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奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸的制备与应用.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410675354.6 (22)申请日 2014.11.21 C07C 59/52(2006.01) C07C 51/42(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人中国人民解放军第二军医大学地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人张国庆陈俊谭蔚锋赵亮吕磊徐雷 (74)专利代理机构上海元一成知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 31268 代理人赵青 (54) 发明名称奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸的制备与应用 (57) 摘要本发明提供一种在奇蒿。

2、中提取 3,4- 二羟基肉桂酸以及它在制备抗菌药物中的应用，涉及医药技术领域。本发明对奇蒿药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，氯仿，正丁醇进行萃取，浓缩后得到各个极性的提取物粉末，通过抗菌活性研究，发现乙酸乙酯和氯仿极性部位活性显著。对乙酸乙酯和氯仿部位通过硅胶柱层析法，采用薄层色谱点样法，抗菌活性实验，得到各活性流分，采用高效液相色谱质谱联用仪 (LC-MS TOF) 鉴定高纯度流分，并对该单体流分进行MS、 1HNMR和13CNMR分析，得到化合物咖啡酸。该实验方法通过硅胶柱色谱对极性部位进行分离，分离方法简单快捷，具有一定的实际操作意义。 (。

3、51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书11页附图4页 CN 105646194 A 2016.06.08 CN 105646194 A 1/1 页 2 1.3,4- 二羟基肉桂酸的制备方法，其特征在于，是从奇蒿中提取 3,4- 二羟基肉桂酸，并按照下述步骤进行：将干燥奇蒿原药材粉碎后浸泡在 80乙醇中， 65渗漉提取，提取结束后薄膜蒸发 , 干燥后待用，得 80乙醇提取物干燥粉末；其中奇蒿原药材与 80乙醇的用量比例为 1kg:5L ；取 80乙醇提取物干燥粉末 1kg，用 6L 石油醚浸泡 24h 过滤。

4、，滤渣干燥后用 6L 乙酸乙酯浸泡 24h 过滤，滤液浓缩得乙酸乙酯提取物约 6.2kg ；乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱，以石油醚 - 乙酸乙酯系统以： 10:1、 5:1、 2:1、 1:1、 1:2、 1:5、 1:10 各配置 400ml 以 2d/s 梯度洗脱，每隔 30min 收集一次样品，洗脱时间在 23.5h-25.5h 内收集得到的样品为 3,4- 二羟基肉桂酸。 2. 根据权利要求 1 所述的 3,4- 二羟基肉桂酸的制备方法，其特征在于 , 其中 3,4- 二羟基肉桂酸的结构式为： 3.根据权利要求1所述的3,4-二羟基肉桂酸的制备方法得到的3。

5、,4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的 3,4- 二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述菌株为无乳链球菌 (Streptococus agalactiae， SA) 临床型 03598276、福氏志贺菌 (Shigella flexneri， SF) 临床型 03475491、鼠伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium， ST) 临床型 5002324172。权利要求书 CN 105646194 A 2 1/11 页 3 奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸的制备与应用技术领域 0001 本发明涉及医药技术。

6、领域，具体是指在奇蒿中提取 3,4- 二羟基肉桂酸以及它在制备抗菌药物中的应用。背景技术 0002 菊科艾属植物奇蒿Artemisia anomala S.Moore的地上干燥部分,多年生草本植物,全草显黄酮苷反应。产于江苏南部，生长于山坡、路边及林缘。分布于华东、中南及西南各省区。又名南刘寄奴、金寄奴、六月霜 ( 浙江、江西 )、野马兰头 ( 浙江 )、九牛草 ( 湖南 )、苦速婆 / 苦婆菜 ( 福建 )、六月雪 / 六月霜 ( 安徽、江西、湖南 )、大叶蒿、铁杆茵陈 ( 江苏 ), 其性味辛、苦、平。始载于南北朝的雷公炮制论 , 以后历代主。

7、要本草如唐本草、证类本草、本草纲目和中华本草等均有收载。中医认为奇蒿具有清利湿热、活血化瘀、通经止痛 , 解毒消肿的功效。最新研究显示奇蒿还具有抗炎 , 抗氧化 , 抗硝化 , 抗血小板聚集 , 促血管舒张 , 通过多靶点调节以抑制血管炎症的功效 . 更有学者发现其对 HSV( 单纯疱疹病毒)也有良好的治疗效果(Zheng M.Experimental study of 472 herbs with antiviral action against the herpes simplex virus.Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi.1990 Jan ；。

8、10(1):39-41,6.Chinese.). 现代临床实践发现奇蒿可治疗急性细菌性痢疾 , 腹泻，烧伤 , 跌打损伤 , 蛇咬伤 , 早期乳痈等疾病 , 这些提示奇蒿可能对多种致病菌具有抑制作用 , 可以预防和治疗感染。刘运徳等已研究发现奇蒿具有很好的抗真菌效果 . 既往采用奇蒿全草入药 ( 水煎液或者浓缩片剂 ) 进行临床治疗和抗菌实验 , 难以分析奇蒿的有效抗菌成分的来源。 0003 既往研究或临床实践采用奇蒿全草入药 ( 水煎液或者浓缩片剂等 ) 进行临床治疗和抗菌实验，难以分析奇蒿的有效抗菌成分的来源，因此，申请者近年来对奇蒿进行系统性分离提取，然后以 80乙醇。

9、提取物及各极性部位进行体外抗菌实验，分析奇蒿有效抗菌成分的来源，为下一步提取纯化物建立了一定的基础。申请人的前期研究发现：奇蒿不同提取物对临床多种致病菌表现出了良好的杀菌作用。例如： (1) 乙酸乙酯提取物对福氏志贺菌、痢疾志贺菌和无乳链球菌的最小杀菌浓度均为 6.25mg/mL，而对大肠正常菌群无抑制作用。其中志贺菌属是引起细菌性痢疾的最主要致病菌，细菌性痢疾也是野战和抢险救灾时，部队最易广泛发生的疾病之一。而无乳链球菌通常被称为 B 群链球菌 (group B streptococcus， GBS)，属条件性致病菌。目前，治疗 GBS 感染，可供选择的药物。

10、较多 9。然而，在特殊情况下，例如发生大规模自然灾害或者爆发战争，因缺少药品仍可能出现 GBS 感染的大量爆发，妊娠期妇女生殖泌尿系统感染 GBS，可引发胎膜早破、早产、死胎、宫内感染等一系列妊娠并发症，产妇感染 GBS 可导致产后子宫内膜炎、盆腔炎乃至败血症；新生儿感染 GBS 可导致肺炎、败血症和脑膜炎。(2) 氯仿提取物对大肠埃希氏菌具有良好的杀菌作用，最小杀菌浓度为 6.25mg/mL，大肠埃希氏菌是人体肠道内的正常寄殖菌，战时腹部受到外伤后，若肠道破裂或者穿孔可引起肠道大肠埃希菌移位，从而导致腹腔感染，乃至全身性感染，也可因战伤导致。

11、机体抵抗力严重下降而感染。第二军医大学第三附属医院资说明书 CN 105646194 A 3 2/11 页 4 料显示：大肠埃希菌是院内感染病原菌检出率最高的菌种，约占院内感染检出细菌株总数的 28.3-34.6 ；而在胆道感染中所占的比例更高，检出率在 50以上。近年来，抗生素滥用，导致大肠埃希菌耐药率居高不下，程训民等 12 在 124 株大肠埃希菌中共检出 54 株 (43.5 ) 产超广谱 - 内酰胺酶 (extended-spectrum -lactamases， ESBLs)。现有抗生素常无效，因此亟需开发新型抗生素替代。 (3)氯仿和乙酸乙酯提取物均。

12、对金黄色葡萄球菌具有良好的杀菌作用，最小杀菌浓度均为12.5mg/mL。金黄色葡萄球菌是开放性外伤最常见的污染细菌，也是战时开放性污染创面的最常见致病细菌。 0004 奇蒿广泛生长于华东、中南和西南地区，原料分布区域广大，取材方便。华东、中南和西南地区分别为南京军区，广州军区和成都军区的辖区。在军事上以上三个地区均面对着极为错综复杂的国际或者国内形势，例如南京和广州军区一方面需要做好对台军事斗争的准备，另一方面需要面对来自日本和东南亚诸国对我国东海及南海的岛屿及海底资源的争夺。而成都军区方面需要面对和藏独势力的长期斗争，同时也要对印度采取防范。因此以上三个。

13、军区都存在应对局部战争的可能。在和平时期，以上三个地区均为自然灾害的高发区域，例如：华东及中南地区为洪涝灾害的高发区域，西南地区为地震，泥石流等地质灾害的高发区域，需要应对可能发生的大范围的自然灾害。因此，深入研究奇蒿的抗菌活性成分，开发价廉质优的高效抗生素，既有利于战争和大规模自然灾害发生时，利用其原料分布区域广泛的特点，保障军队和人民群众短期内集中使用抗生素治疗相应细菌感染的需要，也能有效满足平时人民群众一般抗菌治疗的需求。 0005 申请号为 201110187502.6，公开号为 CN102309533A 的中国专利申请一种奇蒿总黄酮的制备方法，。

14、该方法主要采用超临界二氧化碳流体萃取法萃取奇蒿粉末，乙醇作为携带剂，萃取物采用大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，减压浓缩，冷冻干燥得到奇蒿总黄酮。其制备方法简单，快捷，无毒。但是该方法是针对奇蒿总黄酮的制备方法，不便于奇蒿单体活性成分的提取制备，因此发明对奇蒿中单体活性成分的制备方法具有重要意义。 0006 本发明人一直致力于对奇蒿进行系统性分离提取 , 并完成了不同提取物及各极性部位进行的体外抗菌实验,通过体外抗菌实验筛选出奇蒿有效抗菌成分的来源,并完成了抗菌有效单体的分离与鉴定。发明内容 0007 本发明的另一目的在于提供一种奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸的。

15、制备方法。 0008 本发明的目的在于提供一种奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。 0009 奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 ) 的制备方法，按照下述步骤进行： 0010 将干燥奇蒿原药材粉碎后浸泡在 80乙醇中 ,65渗漉提取，提取结束后薄膜蒸发 , 干燥后待用，得 80乙醇提取物干燥粉末；其中奇蒿原药材与 80乙醇的用量比例为 1:5kg/L。 0011 取 80乙醇提取物干燥粉末 1kg，用 6L 石油醚浸泡 24h 过滤，滤渣干燥后用 6L 乙酸乙酯浸泡 24h 过滤，滤液浓缩得乙酸乙酯提取物约 6.2kg。乙酸乙酯粗提物用。

16、甲醇溶解后上硅胶柱,以石油醚-乙酸乙酯系统以： 10:1、 5:1、 2:1、 1:1、 1:2、 1:5、 1:10各配置400ml 以 2d/s( 滴 / 秒 ) 梯度洗脱，每隔 30min 收集一次样品，洗脱时间在 23.5h-25.5h 内收集得说明书 CN 105646194 A 4 3/11 页 5 到的第 48 号到第 51 号样品为 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 )。 0012 在洗脱收集的 96 个样品中，通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物 ( 部分为胶状物 )，所。

17、有样品保存在 1.5mL 的 EP 管中， Co60 灭菌待用。 0013 薄层色谱点样法，参照：孙毓庆 , 胡育柱 . 分析化学 . 北京 : 科学出版社 ,2007.467 470。 0014 其中 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 ) 的结构式为： 0015 0016 奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。 0017 其中所述菌株为无乳链球菌 (Streptococus agalactiae， SA) 临床型 03598276、福氏志贺菌 (Shigella flexneri， SF) 临床型 03475491、鼠伤。

18、寒沙门菌 (Salmonella typhimurium， ST) 临床型 5002324172。 0018 无乳链球菌 (Streptococus agalactiae， SA) 临床型 03598276、福氏志贺菌 (Shigella flexneri， SF) 临床型 03475491、鼠伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium， ST) 临床型 5002324172 均来源于长海医院检验科临床分离获得的致病菌株，也可购自中科院药物研究所。 0019 金黄色葡萄球菌 (staphylococcus aureus,SA) 标准型 ATCC 25923、金黄色葡萄。

19、球菌 (staphylococcus aureus,SA) 标准型 ATCC 29213，均购自于温州市康泰生物科技有限公司。 0020 有益效果： 0021 本发明对奇蒿药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，氯仿，正丁醇进行萃取，浓缩后得到各个极性的提取物粉末，通过抗菌活性研究，发现乙酸乙酯和氯仿极性部位活性显著。对乙酸乙酯和氯仿部位通过硅胶柱层析法，采用薄层色谱点样法，抗菌活性实验，得到各活性流分，采用高效液相色谱质谱联用仪 (LC-MS TOF) 鉴定高纯度流分，并对该单体流分进行 MS、 1HNMR 和13CNMR 分析，得到化合物咖啡酸。该方法研究目标。

20、明确，操作简单快捷，为中药奇蒿的活性成分追踪研究提供了中药方法。 0022 该实验方案是以前期对奇蒿不同极性段抗菌实验结果为基础，对活性显著的氯仿部位和乙酸乙酯极性部位进行进一步的活性追踪，对活性显著的单体化合物进行结构鉴定，以初步鉴定出奇蒿中抗菌主要活性成分。该实验方法通过硅胶柱色谱对极性部位进行分离，分离方法简单快捷，具有一定的实际操作意义。附图说明 0023 图 1 氯仿提取物 13 号 TIC 图谱 0024 图 2 乙酸乙酯提取物 51 号 TIC 图谱 0025 图 3 乙酸乙酯提取物 51 号在 t 2.532 的 MS 图谱说明书 CN 10564。

21、6194 A 5 4/11 页 6 0026 图 4 T 2.532 时乙酸乙酯提取物 51 号的 UV 图谱 0027 图 5 咖啡酸对照品的 TIC 图谱具体实施方式 0028 现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。 0029 以下实施例和对比例中，金黄色葡萄球菌 ( 标准型 ATCC25923，购自温州市康泰生物科技有限公司 )、金黄色葡萄球菌 ( 标准型 ATCC29213，购自温州市康泰生物科技有限公司 )、大肠埃希氏菌 ( 标准型 ATCC25922，购自温州市康泰生物科技有限公司 )、铜绿假单胞菌 ( 标准型 ATCC27853。

22、，购自温州市康泰生物科技有限公司 )、无乳链球菌 (Streptococus agalactiae， SA, 临床型 03598276)、福氏志贺菌 (Shigella flexneri， SF, 临床型 03475491)、鼠伤寒沙门菌 (Salmonella typhimurium， ST，临床型 5002324172) 水解络蛋白琼脂 (Mueller-H in ton,M-H) 培养基 ,M-H 培养液 ( 型号 CMO337, 购自英国 OXOID)。无乳链球菌 ( 临床型 )、福氏志贺菌 ( 临床型 )、鼠伤寒沙门菌 ( 临床型 ) 均来源于长海医院。

23、检验科临床分离获得的致病菌株，也可购自中科院药物研究所。 0030 实施例 1 ：奇蒿提取物 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 ) 的制备方法 0031 40kg 干燥奇蒿原药材 ( 购自于亳州市中药材饮片公司，产地：浙江临安，又名产南刘寄奴 ), 粉碎后浸泡在 80乙醇中 ,65渗漉提取 , 先后使用 80乙醇 200L, 提取结束后薄膜蒸发 , 干燥后待用。 0032 取 80乙醇提取物干燥粉末约 1kg, 用 6L 石油醚浸泡 24h 过滤，滤渣干燥后用 6L 乙酸乙酯浸泡 24h 过滤 , 滤液浓缩得乙酸乙酯提取物 6.2kg。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱。

24、,以石油醚-乙酸乙酯系统以： 10:1、 5:1、 2:1、 1:1、 1:2、 1:5、 1:10各配置400ml 以 2d/s( 滴 / 秒 ) 梯度洗脱，每隔 30min 收集一次样品，共得 96 个样品。通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物 ( 部分为胶状物 )，乙酸乙酯提取物通过合并得 26 个样品 ( 见表 1)，保存在 1.5mL 的 EP 管中， Co60 灭菌待用。经鉴定，洗脱时间在 23.5h-25.5h 内收集的第 48 号到第 51 样品为 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 。

25、咖啡酸 )。 0033 对比例奇蒿氯仿 , 乙酸乙酯提取物 0034 40kg干燥奇蒿原药材,粉碎后浸泡在80乙醇中,65渗漉提取,先后使用80 乙醇 200L, 提取结束后薄膜蒸发 , 干燥后待用。取 80乙醇提取物干燥粉末约 1kg, 用 6L 石油醚浸泡24h过滤，滤液浓缩并干燥后得到石油醚提取物。滤渣干燥后以6L氯仿浸泡24h 过滤 , 滤液减压蒸馏 , 浓缩得氯仿提取物约 560g。滤渣干燥后用 6L 乙酸乙酯浸泡 24h 过滤 , 滤液浓缩得乙酸乙酯提取物 6.2kg。氯仿粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱 , 采用不同浓度的甲醇-氯仿溶液： 10:1-5:1-2:1-1:1-。

26、1:2-1:5-1:10各配置400ml以2d/s(滴/秒)梯度洗脱 , 每隔 30min 收集一次样品，共的 81 个样品。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱,以不同浓度的石油醚-乙酸乙酯溶液： 10:1-5:1-2:1-1:1-1:2-1:5-1:10各配置400ml 以 2d/s( 滴 / 秒 ) 梯度洗脱 , 每隔 30min 收集一次样品，共得 96 个样品。通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物 ( 部分为胶状物 )。 0035 氯仿提取物共得到 81 个组份，合并组份编号分别 16-2。

27、0 组份同时合并到组分 21 说明书 CN 105646194 A 6 5/11 页 7 中， 22-24 合并到 25 中， 26 合并入 27 中， 28-30 合并入 31 中， 32-34 合并入 35 中， 36 合并入 37 中， 38-40 合并入 41 中， 42-44 合并入 45 中， 46-47 合并到 48 中， 49-61 合并入 62 中， 63-68 合并入 69 中， 70-78 以及 80-81 组份均合并入 79 中，合并后共计得到 26 个样品。乙酸乙酯提取物共得到 96 个组份，合并组份编号分别为 2-3 合并入 4 中， 5-6 合并入 7。

28、中， 9-10 合并入 11 中， 12-17 合并 18 中， 19-17 合并入 28 中， 29 合并 30 中， 31 合并入 32 中， 33-37 合并入 38 中， 39-45 合并入 46 中， 48-50 合并入 51 中， 52-56 合并入 57 中， 58-62 合并入 63 中， 64 合并入 65 中， 67 合并入 68 中， 69 合并入 70 中， 73-74 合并 75 中， 76-79 合并入 80 中， 81 合并入 82 中， 83-85 合并入 86 中， 87-91 以及 93-96 组分均合并入 92 中，合并后共计得到 26 个样品。。

29、( 见表 1)。所有样品保存在 1.5mL 的 EP 管中， Co60 灭菌待用。 0036 表 1 氯仿和乙酸乙酯提取物样品编号 0037 样品编号氯仿提取物1,2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,21,25,27,31,35,37,41,45,48,62,69,79 乙酸乙酯提取物 1,4,7,8,11,18,28,30,32,38,46,47,51,57,63,65,66,68,70,71,72,75,80,82,86,92 0038 分离接收得到的样品经薄层点样法， Rf 值相同的成分合并，氯仿极性部分和乙酸乙酯极性部位合并分离组分均得到 26 个样品。

30、组分。 0039 其中合并乙酸乙酯提取物后的 51 号样品即为实施例 3 所得 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 )。 0040 试验例 1 ： 0041 体外抗菌实验 0042 1. 纸片扩散法实验及结果 0043 分别取奇蒿氯仿提取物及乙酸乙酯提取物各个样本 10mg, 溶解时分别加入助溶剂羧甲基纤维素钠 1mg, 采用灭菌蒸馏水溶解 , 加至 1ml 配制成浓度为 1的药液。首先将加有 50l 原始浓度药液 (10mg/ml) 的圆纸片放在含标准量细菌接种物的 M-H 琼脂板上 ( 无乳链球菌需要加入血液培养 ),35培养 18h, 根据药敏纸片周围显出的抑菌圈大小来判断抗菌作。

31、用的强弱 , 将纸片扩散法中证实抑菌圈在 9mm( 包括 9mm, 纸片直径 6mm) 以上的抗菌样品筛出.通过此法初步筛选对细菌敏感的样本,以待进一步测定最小杀菌浓度 (MBC)。 0044 纸片扩散法实验结果如下： 0045 氯仿提取物的各个样本和菌株配比均进行了3次实验以取平均值获得结果,结果详见表 2。 0046 表 2 氯仿提取物纸片扩散法抑菌试验结果 0047 说明书 CN 105646194 A 7 6/11 页 8 0048 1) 纸片直径为 6mm,2) 抑菌圈直径为 9mm 0049 乙酸乙酯提取物的各个样本和菌株配比均进行了 3 次实验以取平均值获得结果 , 结。

32、果详见表 3。 0050 表 3 乙酸乙酯提取物纸片扩散法抑菌试验结果 0051 说明书 CN 105646194 A 8 7/11 页 9 0052 0053 1) 纸片直径为 6mm,2) 抑菌圈直径为 9mm 0054 通过纸片扩散法的得到的敏感细菌谱 ( 抑菌圈直径 9mm) 见表 4: 0055 表 4 纸片扩散法敏感细菌谱 0056 0057 2. 常量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration,MIC8) 和最小杀菌浓度 (minimalbactericidal concentration,MBC。

33、9) 0058 常量肉汤稀释法实验步骤： 0059 纸片扩散法实验中抑菌圈直径 9mm 的配对进一步测定最小杀菌浓度 , 每一个配对同时进行 3 组实验取平均值。用接种环挑取形态相似待检菌落 3-5 个，接种于 4-5ml 的水解酪蛋白 (MH) 肉汤中， 35孵育 2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或 MH 肉汤校正浓度至 0.5 麦氏比浊标准，约含 1 2108CFU/ml。用 MH 肉汤将上述菌悬液进行 1 100 稀释后备用。稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管 9 支，排成一排，除第 1 管加入 1.6mlMH 肉汤外，其余每管加入 MH 肉汤 1ml，在。

34、第 1 管加入抗菌药物原液 ( 如 10mg/ 说明书 CN 105646194 A 9 8/11 页 10 ml)0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第 7 管，并从第 7 管中吸取 1ml 弃去，第 8 管为阳性对照组不含药物的生长对照 , 第 9 管为阴性对照管无菌生长。此时各管药物浓度依次为 2、 1、 0.5、 0.25、 0.125、 0.0625、 0.03125g/ ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各 1ml，使每管最终菌液浓度约为 5105CFU/ ml。第1管至第7管药物浓度分别为1、 0.5、。

35、0.25、 0.125、 0.0625、 0.03125、 0.01562g/ml。将接种好的稀释管塞好塞子，置 35普通空气孵箱中孵育 16 20h。将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放 37培养箱中，培养 48h, 观察结果。当阳性对照管有菌生长 ( 浑浊 )，阴性对照管无菌生长 ( 透明 )，试验组以肉眼观察无菌生长的药液最高稀释度为 MIC。从无菌生长的各管内取 100l，分别加入琼脂平板，放 37培养箱中，培养 48h, 观察细菌生长情况，无菌落形成的药液最小浓度为 MBC9。MIC 的结果见表 5， MBC 的结果见表 6. 0060 表 5 。

36、奇蒿不同提取物常量肉汤稀释法 MIC 试验结果 0061 0062 说明书 CN 105646194 A 10 9/11 页 11 0063 表 6 奇蒿不同提取物常量肉汤稀释法 MBC 试验结果 0064 0065 3. 对有抑菌作用的样品进行称重以得到奇蒿中总有效抑菌物质的含量见表 7. 0066 表 7 奇蒿中有抑菌效果的样品的称重结果 0067 说明书 CN 105646194 A 11 10/11 页 12 0068 抗菌有效单体的鉴定 0069 1.LC/MSD TOF10液相色谱 / 质谱联用仪 ( 飞行时间质谱 ) 的检测 0070 (1) 液相色谱条件 0071 色谱。

37、柱：资生堂 TYPE MG(3.0100mm， 3.0m) ；流动相 : 纯水：甲醇 90:10 ；进样量： 5L ；流速： 0.6mL/min ；柱温： 25 ；检测波长 235nm ；运行时间 16min。 0072 (2)Single Quadrupole-MS 条件 0073 采用 ESI 离子源，负离子模式下 (ESI-) ：柱后分流比为 2:1，干燥器温度： 350 ；毛细管电压： 4000V ；干燥器流速： 9.0L/min ；雾化器压力： 35psig ；裂解气电压： 200V。 0074 (3)TIC( 总离子流色谱图 ) 。

38、检测 0075 下面是一些样品的 TIC 图谱 :( 见图 1- 图 2) 0076 (4)TIC 下点数据 MS 图谱检测 0077 通过分析各样品的TIC图谱可以得出乙酸乙酯提取物51号杂质较少，基本为纯品可做进一步分析。 0078 乙酸乙酯提取物 51 号主峰 (T 2.532) 的质谱图谱见图 4，可以得出乙酸乙酯提取物 51 号的主要离子峰为 179.0341， tR 2.532. 因为是负离子模式，主要形成 M-H的离子峰，故此物质的 M 179.0341+1.0078 180.0419， ( 见图 3)。 0079 2. 通过分析物质的理化性质结合质谱 ,UV 光谱。

39、结果推测化合物分子式及结构式乙酸乙酯提取物 51 号 : 0080 物理性质：黄色结晶 ( 在浓水溶液中 ), 从稀水溶液得一水合物。分解点 223 225 ( 在 194软化 ) ；微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。 0081 化学性质：化合物在 TCL 板上与 FeCl3-K3Fe(CN)6反应呈兰色 , 表示为酚类；说明书 CN 105646194 A 12 11/11 页 13 HCl-Mg 粉反应呈阴性表明为非黄酮类化合物； 0082 UV光谱： T2.532以甲醇为溶剂max:200nm ； 244nm(见图4).带(200)表明此化合物有苯环的结构，带。

40、 (244) 表明此化合物有的结构。 0083 MS图谱： T2.532下的质谱图显示离子峰为179.0341.因为是负离子模式，主要形成 M-H的离子峰 11，故 M 179.0341+1.0078 180.0419 ； 0084 结合以上性质可推测化合物分子式为 C9H8O4通过分析分子式为 C9H8O4的酚类化合物 , 可推测化合物为 3,4- 二羟基肉桂酸 ( 咖啡酸 )。 0085 其结构式为： 0086 0087 3. 通过与对照品的 TIC 图谱比对以确定有效抗菌物质成分 0088 乙酸乙酯提取物 51 号 TIC 图谱 ( 见图 2) 与对照品咖啡酸 TIC 图谱。

41、( 见图 5) 比对可确定乙酸乙酯提取物 51 号中的主要成分为咖啡酸。 0089 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。说明书 CN 105646194 A 13 1/4 页 14 图 1 说明书附图 CN 105646194 A 14 2/4 页 15 图 2图 3 说明书附图 CN 105646194 A 15 3/4 页 16 图 4 说明书附图 CN 105646194 A 16 4/4 页 17 图 5 说明书附图 CN 105646194 A 17 。

摘要
申请专利号：	CN201410675354.6	申请日：	20141121
公开号：	CN105646194A	公开日：	20160608
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07C59/52,C07C51/42,A61P31/04	主分类号：	C07C59/52,C07C51/42,A61P31/04
申请人：	中国人民解放军第二军医大学
发明人：	张国庆,陈俊,谭蔚锋,赵亮,吕磊,徐雷
地址：	200433 上海市杨浦区翔殷路800号
优先权：	CN201410675354A
专利代理机构：	上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙)	代理人：	赵青
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内容摘要

本发明提供一种在奇蒿中提取3,4-二羟基肉桂酸以及它在制备抗菌药物中的应用，涉及医药技术领域。本发明对奇蒿药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，氯仿，正丁醇进行萃取，浓缩后得到各个极性的提取物粉末，通过抗菌活性研究，发现乙酸乙酯和氯仿极性部位活性显著。对乙酸乙酯和氯仿部位通过硅胶柱层析法，采用薄层色谱点样法，抗菌活性实验，得到各活性流分，采用高效液相色谱质谱联用仪(LC-MS TOF)鉴定高纯度流分，并对该单体流分进行MS、1HNMR和13CNMR分析，得到化合物咖啡酸。该实验方法通过硅胶柱色谱对极性部位进行分离，分离方法简单快捷，具有一定的实际操作意义。

权利要求书

1.3,4-二羟基肉桂酸的制备方法，其特征在于，是从奇蒿中提取3,4-二羟基肉桂酸，并按照下述步骤进行：将干燥奇蒿原药材粉碎后浸泡在80％乙醇中，65℃渗漉提取，提取结束后薄膜蒸发,干燥后待用，得80％乙醇提取物干燥粉末；其中奇蒿原药材与80％乙醇的用量比例为1kg:5L；取80％乙醇提取物干燥粉末1kg，用6L石油醚浸泡24h过滤，滤渣干燥后用6L乙酸乙酯浸泡24h过滤，滤液浓缩得乙酸乙酯提取物约6.2kg；乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯系统以：10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10各配置400ml以2d/s梯度洗脱，每隔30min收集一次样品，洗脱时间在23.5h-25.5h内收集得到的样品为3,4-二羟基肉桂酸。 2.根据权利要求1所述的3,4-二羟基肉桂酸的制备方法，其特征在于,其中3,4-二羟基肉桂酸的结构式为： 3.根据权利要求1所述的3,4-二羟基肉桂酸的制备方法得到的3,4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。 4.根据权利要求3所述的3,4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述菌株为无乳链球菌(Streptococusagalactiae，SA)临床型03598276、福氏志贺菌(Shigellaflexneri，SF)临床型03475491、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，ST)临床型5002324172。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体是指在奇蒿中提取3,4-二羟基肉桂酸以及它在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

菊科艾属植物奇蒿ArtemisiaanomalaS.Moore的地上干燥部分,多年生草本植物, 全草显黄酮苷反应。产于江苏南部，生长于山坡、路边及林缘。分布于华东、中南及西南各省区。又名南刘寄奴、金寄奴、六月霜(浙江、江西)、野马兰头(浙江)、九牛草(湖南)、苦速婆/苦婆菜(福建)、六月雪/六月霜(安徽、江西、湖南)、大叶蒿、铁杆茵陈(江苏),其性味辛、苦、平。始载于南北朝的《雷公炮制论》,以后历代主要本草如《唐本草》、《证类本草》、《本草纲目》和《中华本草》等均有收载。中医认为奇蒿具有清利湿热、活血化瘀、通经止痛,解毒消肿的功效。最新研究显示奇蒿还具有抗炎,抗氧化,抗硝化,抗血小板聚集, 促血管舒张,通过多靶点调节以抑制血管炎症的功效.更有学者发现其对HSV(单纯疱疹病毒) 也有良好的治疗效果(ZhengM.Experimentalstudyof472herbswithantiviralactionagainst theherpessimplexvirus.ZhongXiYiJieHeZaZhi.1990Jan；10(1):39-41,6.Chinese.).现代临床实践发现奇蒿可治疗急性细菌性痢疾,腹泻，烧伤,跌打损伤,蛇咬伤,早期乳痈等疾病,这些提示奇蒿可能对多种致病菌具有抑制作用,可以预防和治疗感染。刘运徳等已研究发现奇蒿具有很好的抗真菌效果.既往采用奇蒿全草入药(水煎液或者浓缩片剂)进行临床治疗和抗菌实验,难以分析奇蒿的有效抗菌成分的来源。

既往研究或临床实践采用奇蒿全草入药(水煎液或者浓缩片剂等)进行临床治疗和抗菌实验，难以分析奇蒿的有效抗菌成分的来源，因此，申请者近年来对奇蒿进行系统性分离提取，然后以80％乙醇提取物及各极性部位进行体外抗菌实验，分析奇蒿有效抗菌成分的来源，为下一步提取纯化物建立了一定的基础。申请人的前期研究发现：奇蒿不同提取物对临床多种致病菌表现出了良好的杀菌作用。例如：(1)乙酸乙酯提取物对福氏志贺菌、痢疾志贺菌和无乳链球菌的最小杀菌浓度均为6.25mg/mL，而对大肠正常菌群无抑制作用。其中志贺菌属是引起细菌性痢疾的最主要致病菌，细菌性痢疾也是野战和抢险救灾时，部队最易广泛发生的疾病之一。而无乳链球菌通常被称为B群链球菌(groupB streptococcus，GBS)，属条件性致病菌。目前，治疗GBS感染，可供选择的药物较多[9]。然而，在特殊情况下，例如发生大规模自然灾害或者爆发战争，因缺少药品仍可能出现GBS 感染的大量爆发，妊娠期妇女生殖泌尿系统感染GBS，可引发胎膜早破、早产、死胎、宫内感染等一系列妊娠并发症，产妇感染GBS可导致产后子宫内膜炎、盆腔炎乃至败血症；新生儿感染GBS可导致肺炎、败血症和脑膜炎。(2)氯仿提取物对大肠埃希氏菌具有良好的杀菌作用，最小杀菌浓度为6.25mg/mL，大肠埃希氏菌是人体肠道内的正常寄殖菌，战时腹部受到外伤后，若肠道破裂或者穿孔可引起肠道大肠埃希菌移位，从而导致腹腔感染，乃至全身性感染，也可因战伤导致机体抵抗力严重下降而感染。第二军医大学第三附属医院资料显示：大肠埃希菌是院内感染病原菌检出率最高的菌种，约占院内感染检出细菌株总数的28.3-34.6％；而在胆道感染中所占的比例更高，检出率在50％以上。近年来，抗生素滥用，导致大肠埃希菌耐药率居高不下，程训民等[12]在124株大肠埃希菌中共检出54 株(43.5％)产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)。现有抗生素常无效，因此亟需开发新型抗生素替代。(3)氯仿和乙酸乙酯提取物均对金黄色葡萄球菌具有良好的杀菌作用，最小杀菌浓度均为12.5mg/mL。金黄色葡萄球菌是开放性外伤最常见的污染细菌，也是战时开放性污染创面的最常见致病细菌。

奇蒿广泛生长于华东、中南和西南地区，原料分布区域广大，取材方便。华东、中南和西南地区分别为南京军区，广州军区和成都军区的辖区。在军事上以上三个地区均面对着极为错综复杂的国际或者国内形势，例如南京和广州军区一方面需要做好对台军事斗争的准备，另一方面需要面对来自日本和东南亚诸国对我国东海及南海的岛屿及海底资源的争夺。而成都军区方面需要面对和藏独势力的长期斗争，同时也要对印度采取防范。因此以上三个军区都存在应对局部战争的可能。在和平时期，以上三个地区均为自然灾害的高发区域，例如：华东及中南地区为洪涝灾害的高发区域，西南地区为地震，泥石流等地质灾害的高发区域，需要应对可能发生的大范围的自然灾害。因此，深入研究奇蒿的抗菌活性成分，开发价廉质优的高效抗生素，既有利于战争和大规模自然灾害发生时，利用其原料分布区域广泛的特点，保障军队和人民群众短期内集中使用抗生素治疗相应细菌感染的需要，也能有效满足平时人民群众一般抗菌治疗的需求。

申请号为201110187502.6，公开号为CN102309533A的中国专利申请一种奇蒿总黄酮的制备方法，该方法主要采用超临界二氧化碳流体萃取法萃取奇蒿粉末，乙醇作为携带剂，萃取物采用大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，减压浓缩，冷冻干燥得到奇蒿总黄酮。其制备方法简单，快捷，无毒。但是该方法是针对奇蒿总黄酮的制备方法，不便于奇蒿单体活性成分的提取制备，因此发明对奇蒿中单体活性成分的制备方法具有重要意义。

本发明人一直致力于对奇蒿进行系统性分离提取,并完成了不同提取物及各极性部位进行的体外抗菌实验,通过体外抗菌实验筛选出奇蒿有效抗菌成分的来源,并完成了抗菌有效单体的分离与鉴定。

发明内容

本发明的另一目的在于提供一种奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸的制备方法。

本发明的目的在于提供一种奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。

奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的制备方法，按照下述步骤进行：

将干燥奇蒿原药材粉碎后浸泡在80％乙醇中,65℃渗漉提取，提取结束后薄膜蒸发,干燥后待用，得80％乙醇提取物干燥粉末；其中奇蒿原药材与80％乙醇的用量比例为1:5kg/L。

取80％乙醇提取物干燥粉末1kg，用6L石油醚浸泡24h过滤，滤渣干燥后用6L乙酸乙酯浸泡24h过滤，滤液浓缩得乙酸乙酯提取物约6.2kg。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱,以石油醚-乙酸乙酯系统以：10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10各配置400ml 以2d/s(滴/秒)梯度洗脱，每隔30min收集一次样品，洗脱时间在23.5h-25.5h内收集得到的第48号到第51号样品为3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)。

在洗脱收集的96个样品中，通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物(部分为胶状物)，所有样品保存在1.5mL的EP管中，Co60灭菌待用。

薄层色谱点样法，参照：孙毓庆,胡育柱.分析化学.北京:科学出版社,2007.467～470。

其中3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的结构式为：

奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸在制备抗菌药物中的应用。

其中所述菌株为无乳链球菌(Streptococusagalactiae，SA)临床型03598276、福氏志贺菌(Shigellaflexneri，SF)临床型03475491、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium， ST)临床型5002324172。

无乳链球菌(Streptococusagalactiae，SA)临床型03598276、福氏志贺菌(Shigella flexneri，SF)临床型03475491、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，ST)临床型 5002324172均来源于长海医院检验科临床分离获得的致病菌株，也可购自中科院药物研究所。

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus,SA)标准型ATCC25923、金黄色葡萄球菌 (staphylococcusaureus,SA)标准型ATCC29213，均购自于温州市康泰生物科技有限公司。

有益效果：

本发明对奇蒿药材粉末采用石油醚，乙酸乙酯，氯仿，正丁醇进行萃取，浓缩后得到各个极性的提取物粉末，通过抗菌活性研究，发现乙酸乙酯和氯仿极性部位活性显著。对乙酸乙酯和氯仿部位通过硅胶柱层析法，采用薄层色谱点样法，抗菌活性实验，得到各活性流分，采用高效液相色谱质谱联用仪(LC-MSTOF)鉴定高纯度流分，并对该单体流分进行MS、1HNMR和13CNMR分析，得到化合物咖啡酸。该方法研究目标明确，操作简单快捷，为中药奇蒿的活性成分追踪研究提供了中药方法。

该实验方案是以前期对奇蒿不同极性段抗菌实验结果为基础，对活性显著的氯仿部位和乙酸乙酯极性部位进行进一步的活性追踪，对活性显著的单体化合物进行结构鉴定，以初步鉴定出奇蒿中抗菌主要活性成分。该实验方法通过硅胶柱色谱对极性部位进行分离，分离方法简单快捷，具有一定的实际操作意义。

附图说明

图1氯仿提取物13号TIC图谱

图2乙酸乙酯提取物51号TIC图谱

图3乙酸乙酯提取物51号在t＝2.532的MS图谱

图4T＝2.532时乙酸乙酯提取物51号的UV图谱

图5咖啡酸对照品的TIC图谱

具体实施方式

现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

以下实施例和对比例中，金黄色葡萄球菌(标准型ATCC25923，购自温州市康泰生物科技有限公司)、金黄色葡萄球菌(标准型ATCC29213，购自温州市康泰生物科技有限公司)、大肠埃希氏菌(标准型ATCC25922，购自温州市康泰生物科技有限公司)、铜绿假单胞菌(标准型ATCC27853，购自温州市康泰生物科技有限公司)、无乳链球菌(Streptococus agalactiae，SA,临床型03598276)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri，SF,临床型 03475491)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium，ST，临床型5002324172)水解络蛋白琼脂(Mueller-Hinton,M-H)培养基,M-H培养液(型号CMO337,购自英国 OXOID)。无乳链球菌(临床型)、福氏志贺菌(临床型)、鼠伤寒沙门菌(临床型)均来源于长海医院检验科临床分离获得的致病菌株，也可购自中科院药物研究所。

实施例1：奇蒿提取物3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)的制备方法

40kg干燥奇蒿原药材(购自于亳州市中药材饮片公司，产地：浙江临安，又名产南刘寄奴),粉碎后浸泡在80％乙醇中,65℃渗漉提取,先后使用80％乙醇200L,提取结束后薄膜蒸发,干燥后待用。

取80％乙醇提取物干燥粉末约1kg,用6L石油醚浸泡24h过滤，滤渣干燥后用6L乙酸乙酯浸泡24h过滤,滤液浓缩得乙酸乙酯提取物6.2kg。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱,以石油醚-乙酸乙酯系统以：10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10各配置400ml 以2d/s(滴/秒)梯度洗脱，每隔30min收集一次样品，共得96个样品。通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物(部分为胶状物)，乙酸乙酯提取物通过合并得26个样品(见表 1)，保存在1.5mL的EP管中，Co60灭菌待用。经鉴定，洗脱时间在23.5h-25.5h内收集的第48号到第51样品为3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)。

对比例奇蒿氯仿,乙酸乙酯提取物

40kg干燥奇蒿原药材,粉碎后浸泡在80％乙醇中,65℃渗漉提取,先后使用80％乙醇200L,提取结束后薄膜蒸发,干燥后待用。取80％乙醇提取物干燥粉末约1kg,用6L 石油醚浸泡24h过滤，滤液浓缩并干燥后得到石油醚提取物。滤渣干燥后以6L氯仿浸泡 24h过滤,滤液减压蒸馏,浓缩得氯仿提取物约560g。滤渣干燥后用6L乙酸乙酯浸泡24h 过滤,滤液浓缩得乙酸乙酯提取物6.2kg。氯仿粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱,采用不同浓度的甲醇-氯仿溶液：10:1-5:1-2:1-1:1-1:2-1:5-1:10各配置400ml以2d/s(滴/秒)梯度洗脱,每隔30min收集一次样品，共的81个样品。乙酸乙酯粗提物用甲醇溶解后上硅胶柱,以不同浓度的石油醚-乙酸乙酯溶液：10:1-5:1-2:1-1:1-1:2-1:5-1:10各配置400ml以2d/s(滴 /秒)梯度洗脱,每隔30min收集一次样品，共得96个样品。通过薄层色谱点样法将含同种物质的样品混合，混合后的样品通过旋转蒸发仪浓缩成提取液再通过真空离心蒸发浓缩器制成干粉状物(部分为胶状物)。

氯仿提取物共得到81个组份，合并组份编号分别16-20组份同时合并到组分21中，22-24 合并到25中，26合并入27中，28-30合并入31中，32-34合并入35中，36合并入37中， 38-40合并入41中，42-44合并入45中，46-47合并到48中，49-61合并入62中，63-68 合并入69中，70-78以及80-81组份均合并入79中，合并后共计得到26个样品。乙酸乙酯提取物共得到96个组份，合并组份编号分别为2-3合并入4中，5-6合并入7中，9-10 合并入11中，12-17合并18中，19-17合并入28中，29合并30中，31合并入32中，33-37 合并入38中，39-45合并入46中，48-50合并入51中，52-56合并入57中，58-62合并入 63中，64合并入65中，67合并入68中，69合并入70中，73-74合并75中，76-79合并入80中，81合并入82中，83-85合并入86中，87-91以及93-96组分均合并入92中，合并后共计得到26个样品。(见表1)。所有样品保存在1.5mL的EP管中，Co60灭菌待用。

表1氯仿和乙酸乙酯提取物样品编号

样品编号氯仿提取物 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11,12,13,14,15,21,25,27,31,35,37,41,45,48,62,69,79 乙酸乙酯提取物 1,4,7,8,11,18,28,30,32,38,46,47,51,57,63,65,66,68,70,71,72,75,80,82,86,92

分离接收得到的样品经薄层点样法，Rf值相同的成分合并，氯仿极性部分和乙酸乙酯极性部位合并分离组分均得到26个样品组分。

其中合并乙酸乙酯提取物后的51号样品即为实施例3所得3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)。

试验例1：

体外抗菌实验

1.纸片扩散法实验及结果

分别取奇蒿氯仿提取物及乙酸乙酯提取物各个样本10mg,溶解时分别加入助溶剂羧甲基纤维素钠1mg,采用灭菌蒸馏水溶解,加至1ml配制成浓度为1％的药液。首先将加有50 μl原始浓度药液(10mg/ml)的圆纸片放在含标准量细菌接种物的M-H琼脂板上(无乳链球菌需要加入血液培养),35℃培养18h,根据药敏纸片周围显出的抑菌圈大小来判断抗菌作用的强弱,将纸片扩散法中证实抑菌圈在9mm(包括9mm,纸片直径6mm)以上的抗菌样品筛出.通过此法初步筛选对细菌敏感的样本,以待进一步测定最小杀菌浓度(MBC)。

纸片扩散法实验结果如下：

氯仿提取物的各个样本和菌株配比均进行了3次实验以取平均值获得结果,结果详见表2。

表2氯仿提取物纸片扩散法抑菌试验结果

1)纸片直径为6mm,2)抑菌圈直径为9mm

乙酸乙酯提取物的各个样本和菌株配比均进行了3次实验以取平均值获得结果,结果详见表3。

表3乙酸乙酯提取物纸片扩散法抑菌试验结果

1)纸片直径为6mm,2)抑菌圈直径为9mm

通过纸片扩散法的得到的敏感细菌谱(抑菌圈直径≥9mm)见表4:

表4纸片扩散法敏感细菌谱

2.常量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC[8]) 和最小杀菌浓度(minimalbactericidalconcentration,MBC[9])

常量肉汤稀释法实验步骤：

纸片扩散法实验中抑菌圈直径≥9mm的配对进一步测定最小杀菌浓度,每一个配对同时进行3组实验取平均值。用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白(MH)肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2×108CFU/ml。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶ 100稀释后备用。稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管9支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液(如 10mg/ml)0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第7管，并从第7管中吸取1ml弃去，第8管为阳性对照组不含药物的生长对照,第9管为阴性对照管无菌生长。此时各管药物浓度依次为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、 0.03125μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为 5×105CFU/ml。第1管至第7管药物浓度分别为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、 0.01562μg/ml。将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16～20h。将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放37℃培养箱中，培养48h,观察结果。当阳性对照管有菌生长(浑浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，试验组以肉眼观察无菌生长的药液最高稀释度为MIC。从无菌生长的各管内取100μl，分别加入琼脂平板，放37℃培养箱中，培养48h,观察细菌生长情况，无菌落形成的药液最小浓度为MBC[9]。MIC的结果见表5，MBC的结果见表6.

表5奇蒿不同提取物常量肉汤稀释法MIC试验结果

表6奇蒿不同提取物常量肉汤稀释法MBC试验结果

3.对有抑菌作用的样品进行称重以得到奇蒿中总有效抑菌物质的含量见表7.

表7奇蒿中有抑菌效果的样品的称重结果

抗菌有效单体的鉴定

1.LC/MSDTOF[10]液相色谱/质谱联用仪(飞行时间质谱)的检测

(1)液相色谱条件

色谱柱：资生堂TYPEMG(3.0×100mm，3.0μm)；流动相:纯水：甲醇＝90:10；进样量：5μL；流速：0.6mL/min；柱温：25℃；检测波长235nm；运行时间16min。

(2)SingleQuadrupole-MS条件

采用ESI离子源，负离子模式下(ESI-)：柱后分流比为2:1，干燥器温度：350℃；毛细管电压：4000V；干燥器流速：9.0L/min；雾化器压力：35psig；裂解气电压：200V。

(3)TIC(总离子流色谱图)检测

下面是一些样品的TIC图谱:(见图1-图2)

(4)TIC下点数据MS图谱检测

通过分析各样品的TIC图谱可以得出乙酸乙酯提取物51号杂质较少，基本为纯品可做进一步分析。

乙酸乙酯提取物51号主峰(T＝2.532)的质谱图谱见图4，可以得出乙酸乙酯提取物51 号的主要离子峰为179.0341，tR＝2.532.因为是负离子模式，主要形成[M-H]–的离子峰，故此物质的M＝179.0341+1.0078＝180.0419，(见图3)。

2.通过分析物质的理化性质结合质谱,UV光谱结果推测化合物分子式及结构式乙酸乙酯提取物51号:

物理性质：黄色结晶(在浓水溶液中),从稀水溶液得一水合物。分解点223～225°(在194° 软化)；微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。

化学性质：化合物在TCL板上与FeCl3-K3Fe(CN)6反应呈兰色,表示为酚类；HCl-Mg粉反应呈阴性表明为非黄酮类化合物；

UV光谱：T＝2.532以甲醇为溶剂λmax:200nm；244nm(见图4).带λ(200)表明此化合物有苯环的结构，带λ(244)表明此化合物有的结构。

MS图谱：T＝2.532下的质谱图显示离子峰为179.0341.因为是负离子模式，主要形成[M-H] –的离子峰[11]，故M＝179.0341+1.0078＝180.0419；

结合以上性质可推测化合物分子式为C9H8O4通过分析分子式为C9H8O4的酚类化合物,可推测化合物为3,4-二羟基肉桂酸(咖啡酸)。

其结构式为：

3.通过与对照品的TIC图谱比对以确定有效抗菌物质成分

乙酸乙酯提取物51号TIC图谱(见图2)与对照品咖啡酸TIC图谱(见图5)比对可确定乙酸乙酯提取物51号中的主要成分为咖啡酸。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。