℃下搅拌待23全部溶解，加入K2CO3(213mg，1.54mmol，1.5eq)、12-2(76mg，1.0mmol，1eq)，105℃敞口反应，待溶剂完全蒸干，停止加热，冷却至室温，加入水(5ml)将固体溶解，溶液呈白色乳状，加盐酸(1N)调PH至酸性，有白色粘稠固体析出，倒去上层清液，固体用水(5ml)，洗三次，再经柱层析(PE:EA＝10:1)分离即得LY240(白色固体，56mg，23.3％)；1H NMR(300MHz,DMSO)δ12.30(s,1H),12.19(s,1H),5.67(s,1H),2.33(t,J＝8.1Hz,2H),1.51(m,2H),1.26(m,10H),0.86(t,J＝6.3Hz,3H).
将33(31mg，0.42mmol，2eq)溶于水(1ml)中，缓慢滴加溶于THF/H2O(5/2ml)的LY240(50mg，0.21mmol，1eq)，70℃下反应6h，再滴入浓盐酸(0.1ml)，70℃下反应16h，冷却至室温，加入EA(5ml)萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩柱层析(DCM:MeOH＝20:1)分离即得LY224-c(白色固体，5mg，10.6％)；1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.87(s,1H),10.77(s,1H),5.31(s,1H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(m,2H),1.25(m,10H),0.86(t,J＝6.6Hz,3H).
制备实施例十六(化合物编号LY243)
将34-1(1g，5.6mmol，1eq)溶于THF(15ml)中，冷却至0℃，缓慢滴加溶于THF(5ml)的二羰基咪唑(998mg，6.16mmol，1.1eq)0℃反应2h，再移至25℃反应1h，加入水(5ml),EA(10ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得粗品35-1，直接用于下一步；
取六甲基硅烷(742mg，4.61mmol，1.4eq)，-78℃下加入n-BuLi(2.9ml，4.61mmol，1.4eq)，-78℃下搅拌20min，再加入36(467mg，3.29mmol，1.0eq)，-78℃下继续搅拌1h，再加入二乙基锌(4.6ml，4.61mmol，1.4eq),搅拌20min后，升温至-20℃，加入溶于THF(5ml)的35-1(900mg，3.95mmol)，升温至-10℃，搅拌3h，加入饱和NH4Cl(10ml)淬灭反应，再加入EA(10ml)萃取3次，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析分离即得37-1(白色固体，321mg，27％)；
取37-1(100mg，0.33mmol，1.0eq)，溶于乙醇(10ml)中，加入醋酸铵(76mg，0.99mmol，3.0eq)，25℃反应3h，浓缩反应液，再加入甲苯(5ml)120℃下分水回流3h，浓缩反应液，柱层析分离(DCM:MeOH＝20:1)即得LY243(黄色固体，38mg，48.7％)。1H NMR(300MHz,DMSO)δ11.67(s,2H),7.60(d,J＝8.1Hz,2H),7.18(d,J＝8.1Hz,2H),6.54(s,1H),5.21(s,1H),2.5(t,J＝7.5Hz,2H),1.46-1.38(m,2H),1.32–1.00(m,2H),0.75(t,J＝7.5Hz,3H).
制备实施例十七(化合物编号LY239)
取38(500mg，1.8mmol，1.0eq)溶于乙醇(10ml)中，加入正辛胺(387mg，3mmol，1.6eq)，100℃反应16h，浓缩反应液加入水(5ml)乙醇(5ml)置于冰浴下，有白色固体析出，过滤，得粗品39-1(白色固体，321mg)；
取Na(200mg)加入甲醇(20ml)中，待Na溶解后加入39-1(700mg，4.1mmol，1eq)，加热回流16h，TLC监测反应，待其反应完全后，冷却至室温浓缩反应液，再加入水(5ml)，加入1M盐酸调PH至3-4，加入EA(5ml)萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，干燥，柱层析(DCM:MeOH＝50:1)分离得LY239(白色固体，132mg，13.5％)；1H NMR(300MHz,DMSO)δ10.29(s,2H),6.48(s,1H),4.58(s,1H),3.20(dd,J＝12.9,6.9Hz,2H),1.46(m,2H),1.26(m,10H),0.85(t,J＝6.9Hz,3H).
生物实验实施例
Fluo-4荧光染料示踪法检测细胞质钙离子浓度
1.实验目的：
进行本发明化合物的GPR84激动活性测试。
2.材料来源
人源GPR84细胞系，通过在HEK293细胞系中转染编码GPR84和G16蛋白的质粒得到。荧光染料Fluo-4AM购自Invitrogen公司。
3.测试原理：
细胞内Ca2+离子是一种非常重要的G蛋白偶联受体信号通路第二信使，当与Gα16蛋白偶联的GPR84和配体结合后，细胞内的Ca2+离子浓度能够显著增加。Fluo-4是一种Ca2+离子特异性荧光探针，能够和Ca2+离子定量结合并发出荧光。因此采用荧光检测法，在96孔或 384孔平底微孔板中检测化合物的激动活性。GPR84细胞经荧光染料Fluo-4孵育后，加入不同浓度的化合物进行刺激，同时用波长为485nm的光源激发并于525nm波段检测细胞内钙离子浓度变化引起的染料荧光强度的改变，计算得到化合物的半数有效浓度(EC50)。
4.实验过程：
1.配制HBSS：0.4g/L KCl(5.4mM)，0.12g/L Na2HPO4·12H2O(0.3mM)，0.06g/L KH2PO4(0.4mM)，0.35g/L NaHCO3(4.2mM)，0.14g/L CaCl2(1.3mM)，0.10g/L MgCl2·6H2O(0.5mM)，0.05g/L MgSO4(0.6mM)，8.0g/L NaCl(137mM)，称取上述各成分并用超纯水融解，用盐酸或NaOH溶液调节PH至7.4，过滤，4℃保存一个月。
2.配制Ca缓冲液：首先配制560mM D-葡萄糖(100X)水溶储存液，250mM 1,2-二苯基-4-(2-苯亚硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮(1000X)储存液。然后在100ml HBSS中加BSA(0.5g)，560mM的D-葡萄糖储存液(1ml)和250mM 1,2-二苯基-4-(2-苯亚硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮储存液(100μl)，使终浓度分别为0.5％BSA，5.6mM D-葡萄糖，250μM1,2-二苯基-4-(2-苯亚硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮，混匀，现配现用。
3.配制染料：首先配制3％的Cremophor EL(100X)PBS溶解的储存液和2mM Fluo-4(1000X)DMSO溶解的储存液，然后每毫升染料的配制为先将1μl的2mM Fluo-4AM和10μl的3％的Cremophor EL混匀，再用1ml钙缓冲液稀释并混匀。
4.以4万个/孔的密度将细胞接种到96孔细胞培养板上，继续培养24小时以上使细胞密度至80-90％用于实验检测。
5.吸去待检测细胞孔内培养液，加入新鲜配制的染料40μl/well，置于37度培养箱内恒温孵育40min至50min。
6.在细胞孵育过程中配制化合物(此步骤也可以提前准备)：用实验前新鲜配制钙缓冲液将作为激动剂使用的化合物稀释至最终工作浓度的3倍(如果是DMSO溶解的化合物应保证最终工作时DMSO浓度不超过1％)
7.在孵育步骤完成后将染料吸尽弃去，用钙缓冲液洗一遍后换50μl的钙缓冲液再孵育5至10min。
8.用FlexStation III微孔板检测仪加入25μl/孔含不同浓度化合物的钙缓冲液进行刺激，同时用波长为485nm的光源激发并于525nm波段检测细胞内钙离子浓度变化引起的染料荧光强度的改变。
以GPR84受体为例，激动剂6-OAU配样情况：
6-OAU起始浓度 6-OAU配样板浓度 6-OAU最终工作浓度 10mM(含100％DMSO) 30μM(含3％DMSO) 100μM(含1％DMSO) 1mM(含100％DMSO) 30μM(含3％DMSO) 10μM(含1％DMSO) 100μM(含100％DMSO) 3μM(含3％DMSO) 1μM(含1％DMSO) 10μM(含100％DMSO) 300nM(含3％DMSO) 100nM(含1％DMSO) 1μM(含100％DMSO) 30nM(含3％DMSO) 10nM(含1％DMSO) 100nM(含100％DMSO) 3nM(含3％DMSO) 1nM(含1％DMSO) 10nM(含100％DMSO) 0.3nM(含3％DMSO) 0.1nM(含1％DMSO) 100％DMSO 3％DMSO 1％DMSO
5.实验结果：
本申请得到了一系列对GPR84具有优异的激动活性的化合物，特别是化合物LY237，其活性较目前报道激动活性最好化合物6-OAU高4500倍。