技术领域
本发明涉及一种抗体的制备方法，具体地说，涉及一种抗毒蕈碱3型受体第一环抗体的 制备方法。
背景技术
干燥综合征(sjogren’ssyndrome，SS)是一种系统性自身免疫性疾病。临床上主要以 淋巴细胞浸润外分泌腺(如涎腺和泪腺)为特征，表现为唾液腺、泪腺及消化道等外分泌腺体 功能失调，导致进行性口干、眼干及内脏受累。由于唾液、泪腺分泌减少或停止，出现口、 眼干燥难忍、口唇破裂、龋齿猖獗或反复角膜炎、结膜炎、腮腺肿大及血管炎等。重症患者 可有肺间质纤维化、肺动脉高压、肾小管酸中毒及中枢神经系统受累等严重内脏病变。干燥 综合征患者中淋巴瘤、骨髓瘤等恶性肿瘤的发生率是正常人的40倍。流行病学调查发现， 本病在我国的患病率为0.77％，而在50岁以上人群中的患病率达5％。总患病人数逾800万， 其中大部分患者未得到及时的诊断和治疗。
干燥综合征的发病机制尚不十分清楚。研究发现，患者血清中可含有抗核抗体、抗SSA 及SSB等多种自身抗体，唇黏膜活检可见大量淋巴细胞浸润。近20年来，国内外的大量工 作致力于寻找及研究干燥综合征的致病性抗原，但并无明显进展。抗核抗体(ANA)、抗SSA 及抗SSB抗体等虽见于干燥综合征患者，但亦见于系统性红斑狼疮等其他自身免疫病，对 干燥综合征并不具特异性。因此，发现并研究干燥综合征的特异性或相对特异性抗原对认识 本病的发生机制及免疫治疗有重要意义。
M受体(MuscarinicAcethylcholineReceptor)即毒蕈碱样乙酰胆碱受体是胆碱能受体的 一种，它位于副交感神经节后纤维所支配的效应器细胞膜上，对以毒蕈碱为代表的拟胆碱药 较为敏感。研究发现，主要分布于外分泌腺及平滑肌的M3受体能利用信号转导通路调节腺 体的分泌，使膀胱逼尿肌及睫状肌的收缩、稳定自主神经功能；而这些功能的失调与干燥综 合征的临床症状相近似。近年来，M3受体与干燥综合征的关系已逐渐得到风湿病专家的广 泛关注。
Yamamoto等研究发现患病NOD鼠的血清可以与同位素标记的M3受体发生免疫沉淀反 应，提示病鼠体内存在抗M3受体的抗体。Robinson等研究基因敲除后的NODIgnull鼠 (SS鼠)时注意到，用M3受体激动剂毛果芸香碱(Pilocarpine)刺激NODIgnull鼠后， 其腺体分泌可恢复正常；而SS患者或病鼠血清中的IgG可以抑制其对腺体分泌的刺激作用； 但如果事先用大鼠腮腺细胞吸附SS患者血清中的IgG，则这种抑制作用消。这些现象均说 明SS患者血清或病鼠体内存在抗M3受体的抗体，而且该抗体很可能是导致干燥综合征发 生的重要致病因素。NOD-scid为另一种基因敲除的NOD鼠，Nguyen等将抗M3受体抗体 和抗SSB抗体(目前认为与SS有关的抗体)注入免疫缺陷NOD-scid鼠的腹腔后发现，只 有抗M3受体抗体可以引起干燥综合征样的体分泌功能减低，而其他抗体没有这种作用。这 个结果再次证明是体液免疫而不是细胞毒或细胞因子的作用产生了干燥综合征样的临床表 现，而且抗M3受体抗体对外分泌腺分泌功能有特异性抑制作用。Bacman等在间接免疫荧 光试验中发现原发性SS患者血清可以与大鼠眶外泪腺腺泡细胞作用，使后者产生膜表面均 匀一致的荧光，M3受体细胞外第二环的合成多肽可以抑制这种荧光，提示SS患者体内同 样存在着抗M3受体抗体。以人工合成的M325肽及鼠眶外泪腺腺泡细胞膜提取物为抗原， 用ELISA法先后测定了干燥综合征患者唾液中的IgA及血清中的IgG，结果均显示干燥综 合征患者的唾液及血清中确实存在着抗M3受体抗体，而且该抗体可以与M3受体合成多肽 相结合。Bacman等在其进行的一系列实验后指出抗M3受体抗体在干燥综合征患者血清中 的敏感性为80％-90％，特异性为90％，而且该抗体的存在与是否存在干燥综合征的其他自 身抗体如抗SSA、SSB抗体等无关。Naito等用在体外培养的干燥综合征患者外周血T细胞 中加入人工合成的M3受体细胞外第二环多肽，发现T细胞分泌γ干扰素减少，提示特异性 多肽可以减少外周血中抗M3受体抗体对T细胞的刺激作用。
目前研究发现毒蕈碱3(M3)受体与干燥综合征的发病有密切的关系，在SS患者及干 燥综合征动物模型中也相应检测到了抗M3受体的抗体，该抗体可以阻断正常的乙酰胆碱对 M3受体的激活作用，干扰信号传导，导致唾液、泪液分泌减少。Dawson等的研究发现M3 受体可能参与了干燥综合征患者免疫球蛋白G的抗分泌作用。而抗M3受体抗体则能抑制 Ca2+转导信号，从而抑制M3受体对唾液腺分泌的激活作用，但这种作用是可逆的。近年来， 对M3受体、抗M3受体抗体与SS关系的研究表明，抗M3受体抗体在SS诊断中具有重要 的意义，它的敏感性为86.00％，特异性为96.30％，均明显高于目前已知的与SS有关的其 他自身抗体。在抗SSA、SSB抗体阴性的患者中，抗M3受体抗体的阳性率分别为81.00％、 87.50％，提示抗M3受体抗体在SS的诊断中可以弥补其他抗体的不足，特别是对抗SSA抗 体阴性SS患者的诊断更有意义。
M3R的胞外区第二环(LFWQYFVGKRTVPPGECFIQFLSEPT)和第三环 (NTFCDSCIPKTFWN)被认为是受体与配体结合的主要区域，近年来对于M3R受体的研 究也主要集中在这这两个结构域。而国内外对于M3R胞外区第一环的研究很少。在干燥综 合症患者中，只有Tshboi的研究表示有47.6％的患者有第一环的自身抗体。而在实验动物中， 目前尚无对M3R第一环的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种抗毒蕈碱3型受体第一环抗体的 制备方法，该方法通过用M3R整个胞外区免疫C57BL/6J小鼠，发现经免疫后小鼠体内出现 了抗M3R第一环抗体。
其具体技术方案为：
一种抗毒蕈碱3型受体第一环抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：多肽合成；
步骤2.用M3受体胞外区免疫C57/B6小鼠；
步骤3.ELISA方法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体；
步骤4.用细胞免疫荧光法检测抗M3受体胞外区第一环多克隆抗体。
进一步，步骤2具体包括以下步骤：
1)使用的小鼠为C57/B6小鼠，购自维通利华公司，24只，雌性，6周龄；
2)动物分组：共分4组；4组分别是第一环组，胞外区组，对照肽组和PBS组；
3)动物免疫方法：
4组小鼠在第8周同时进行第一次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 2mg/ml，将溶解后的多肽以1∶1的比例与完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠，每 只小鼠免疫100ug多肽；
4组小鼠在第9周时第一次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 1mg/ml，每只小鼠注射50ug；
4组小鼠在第11周同时进行第二次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 2mg/ml，将溶解后的多肽以1∶1的比例与不完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠， 每只小鼠免疫100ug多肽；
4组小鼠在第12周时第二次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 1mg/ml，每只小鼠注射50ug；
4组小鼠在16周进行第3次免疫，方法同第二次；
4组小鼠在17周进行脂多糖注射，方法同第二次。
进一步，步骤3具体包括以下步骤：
1)以50μl0.1MNaHCO3，pH8.6，包被10μgM3受体整个胞外区蛋白，第一环多 肽，对照多肽于96孔板，置湿盒中，4℃过夜；
2)倾去包被液，倒扣于干净滤纸上，加入封闭缓冲液100μl，置湿盒中，37℃放置 2小时；
3)倾去封闭缓冲液，倒扣于干净滤纸上，磷酸盐缓冲液洗6次；
4)将血清用TBST已1∶50稀释；将稀释后的血清加入96孔微板，37℃放置2小时；
5)倾去分特异性结合的抗体，倒扣于干净滤纸上；用磷酸盐缓冲液洗6次，每次5 分钟；
6)用封闭缓冲液以1∶1000稀释HRP标记的抗小鼠IgG抗体并加入96孔微板，37℃ 放置1小时；
7)倾去未结合的抗体，倒扣于干净滤纸上；用磷酸盐缓冲液洗6次；
8)每孔加入50ul的显色剂，37℃放置20分钟；
9)将96孔微板放入MicroplateReader，Bio-radModel680吸光度检测仪上读取OD405 处的吸光值。
进一步，步骤4具体包括以下步骤：
1)人唾液腺细胞在盖片上生长融合到95％-100％时，从孵箱中取出；
2)用预温的1×磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分针；
3)4％的甲醛室温固定20-30分钟；
4)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
5)0.2％TritonX-100透膜2-5分钟；
6)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
7)5％牛血清白蛋白室温封闭30分钟；
8)加入小鼠血清放在湿盒里，4度过夜；
9)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
10)加二抗，用1％BSA稀释，30分钟，避光室温放置；
11)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
12)95％甘油封片，显微镜下观察。
与现有技术相比，本发明的有益效果为；
本发明通过用M3R整个胞外区免疫C57BL/6J小鼠，发现经免疫后小鼠体内出现了抗 M3R第一环抗体。
附图说明
图1是ELISA抗体检测结果显示用M3受体胞外区免疫小鼠后能产生抗M3受体第一 环的抗体；
图2是细胞免疫荧光实验证明用M3受体胞外区免疫小鼠后能产生抗M3受体第一环的 抗体，其中，图2a为胞外区组，图2b为第一环族，图2c为对照肽组，图2d为PBS组。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
步骤1：多肽合成：多肽合成由北京赛百盛公司用化学合成法进行合成，HPLC法进行 纯化，纯度为95％。
多肽的序列为胞外区第一环：FTTYIIMNRWALGNLACDLW；胞外区第二环：
LFWQYFVGKRTVPPGECFIQFLSEPITFGTAI；胞外区第三环：VLVNTF
CDSCIPKTYWNLGY
：步骤2：动物免疫：
1)使用的小鼠为C57/B6小鼠，购自维通利华公司，24只，雌性，6周龄；
2)动物分组：共分4组；4组分别是第一环组，胞外区组(包括第一环，第二环，第 三环)，对照肽组(对照肽与M3R无任何相关性)和PBS组；
3)动物免疫方法：
4组小鼠在第8周同时进行第一次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为2mg/ml， 将溶解后的多肽以1∶1的比例与完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠，每只小鼠 免疫100ug多肽；
4组小鼠在第9周时第一次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 1mg/ml，每只小鼠注射50ug；
4组小鼠在第11周同时进行第二次免疫；多肽用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 2mg/ml，将溶解后的多肽以1∶1的比例与不完全弗氏佐剂混合充分研磨后皮下免疫小鼠， 每只小鼠免疫100ug多肽；
4组小鼠在第12周时第二次注射脂多糖；脂多糖用磷酸盐缓冲液进行溶解，终浓度为 1mg/ml，每只小鼠注射50ug；
4组小鼠在16周进行第3次免疫，方法同第二次；
4组小鼠在17周进行脂多糖注射，方法同第二次。
步骤3：酶联免疫法检测抗M3受体第一环抗体
1)以50μl0.1MNaHCO3，pH8.6，包被10μgM3受体整个胞外区蛋白(包括第一 环，第二环，第三环多肽)，第一环多肽，对照多肽于96孔板，置湿盒中，4℃过夜；
2)倾去包被液，倒扣于干净滤纸上，加入封闭缓冲液100μl，置湿盒中，37℃放置 2小时；
3)倾去封闭缓冲液，倒扣于干净滤纸上，磷酸盐缓冲液洗6次；
4)将血清用TBST已1∶50稀释；将稀释后的血清加入96孔微板，37℃放置2小时；
5)倾去分特异性结合的抗体，倒扣于干净滤纸上；用磷酸盐缓冲液洗6次，每次5 分钟；
6)用封闭缓冲液以1∶1000稀释HRP标记的抗小鼠IgG抗体并加入96孔微板，37℃ 放置1小时；
7)倾去未结合的抗体，倒扣于干净滤纸上；用磷酸盐缓冲液洗6次；
8)每孔加入50ul的显色剂，37℃放置20分钟；
9)将96孔微板放入MicroplateReader，Bio-radModel680吸光度检测仪上读取OD405 处的吸光值。
结果如图1所示。
步骤4：细胞免疫荧光法检测抗M3受体第一环抗体
1)人唾液腺细胞在盖片上生长融合到95％-100％时，从孵箱中取出；
2)用预温的1×磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
3)4％的甲醛室温固定20-30分钟；
4)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
5)0.2％TritonX-100透膜2-5分钟；
6)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
7)5％牛血清白蛋白室温封闭30分钟；
8)加入小鼠血清(共4组，用1％牛血清白蛋白室稀释)放在湿盒里，4度过夜；
9)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
10)加二抗，用1％BSA稀释，30分钟，避光室温放置；
11)磷酸盐缓冲液洗3次，每次10分钟；
12)95％甘油封片，显微镜下观察。如图2所示。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本 技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化 或等效替换均落入本发明的保护范围内。