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1、(10)授权公告号 CN 101694494 B (45)授权公告日 2012.10.10 CN 101694494 B *CN101694494B* (21)申请号 200910236140.8 (22)申请日 2009.10.20 C07K 17/14(2006.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 21/31(2006.01) B81C 99/00(2010.01) B81B 7/02(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100094 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 王保民 南铁贵 赵洪伟。
2、 谭桂玉 刘威 高巍 谭伟明 李召虎 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 CN 101407548 A,2009.04.15,说明书第1页 第 2 段 - 第 10 页最后一段， 权利要求书 . CN 101407548 A,2009.04.15,说明书第1页 第 2 段 - 第 10 页最后一段， 权利要求书 . (54) 发明名称 一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种制备修饰有抗体的微悬臂 梁的方法。 该方法， 由如下步骤组成 ： 1)通过巯基 化将抗抗体连接到带有金膜的微悬臂梁上， 得到 修饰有抗抗体的微悬臂梁 。
3、； 2) 通过抗体与抗抗体 的相互结合作用， 将抗体连接到所述修饰有抗抗 体的微悬臂梁上， 得到修饰有抗体的微悬臂梁。 结 果表明， 本发明所制备的修饰有抗体的微悬臂梁 的方法与现有的方法相比具有反应步骤少、 操作 时间短、 避免因巯基化反应对抗体活性的损失、 使 抗体定向结合从而暴露更多的抗原作用位点的优 点。 因此， 本发明的方法及产品在微悬臂梁免疫传 感技术领域具有广阔的应用前景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马岚 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一。
4、种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法， 由如下步骤组成 ： 1) 通过巯基化将抗抗体连接到带有金膜的微悬臂梁上， 得到修饰有抗抗体的微悬臂 梁 ； 所述通过巯基化将抗抗体连接到带有金膜的微悬臂梁上， 得到修饰有抗抗体的微悬臂 梁的方法为 ： 将所述抗抗体利用巯基化试剂进行巯基化， 得到巯基化抗抗体， 将所述带有金 膜的微悬臂梁投入到巯基化抗抗体溶液中， 在 30-37.5的条件下反应 0.5-2.0h ； 2) 通过抗体与抗抗体的相互结合作用， 将抗体连接到所述修饰有抗抗体的微悬臂梁 上， 得到修饰有抗体的微悬臂梁 ； 所述通过抗体与抗抗体的相互结合作用， 将抗体连接到所述修饰有抗抗体的微悬臂梁 。
5、上的方法为将所述修饰有抗抗体的微悬臂梁置于所述抗体的溶液中， 在 30-37.5的条件 下反应 0.5-2.0h ； 所述抗体的溶液中所述抗体的浓度为 1ug/ml-3ug/ml ； 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述抗体为鼠源抗体。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述鼠源抗体为鼠源单克隆抗体或鼠源 多克隆抗体。 4. 根据权利要求 3 所述的方法， 其特征在于 ： 所述鼠源单克隆抗体为抗脱落酸单克隆 抗体或抗玉米素核苷单克隆抗体。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述巯基化试剂为盐酸硫醇亚胺、 。
6、11- 羧 酸硫醇、 2- 氨基乙硫醇、 3- 巯基丙酸、 磺基羟基琥珀酰亚胺基 -6-(3， 2- 吡啶二硫 - 丙酰 胺 )- 己酸酯或 3， 3 - 二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯。 6. 由权利要求 1-5 中任一所述方法制得的修饰有抗体的微悬臂梁。 权 利 要 求 书 CN 101694494 B 2 1/5 页 3 一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法。 背景技术 0002 微悬臂梁传感技术是在微电子机械系统 (MEMS) 技术和原子力显微镜 (AFM) 发展 的基础上迅速发展起来的一种新型传感技术， 是纳米传感技术研究的。
7、新热点。 研究发现， 当 微悬臂梁单侧表面上有生化反应发生时， 其表面应力的改变将会导致微悬臂梁产生弯曲变 形或者振动特性改变， 结合光学或电学方法进行读出。基于依靠免疫特异性识别建立的微 悬臂梁免疫传感技术， 结合酶联免疫检测技术 (ELISA) 的优点， 使检测技术得到了较大的 提升。 该项技术可以不需要标记物， 灵敏度高， 并且容易实现大尺度、 高通量、 平行阵列测量 的显著优势。近年来， 这项新兴技术在对癌症检测、 DNA 杂交和转录因子等方面都得到了广 泛的应用， 但是在食品与环境安全领域监测的研究并不多见。 0003 微悬臂梁免疫传感技术的广泛应用的前提是如何将灵敏度高、 特异性强。
8、的抗体有 效结合到微悬臂梁的金膜上， 同时尽量降低该抗体活性的损失。 目前， 国内外文献报道的方 法主要通过具有双功能基团的巯基化试剂进行， 通过在抗体上引入巯基以实现抗体和金膜 的结合， 从而达到检测的目的 ( 中国专利 CN101407548)， 但这种直接巯基化抗体的方法， 需 要对每种抗体都进行巯基化后才能检测， 使用麻烦， 另外直接巯基化抗体容易引起抗体活 性的损失， 因而限制了微悬臂梁免疫传感技术的广泛应用。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法。 0005 本发明所提供的制备修饰有抗体的微悬臂梁的方法， 由如下步骤组成 ： 0006 1) 通过。
9、巯基化将抗抗体连接到带有金膜的微悬臂梁上， 得到修饰有抗抗体的微悬 臂梁 ； 0007 2) 通过抗体与抗抗体的相互结合作用， 将抗体连接到所述修饰有抗抗体的微悬臂 梁上， 得到修饰有抗体的微悬臂梁。 0008 上述方法中， 所述抗抗体可为鼠源抗抗体 ； 所述抗体可为鼠源抗体。 0009 上述方法中， 所述鼠源抗抗体可为羊抗鼠抗抗体 ； 所述鼠源抗体可为鼠源单克隆 抗体或鼠源多克隆抗体。 0010 上述方法中， 所述鼠源单克隆抗体具体可为抗脱落酸单克隆抗体或抗玉米素核苷 单克隆抗体。 0011 上述方法中， 所述通过抗体与抗抗体的相互结合作用， 将抗体连接到所述修饰有 抗抗体的微悬臂梁上的方法。
10、为将所述修饰有抗抗体的微悬臂梁置于所述抗体的溶液中， 在 30 -37.5的条件下反应 0.5h-2.0h ； 优选为在 30 -37的条件下反应 1h-2.0h。 0012 上述方法中， 所述抗体的溶液中所述抗体的浓度为 1ug/ml-3ug/ml。 0013 上述方法中， 所述通过巯基化将抗抗体连接到带有金膜的微悬臂梁上， 得到修饰 说 明 书 CN 101694494 B 3 2/5 页 4 有抗抗体的微悬臂梁的方法为 ： 将所述抗抗体利用巯基化试剂进行巯基化， 得到巯基化抗 抗体， 将所述带有金膜的微悬臂梁投入到巯基化抗抗体溶液中， 反应， 得到修饰有抗抗体的 微悬臂梁。 0014 所。
11、述巯基化试剂包括盐酸硫醇亚胺、 11- 羧酸硫醇 (11-MUA)、 2- 氨基乙硫醇 (AET)、 3- 巯基丙酸 (MPA)、 磺基羟基琥珀酰亚胺基 -6-(3， 2- 吡啶二硫 - 丙酰胺 )- 己酸 酯 (Sulfo-LC-SPDP) 和 3， 3 - 二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯 (DTSSP) 等。 0015 上述方法中， 所述将所述带有金膜的微悬臂梁投入到巯基化抗抗体溶液中反应 中， 所述反应的条件为 ： 温度为30-37.5， 时间为0.5-2.0h ； 所述温度优选为37， 所述时 间优选为 1h。 0016 由上述任一所述方法制备得到的修饰有抗体的微悬臂梁也属于本发明的保护范。
12、 围。 0017 鉴于微悬臂梁免疫传感技术对抗体固定的重要性及巯基化试剂参与抗体固定的 复杂性， 本发明先将抗抗体修饰到微悬臂梁上， 然后通过抗抗体与抗体的特异性识别反应 相结合， 将抗体固定到微悬臂梁的金膜上。 结果表明， 本发明所制备的修饰有抗体的微悬臂 梁的方法与现有的方法相比具有反应步骤少、 操作时间短、 避免因巯基化反应对抗体活性 的损失、 使抗体定向结合从而暴露更多的抗原作用位点的优点。 因此， 本发明的方法及产品 在微悬臂梁免疫传感技术领域具有广阔的应用前景。 具体实施方式 0018 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0019 下述实施例中所用的材料、 。
13、试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0020 实施例 1、 制备修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁 0021 1、 羊抗鼠抗抗体的巯基化 0022 (1) 准确称取羊抗鼠抗抗体 ( 购自美国 Sigma 公司 )10.0mg 溶于 1.0mL PBS 缓冲 液中， 得到浓度为 10mg/mL 的抗抗体溶液 ； 0023 (2) 称取 2.0mg 盐酸硫醇亚胺 ( 购自美国 Sigma 公司 ) 溶于 1.0mL 蒸馏水中， 得到 浓度为 2.0mg/mL 的巯基化试剂 ( 现配现用 ) ； 0024 (3) 将 1.0mL 上述步骤 (1) 的抗抗体溶液和 15.3L 上述步骤 (2) 。
14、的巯基化试剂 混合， 使混合溶液中羊抗鼠抗抗体和盐酸硫醇亚胺的摩尔比为 1 1， 室温条件下轻微搅拌 反应 0.5h ； 0025 (4) 用 20mM 的 PBS 缓冲液 ( 含 0.15M NaCl 和 1.0mM EDTA， pH 7.2) 对上述步骤 (3)的反应液透析48h， 期间每2h更换一次透析液， 得到巯基化羊抗鼠抗抗体溶液。 用20mM 的 PBS 缓冲液 ( 含 0.15M NaCl 和 1.0mM EDTA， pH 7.2) 将巯基化羊抗鼠抗抗体溶液稀释至 1.0mg/mL 备用。 0026 2、 将巯基化羊抗鼠抗抗体修饰到微悬臂梁的金膜上 0027 将洗净并晾干的镀有金。
15、膜的微悬臂梁 ( 购自美国 IBM 公司 ) 投入到实验 1 中步 骤 (4) 得到的巯基化羊抗鼠抗抗体溶液中 ( 巯基化羊抗鼠抗抗体在溶液中的浓度为 5g/ mL)， 37温育 1h， 得到修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁。 0028 实施例 2、 制备修饰有抗脱落酸单克隆抗体的微悬臂梁 说 明 书 CN 101694494 B 4 3/5 页 5 0029 一、 制备 0030 抗脱落酸单克隆抗体购自美国 Sigma 公司， 产品目录号为 PGR1-1KT ； 0031 将实施例1中制备的修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁用PBS清洗后投入到抗脱落 酸单克隆抗体溶液 ( 抗脱落酸单克隆抗体在溶液中的。
16、浓度为 1g/mL)， 37温育 1h， 抗脱 落酸单克隆抗体与抗抗体相互结合， 进而连接到微悬臂梁的金膜上， 得到修饰有抗脱落酸 单克隆抗体的微悬臂梁。 0032 二、 ELISA 效果检测 0033 (1) 封闭 ： 取两根上述步骤一获得的修饰有抗脱落酸单克隆抗体的微悬臂梁， PBS 清洗后用氮气吹干， 然后浸入到 100L 质量百分含量为 5的 BSA 溶液 ( 用 PBS 溶解 ) 中， 37封闭 30min ； 0034 (2) 清洗 ： 用镊子小心取出微悬臂梁， 用洗涤液冲洗数次， 氮气吹干 ； 洗涤液组成 ： 每 1L 洗涤液中含有 8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4、。
17、 2.96g Na2HPO412H2O、 1.0mL Tween-20， 其余 为水 ； 0035 (3) 竞争 ： 将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中 ( 做好标记， 抑 制孔与非抑制孔 )， 抑制孔加入 50L 脱落酸标准样品溶液， 非抑制孔加入 50L 样品稀释 液作为对照 ； 然后再分别加入浓度为1.0g/mL的脱落酸-辣根过氧化物酶联结物， 37温 育竞争 30min ； 0036 脱落酸标准样品溶液 ： 用样品稀释液稀释脱落酸标准品得到的， 脱落酸在脱落酸 标准样品溶液中的浓度为 10ng/mL。 0037 脱落酸标准品购自美国 Sigma 公司。 0038 样品稀释。
18、液组成 ： 由终浓度为 0.1mol/L pH 7.5 的 PBS、 终浓度为 0.1体积百分 含量的吐温 -20 和终浓度为 0.1质量百分含量的明胶组成， 所述终浓度为各物质在稀释 液中的浓度 ； 0039 (4) 清洗 ： 用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁， 用洗涤液冲洗 数次， 氮气吹干 ； 0040 (5) 显色 ： 将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中， 每孔加 入 100L 显色溶液 (TMB 底物使用液与底物缓冲液按 1 9 的体积比混匀， 每 10mL 上述混 合液中加入 4.0mg 过氧化脲 )， 室温显色 ； 0041 (6) 终止 ： 15。
19、min 后， 每孔加入 50L 终止液终止反应， 取出微悬臂梁， 450nm 波长 处分别读取 OD 值。终止液组成 ： 2.0M 的硫酸溶液。 0042 实验设三次重复， 结果取平均数。结果表明， 抑制孔和非抑制孔在 450nm 波长下的 吸光度值分别为 0.172 和 0.879， 说明抗脱落酸单克隆抗体能有效结合到修饰有羊抗鼠抗 抗体的微悬臂梁的金膜上。 0043 三、 微悬臂梁传感器效果检测 0044 (1) 清洗 ： 无水乙醇、 丙酮和 PBS 分别洗脱微梁传感器样品池， 流速 1mL/min。 0045 (2)标准样品溶液 ： 用PBS稀释脱落酸标准品得到的 ； 脱落酸标准品在标准。
20、样品溶 液中的浓度分别为 100ng/mL、 10ng/mL、 1ng/mL。 0046 (3) 样品测定 ： 将已修饰有抗脱落酸单克隆抗体的微悬臂梁置入微梁传感器的样 品槽中， 流动相为PBS， 流速0.2mL/min， 当微梁传感器信号稳定后分别加入2mL上述所配制 说 明 书 CN 101694494 B 5 4/5 页 6 的标准样品溶液， 利用微悬臂梁传感器进行监测， 得到位移量。 0047 (4) 系统平衡 ： 反应实验结束后， 取出微悬臂梁， 用 PBS 平衡反应容器系统。每测 定一个浓度之后， 取出微梁， 然后按 (1) 进行新的操作。 0048 实验设三次重复， 结果取平均数。
21、。 结果检测三个浓度的标准样品溶液， 得到的位移 量分别为240、 46和22nm。 结果表明， 不同浓度的脱落酸标准样品可以产生不同程度的微悬 臂梁位移， 说明抗脱落酸单克隆抗体能有效结合到修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁的金膜 上。 0049 实施例 3、 制备修饰有抗玉米素核苷单克隆抗体的微悬臂梁 0050 一、 制备 0051 抗玉米素核苷单克隆抗体购自美国 Sigma 公司， 产品目录号为 PGR5-1KT ； 0052 将实施例1中制备的修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁用PBS清洗后投入到抗玉米 素核苷单克隆抗体溶液 ( 抗玉米素核苷单克隆抗体在溶液中的浓度为 1g/mL)， 30温育 2。
22、h， 抗玉米素核苷单克隆抗体与抗抗体相互结合， 进而连接到微悬臂梁的金膜上， 得到修饰 有抗玉米素核苷单克隆抗体的微悬臂梁。 0053 二、 ELISA 效果检测 0054 (1) 封闭 ： 取两根上述步骤 1 获得的固定有抗玉米素核苷单克隆抗体的微悬臂梁， PBS 清洗后用氮气吹干， 然后浸入到 100L 质量百分含量为 5的 BSA 溶液 ( 用 PBS 溶解 ) 中， 37封闭 30min ； 0055 (2) 清洗 ： 用镊子小心取出微悬臂梁， 用洗涤液冲洗数次， 氮气吹干 ； 洗涤液组成 ： 每 1L 洗涤液中含有 8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4、 2.96g Na2H。
23、PO412H2O、 1.0mL Tween-20， 其余 为水 ； 0056 (3) 竞争 ： 将氮气吹干后的微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中 ( 做好标记， 抑 制孔与非抑制孔 )， 抑制孔加入 50L 玉米素核苷标准样品溶液 ； 非抑制孔加入 50L 样品 稀释液作为对照 ； 然后再分别加入浓度为 2.0g/mL 的玉米素核苷 - 辣根过氧化物酶联结 物， 37温育竞争 30min ； 0057 玉米素核苷标准样品溶液 ： 用样品稀释液稀释玉米素核苷标准品得到的， 玉米素 核苷在玉米素核苷标准样品溶液中的浓度为 20ng/mL。 0058 玉米素核苷标准品购自美国 Sigma 公司。 0。
24、059 样品稀释液组成 ： 由终浓度为 0.1mol/L pH 7.5 的 PBS、 终浓度为 0.1体积百分 含量的吐温 -20 和终浓度为 0.1质量百分含量的明胶组成， 所述终浓度为各物质在稀释 液中的浓度 ； 0060 (4) 清洗 ： 用镊子小心取出上述抑制孔与非抑制孔中的微悬臂梁， 用洗涤液冲洗 数次， 氮气吹干 ； 0061 (5) 显色 ： 将氮气吹干后的两根微悬臂梁分别放入酶标板的两个小孔中， 每孔加 入 100L 显色溶液 (TMB 底物使用液与底物缓冲液按 1 9 的体积比混匀， 每 10mL 上述混 合液中加入 4.0mg 过氧化脲 )， 室温显色 ； 0062 (6)。
25、 终止 ： 15min 后， 每孔加入 50L 终止液终止反应， 取出微悬臂梁， 450nm 波长 处分别读取 OD 值。终止液组成 ： 2.0M 的硫酸溶液。 0063 实验设三次重复， 结果取平均数。结果表明， 抑制孔和非抑制孔在 450nm 波长下的 说 明 书 CN 101694494 B 6 5/5 页 7 吸光度值分别为 0.167 和 0.802， 说明抗玉米素核苷单克隆抗体能有效结合到修饰有羊抗 鼠抗抗体的微悬臂梁的金膜上。 0064 三、 微悬臂梁传感器效果检测 0065 (1) 清洗 ： 无水乙醇、 丙酮和 PBS 分别洗脱微梁传感器样品池， 流速 1mL/min ； 00。
26、66 (2) 样品溶液 ： 用 PBS 稀释玉米素核苷标准品得到的， 玉米素核苷在样品溶液中的 浓度分别为 1000ng/mL、 100ng/mL、 10ng/mL ； 0067 (3) 样品测定 ： 将已修饰有抗玉米素核苷单克隆抗体的微悬臂梁置入微梁传感器 的样品槽中， 流动相为PBS， 流速0.2mL/min， 当微梁传感器信号稳定后分别加入2mL上述所 配制的标准样品溶液， 利用微悬臂梁传感器进行监测， 得到位移量。 0068 (4) 系统平衡 ： 反应实验结束后， 取出微悬臂梁， 用 PBS 平衡反应容器系统。每测 定一个浓度之后， 取出微悬臂梁， 然后按 (1) 进行新的操作。 0069 实验设三次重复， 结果取平均数。 结果表明， 检测三个浓度的样品得到的位移量分 别为 102、 71 和 46nm ； 不同浓度的玉米素核苷标准样品可以产生不同程度的微悬臂梁位移， 说明抗玉米素核苷单克隆抗体能有效结合到修饰有羊抗鼠抗抗体的微悬臂梁的金膜上。 说 明 书 CN 101694494 B 7 。