技术领域
本发明涉及一种提取纯化虫草素的方法，属于药用真菌有效成分提取分离领域。
背景技术
蛹虫草又名北冬虫夏草，蛹草菌，蛹草等，中医认为，虫草是唯一一种能平衡、调节阴 阳的中药，其入肺肾二经，既能补肺阴又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后 虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等。虫草素是蛹虫草的主要活性成分之一，现代药理 学研究表明，虫草素具有抑制微生物生长、抗肿瘤、调节免疫力、抑菌、抗炎、抗衰老、改 善新陈代谢、清除自由基等多种药理作用，有良好的临床应用前景。目前，国外有报道虫草 素能够人工合成，但目前处于探索阶段，合成的过程复杂且产量极低。由于天然虫草资源稀 缺，价格昂贵，虫草素含量甚微，所以天然虫草很难成为提取虫草素的主要原料。
现有从人工养殖蛹虫草子实体中获得虫草素的方法，但子实体的获得困难、耗时、成本 高，并且除虫草素外的其他成分含量也很高，如虫草酸、虫草多糖和超氧化歧化酶等，如果 仅提取虫草素，其他高含量的成分会导致提取过程复杂且困难，因而从经济的角度考虑，从 子实体中仅提取虫草素价格昂贵，成本较高。蛹虫草菌皮是蛹虫草子实体的副产品，生产中 常常当做废品处理，但蛹虫草菌皮也含有虫草素成分，并且其他成分的含量较低，其作为副 产品来源丰富，价格低廉，利用其提取虫草素可以变废为宝，不仅大大的降低成本，同时也 避免了资源的浪费。
从蛹虫草菌皮中纯化虫草素的方法，现有的方法是利用大孔强酸离子交换树脂来对虫草 素进行纯化，但大孔强酸离子交换树脂使用时需要用酸碱反复浸洗数次，步骤繁琐，复杂、 溶剂用量大，残留多，且大量提取时成本也比较高。另有方法利用硅胶柱层析从蛹虫草子实 体中分离纯化虫草素，但其溶剂一般为三相或四相，如乙酸乙酯、乙醇和水的组合或水、乙 酸乙酯、异丙醇和氯仿的组合，由于溶剂种类多，进而导致实验过程复杂、难以控制，并且 三相或四相溶剂因无法根据密度调节其体积比例，进而溶剂不能回收再利用，造成溶剂的大 量浪费，大大增加了实验的成本。
发明内容
本发明是针对现有技术的不足，提供一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，该方 法原料来源丰富，廉价易得，并具有工艺简单、易操作，有机溶剂可循环利用且用量少、成 本低、产品纯度高的优点。
本发明采用的技术方案为：
一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，
步骤如下：
(1)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过筛，置于真空干燥箱中干燥，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入甲醇和水的混合溶液，浸泡；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流，过滤，得到提取液；
(4)提取液用石油醚萃取，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，回收洗脱液， TLC跟踪检测；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，溶解，结晶，得虫草素。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蛹 虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空干燥箱中的温度为30-60℃，干燥时间为2-6h。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，步骤(2)中在干燥 好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8-20h。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(3)将浸 泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间1-3h。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(4)中提 取液用1-3倍量的石油醚萃取1-3次。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中硅 胶柱洗脱时的流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1-14:1。
所述的一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，所述步骤(7)中得到的有虫草素 的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4℃低温下结晶，得虫草素。
本发明具有以下有益效果：
(1)原料蛹虫草菌皮来源丰富，价格低廉，可代替蛹虫草子实体，克服蛹虫草子实体获 取困难，成本较高，所以不利于大量的生产的缺陷。
(2)采用甲醇和水热回流提取，设备简单，操作容易，节省时间，成本低廉。
(3)分离选择硅胶层析柱富集虫草素，操作简单，分离效果好，得到虫草素纯度高。
(4)洗脱溶剂为氯仿和甲醇，溶剂可以回收循环使用，避免了多种溶剂配比复杂而不能 回收使用的情况，节省大量的溶剂。
附图说明
图1所示的是虫草素标准品的紫外扫描图。
图2所示的是虫草素标准品的高效液相色谱图。
图3所示的是虫草素标准品色谱峰的纯度结果。
图4所示的是本发明实施例1得到的虫草素的高效液相色谱图。
图5所示的是本发明实施例1得到的虫草素色谱峰的纯度结果。
图6所示的是本发明实施例1得到的虫草素红外谱图。
图7所示的是对比例1的TLC图谱。
具体实施方式
一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法，步骤如下：
(1)取蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，蛹虫草菌皮粉末过20-80目筛，置于真空 干燥箱中的温度为30-60℃，干燥时间为2-6h，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入8-14倍量的甲醇和水的混合溶液，浸泡8- 20h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，每次回流时间1-3h，过滤， 得到提取液；
(4)提取液用1-3倍量的石油醚萃取1-3次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，且比例为8:1- 14:1，回收洗脱液，TLC跟踪检测；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇或乙醇加热使其溶解，于4℃ 低温下结晶，得虫草素。
实施例1一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法
(一)、步骤如下：
(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥 4h，取1kg，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶， 得虫草素。
(二)、高效液相法检测虫草素纯度
(1)试剂和材料
甲醇(色谱纯)，纯净水，虫草素标准品。
(2)色谱条件：Diamonsil反相C18柱(250×4.6mm，5μm)；Agilent1200高效液相；流动 相：甲醇:水＝15:85(v/v)；流速为1ml/min；检测波长260nm；进样量10μL。
(3)最大吸收波长的测定
称取60℃干燥至恒重的虫草素标准品适量，用甲醇溶解，稀释，配制成50.0μg·mL-1的溶液，按紫外分光光度法(《中国药典》2010年版一部)在200-400nm波长范围内进行 扫描。
将虫草素标准品溶于水、甲醇和pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并进行紫外扫描。 虫草素标准品紫外扫描结果见扫描图1，由紫外扫描结果可知虫草素在259nm波长处有最大 吸收。
(4)虫草素标准品和实施例1中得到的虫草素样品的测定
经测量实施例1的方法得到虫草素857mg。
取少量虫草素标准品及实施例1的方法得到虫草素样品加入适量的甲醇超声使其溶解， 使用孔径为0.22μm的微孔滤头进行过滤，待测。虫草素标准品高效液相色谱图如图2，色 谱峰的纯度结果如图3，由图3可知虫草素标准品的纯度为97.44％。
按实施例1方法得到的虫草素样品，高效液相色谱图如图4，色谱峰的纯度结果如图 5，由图5可知，按实施例1的方法得到虫草素纯度为97.42％。说明采用实施例1的方法得 到了高纯度的虫草素。
(5)自制样品的红外图谱
取本实施案例得到的虫草素样品，测定红外图谱，结果见图6。红外图谱数据(cm-1)： 3326.0、3141.8、2923.8、1672.2、1608.5、1575.7、1479.3、1340.4、1299.9、1209.2、 1174.6、958.5、831.3、727.1，与虫草素标准谱图数据基本一致。进一步证明本发明实施例 1的方法得到了虫草素。
实施例2一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法
(一)、步骤如下：
(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥 4h，取1kg，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为8:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶， 得虫草素。经称量得到虫草素634mg。
(二)、高效液相法检测虫草素纯度同实施例1中的(二)
经测定，实施例2的方法得到了虫草素，但较实施例1方法得到的虫草素质量较少。
实施例3一种从蛹虫草菌皮中提取纯化虫草素的方法
(一)、步骤如下：
(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥 4h，取1kg，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为12:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶， 得虫草素。经称量得到虫草素653mg。
(二)、高效液相法检测虫草素纯度同实施例1中的(二)
经测定，实施例3的方法得到了虫草素，但较实施例1方法得到的虫草素质量较少。
对比例1
(一)、步骤如下：
(1)同实施例1的步骤(1)；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入13倍量的60％甲醇溶液，浸泡18h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(5)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为10:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(6)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶， 得虫草素。经称量得到虫草素426mg。说明采用对比例1的方法虽然得到了虫草素，但较实 施例1方法得到的虫草素质量少很多，提取率不高。
图7所示的是对比例1得到的样品TLC图谱。A图中，展开剂为氯仿和甲醇体积比为 10:1，图中a为对比例1中蛹虫草提取液的样品点，b为蛹虫草提取液经石油醚萃取后的样 品点，c为虫草素标准品样品点，d石油醚萃取层的样品点。从薄层色谱图A看出，没有经 过石油醚萃取的蛹虫草提取液中，在虫草素的Rf值上方还有一些杂质成分，而石油醚萃取 后的提取液在此展开剂比例下，其上方没有这些杂质，说明石油醚萃取确实起到了除杂的效 果。
B图中，展开剂为石油醚和乙酸乙酯的体积比为5:1。图中a为对比例1中得到蛹虫草 提取液的样品点，b为蛹虫草提取液经石油醚萃取后的样品点，c为石油醚萃取层的样品 点。蛹虫草提取液和石油醚萃取层的样品点在更小的极性条件下，在相同的Rf值处均显示 荧光斑点，而经石油醚萃取后的提取液中这些杂质，进一步说明本发明经石油醚萃取后提取 液，其中脂溶性的小极性成分含量大大降低，这位后续的分离纯化得到高纯度的虫草素起到 了重要的作用。
对比例2
(一)、步骤如下：
(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥 4h，取1kg，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为2:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶。
按对比例2的方法没有得到达到一定纯度的虫草素样品，经硅胶层析柱洗脱后，虫草素 随其他样品一同被洗脱下来，没有达到分离纯化的目的。
对比例3
(一)、步骤如下：
(1)以蛹虫草菌皮为原料，用粉碎机粉碎，过60目筛，置于40℃的真空干燥箱中干燥 4h，取1kg，备用；
(2)在干燥好的蛹虫草菌皮粉末中加入10倍量的70％甲醇溶液，浸泡12h；
(3)将浸泡后的混悬液置于回流装置中，加热回流3次，第一次回流3h，用纱布过滤 后，将剩余残渣再加入提取溶剂，继续加热回流2次，每次1h，合并滤液，得到提取液；
(4)提取液用2倍量的石油醚萃取2次，弃去石油醚层；
(5)下层剩余液通过减压浓缩进行回收，得到蛹虫草菌皮提取液的浸膏；
(6)用甲醇将浸膏溶解后，经硅胶层析柱洗脱，流动相为氯仿和甲醇，体积比为18:1， 回收洗脱液，TLC跟踪检测，直到洗脱液中无虫草素为止；
(7)得到的有虫草素的洗脱液减压浓缩后，用适量甲醇加热使其溶解，4℃低温结晶。
按对比例3的方法没有得到达到一定纯度的虫草素样品，经硅胶层析柱洗脱后，洗脱时 间很长，且虫草素随其他样品一同被洗脱下来，没有达到分离纯化的目的。