技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及IQCE基因及其表达产物在I型糖尿 病诊断中的用途。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺 陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种 组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病根据病 因学分为四种类型，即I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病和特殊类型的糖尿 病。
糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为I型糖尿 病是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β细胞自身免疫 性破坏为主要发病机制的一种疾病。I型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性十 分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。
目前临床上使用抗体筛选和诊断I型糖尿病。只要所述特异性抗体存在，随 着时间的推移，显性糖尿病往往就会发展。虽然抗体筛选能够检测I型糖尿病风 险的增加水平，但是所述风险是基于群体研究而不能告知个体患者疾病是否存在 患糖尿病的风险。因此，临床上需要一种方法能够实现个体化诊断。
近年来，随着对I型糖尿病相关基因的研究日趋深入，尽管已报道了一些与 I型糖尿病的发生发展相关的基因，但是并没有应用到临床上，因此发现一种特 异性的I型糖尿病标记物应用于临床诊断具有重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于I型糖尿病早 期诊断的分子标志物-IQCE基因。相比传统的I型糖尿病的诊断方法，使用分子 标志物来诊断I型糖尿病具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在疾病早期就能 知晓风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种IQCE基因及其表达产物在制备诊断I型糖尿病的产品中 的应用。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫 检测、原位杂交或芯片检测IQCE基因及其表达产物的表达水平以诊断I型糖尿 病的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增IQCE 基因的引物；所述用实时定量PCR诊断I型糖尿病的产品至少包括一对特异扩增 IQCE基因的引物；所述用免疫检测诊断I型糖尿病的产品包括：与IQCE蛋白特异 性结合的抗体；所述用原位杂交诊断I型糖尿病的产品包括：与IQCE基因的核酸 序列杂交的探针；所述用芯片诊断I型糖尿病的产品包括：蛋白芯片和基因芯片； 其中，蛋白芯片包括与IQCE蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与IQCE基因 的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述诊断产品包括芯片和/或试剂盒；其中所述芯片包括基因芯片、 蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。所述基因 检测试剂盒包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增IQCE基因和管家基 因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、 SYBRGreen荧光染料。
本发明提供了一种诊断I型糖尿病的产品，所述的产品能够通过检测IQCE基 因的表达水平来诊断I型糖尿病。
进一步，上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯 片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸 探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测IQCE基因转录水平的针对IQCE基因的寡 核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的IQCE蛋白 的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基 因检测试剂盒包括用于检测IQCE基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂 盒包括IQCE蛋白的特异性抗体。其中，所述基因芯片可用于检测包括IQCE基因 在内的多个基因(例如，与I型糖尿病相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白 质芯片可用于检测包括IQCE蛋白在内的多个蛋白质(例如与I型糖尿病相关的多 个蛋白质)的表达水平。通过将多个与I型糖尿病的标志物同时检测，可大大提 高I型糖尿病诊断的准确率。
进一步，上面所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位 杂交或芯片方法检测IQCE基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂 包括针对IQCE基因的引物和/或探针。
进一步，所述基因检测试剂盒包含SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于 扩增IQCE基因和管家基因的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含： PCR缓冲液、dNTPs、SYBRGreen荧光染料。所述扩增IQCE基因的引物对序列 如下：正向引物序列为5’-AACTCCAGACCGATATGAAG-3’；反向引物序列为5’- GCACCTCCTCGTAGTATG-3’；所述管家基因为GAPDH，扩增GAPDH的引物序 列对如下：正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’；反向引物序列 为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
进一步，所述基因检测试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，所述逆转录体系 包括T重复寡核苷酸OligodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、 dNTPs。所述基因检测试剂盒可用于检测包括IQCE基因在内的多个基因(例如， 与I型糖尿病相关的多个基因)的表达水平。
本发明中与IQCE基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA 嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、 与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、 20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、 300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特 异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过 30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自 身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明中所述IQCE蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述 IQCE蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如， 嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与IQCE蛋白的 结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并 且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头 合成或利用重组DNA技术合成。
在本发明的上下文中，“IQCE基因”包括人IQCE基因以及人IQCE基因的任 何功能等同物的多核苷酸。IQCE基因包括与目前国际公共核酸序列数据库 GeneBank中IQCE基因(NC_000007.14)DNA序列具有70％以上同源性，且编码 相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，IQCE基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：
(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的 DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同 源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述IQCE基因的编码序列是SEQIDNO.1所 示的DNA序列。
本发明的IQCE基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达IQCE 的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达 载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载 体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒) 载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达 载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表 达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改 造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中，IQCE基因表达产物包括人IQCE蛋白以及人IQCE 蛋白的部分肽。所述IQCE蛋白的部分肽含有与I型糖尿病相关的功能域。
“IQCE蛋白”包括IQCE蛋白以及IQCE蛋白的任何功能等同物。所述功 能等同物包括IQCE蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物， 等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人IQCE的 DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，IQCE蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由 SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的 个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列 同一性)，优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源 性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述IQCE蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨 基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的 功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序 列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似 功能的蛋白质，提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是IQCE蛋白的 融合蛋白。对于与IQCE蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋 白保留IQCE蛋白的生物学活性即可。
本发明的IQCE蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰， 只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留IQCE蛋白的生物学活性即可。在此类修饰 蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3 个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断I型糖尿病”既包括判断受试者是否已经患有I 型糖尿病、也包括判断受试者是否存在患有I型糖尿病的风险。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了IQCE基因表达与I型糖尿病相关，通过检测受试者血液 中IQCE的表达，可以判断受试者是否患有I型糖尿病、或者判断受试者是否存 在患有I型糖尿病的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方 案。
本发明发现了一种I型糖尿病的新的分子标记物-IQCE基因，相比传统的检 测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现I型糖尿病的早期诊断， 从而提高I型糖尿病的生存质量。
附图说明
图1显示利用QPCR检测IQCE基因在I型糖尿病患者中的表达情况。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold SpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条 件。
实施例1筛选与I型糖尿病相关的基因标志物
1、样品收集
各收集10例正常人血液和I型糖尿病患者血液样本，上述所有标本的取得 均通过伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备及质量分析
2.1RNA样品的制备
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管 中；
2)收集血细胞：3000rpm(400g)离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；
3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物；
4)3000rpm离心5min；
5)重复步骤3)、4)两次(共三次)；
6)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认 一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μlRNA裂解液到细胞中，吸放 重悬并裂解细胞；
7)加350μlRNA稀释液，颠倒混合3-4次；
8)置于70℃水浴中3min；
9)室温下13000g离心10min；
10)将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；
11)向澄清裂解液中加入200μl95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将 此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；
12)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到 收集管上，确认一下RNAWashSolution已用乙醇稀释，加600μlRNA洗涤液 于离心柱装配体，13000g离心1min；
13)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的 DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；
14)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μlDNA酶终止缓冲液(确认已 加入乙醇)，13000g离心1min；
15)加入600μlRNA洗涤液(已加入乙醇)，13000g，离心1min；
16)清空收集管，向离心柱内加入250μlRNA洗涤液(已加入乙醇)，高 速离心2min；
17)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将 离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心 柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。
2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求： OD260/OD280为1.8-2.2。
2.3RNA样品的质量分析(AgilentTechnologies2100Bioanalyzer)
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，AgilentTechnologies2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降 解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建 的要求，可以用于文库构建及测序。
3、高通量转录组测序
3.1RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片 段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预 先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹 配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根 据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库 将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认 参数。
3.2转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中 匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算 FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数 据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3.3差异表达基因的检测
将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检 测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为 是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，IQCE基因在I型糖尿病患者血液中的表达量显著高于 正常人的表达量。
实施例2QPCR测序验证IQCE基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择IQCE基因进行大样本QPCR验证。按照 实施例1中的样本收集方式选择I型糖尿病患者血液和正常人血液各70例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀；70℃水浴； 5min后立即冰浴2-3min；
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM) 5μl，RNasin40U/μl，M-MLV200U/μl，补无核酶水至25μl；
(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV；
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中IQCE基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引 物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
IQCE基因：
正向引物为5’-AACTCCAGACCGATATGAAG-3’(SEQIDNO.3)；
反向引物为5’-GCACCTCCTCGTAGTATG-3’(SEQIDNO.4)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBRGreen聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积 正向引物 1μl 反向引物 1μl SYBR Green聚合酶链式反应 12.5μl 体系模板 2μl 去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。 以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR 反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使 用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当 P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常人血液相比，IQCE基因在I型糖尿病患者血液中 的表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明 进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。